恶性间皮瘤的分子病理学诊断摘要：弥漫性恶性间皮瘤(DMM)的诊断可能是病理医师在日常工作中遇到的最大挑战之一，迄今为止，通过形态学、组织化学、免疫组化及电镜检查等一系列的检测方法，均无法使DMM的诊断准确率达到100％。
近期《诊断病理学杂志》连续刊文对DMM的病理诊断及免疫组化诊断进行了讨论。
本文拟从分子诊断的层面介绍分子技术及其在DMM诊断及鉴别诊断中的应用，以期加深对DMM这一特殊肿瘤的认识，为全面了解DMM的病理现状及其新进展起到推动作用。
弥漫性恶性间皮瘤(diffuse malignant mesothelioma，DMM)是一种具有多种组织学特征的肿瘤，这些特征与大量的肿瘤性及非肿瘤性病变极为相似，这就决定了DMM的形态学谱需要与许多病变进行鉴别诊断。
大量的研究证明，当今的分子技术在软组织肿瘤诊断上起着重要作用，但迄今为止，通过形态学结合组织化学、免疫组化和电子显微镜检查等一系列补充手段，均无法使DMM的诊断准确率达到100％。
这就促使研究人员去研究发现与DMM特异性诊断相关的分子标记物。
本文拟对分子分析技术及其在DMM诊断与鉴别诊断方面的应用进行介绍，作为对近期《诊断病理学杂志》关于“恶性间皮瘤病理诊断”及“恶性间皮瘤的免疫组化诊断”两篇文章的呼应与补充，以期加深对DMM这一特殊肿瘤的认识。
1.DMM分子诊断技术及相关分子异常1.1染色体组型技术DMM通常都有克隆性染色体组型异常，多数病例存在1，3，6，9，22号染色体的缺失或获得，其中以CDKN2A位点上9p21缺失最为多见。
无论是上皮样型、双相型、肉瘤样型DMM均可见到这些分子改变。
1.2比较基因组杂交(comparative genomic hybridization,CGH)CGH以及基于阵列的CGH侧重评估染色体DNA平衡情况，虽然迄今尚未发现DMM特异的染色体异常，但多个研究都发现DMM中存在持续的染色体获得和缺失异常，这些分子改变及其可能累及的基因见表1。
Taniguehi等采用基于阵列CGH技术在胸膜DMM中鉴定出了1p32.1和11q.22上存在2个频发性获得区域。
而引人注目的染色体缺失区域还有3p21、4q、6q、9p、10p、13q、14q和22q等。
这些区域包含有与DMM特别相关的抑癌基因，还包括神经纤维瘤病2型基因(NF2基因)、p16INK4、p14ARF和p15等。
1p32.1区域对应于c-jun基因(AP-1基因的一部分)，而11q.22包括IAP2和IAP3两部分(凋亡抑制分子)。
IAP2和IAP3基因获得区域的检出，是DMM发病机制研究中极为关键的发现。
1.3杂合性缺失(loss of heterozygosity，LOH)9p21染色体位点的常见基因缺失区域囊括了3个重要的抑癌基因p16INK4、p15和p14ARF。
LOH的研究发现，多数DMM中存在CDKN2A基因纯合性缺失，最常见的为CDKN2A(P16INK4a)和CDKN2B(P15INK4b)位点上的9p21缺失，同时亦频繁出现CDKN2A(P14ARF)丢失。
CDKN2A为抑癌基因，编码细胞周期依赖型激酶抑制蛋白，调控G1/S期Wilms肿瘤信号通路和细胞周期，与肿瘤恶性转化相关。
据报道，几乎所有DMM来源的细胞系均存在P16INK4基因的丢失，特别是肉瘤样型DMM该基因丢失率达100％。
此外，腹膜高分化乳头状间皮瘤可出现NF2基因位点22q11.1，22q12.1和22q13.3缺失。
1.4荧光原位杂交(FISH)应用FISH方法和着丝粒探针对经甲醛固定、石蜡包埋的胸膜DMM标本进行染色体异常检测，同样可发现染色体异常。
Dacic等采用FISH方法评估48例胸膜DMM病灶中p16基因的缺失情况，发现大多数病例有p16基因纯合性丢失。
Kobayshi等分别采用免疫组化和FISH方法检测了30例日本患者胸膜DMM组织p16蛋白和基因的表达水平，其中24例(80％)显示p16蛋白表达缺失，21例存在p16基因纯合缺失。
以上两项研究都发现，p16基因缺失的DMM患者预后更差。
根据分子细胞遗传学、FISH、CGH或其他分子分析技术研究结果发现，不同组织学亚型的DMM之间并无密切相关性。
提示DMM存在染色体异常的复杂性和异质性，支持DMM起因于大量获得性遗传学事件的累积作用，从而导致多种抑癌基因失活的观点。
2.DMM相关分子异常在肿瘤鉴别诊断中的应用2.1肺腺癌上皮样型DMM与肺腺癌的鉴别是胸膜标本中最常遇到的难题，但迄今为止尚缺乏特异性分子标记物以明确区分这两类肿瘤。
免疫组化是有效的鉴别方法之一。
如前所述，CGH也可作为鉴别手段，DMM常有4q、6q和14q缺失，而肺腺癌中获得要比缺失多见，特别是1q、5p、6p、7p、8q的获得。
但有作者认为，这些获得与缺失没有特异性，不能以CGH结果作为鉴别这两种肿瘤的行之有效方法。
据报道X、1p、10q、18q获得与8q高水平扩增仅见于腺癌，而10q和18q缺失仅见于DMM，这一发现对诊断具有应用价值，但仍需进一步证实。
在肺癌分子诊断研究方面，目前有两种方法可能确定非小细胞肺癌(NSCLC)。
一种是基因表达谱分析，系采用高密度寡核苷酸阵列与1668个基因标记物探针来识别15种不同的NSCLC组织类型，其诊断的特异性为89％，敏感性为99％，缺点是检测费用较高。
另一种是以qRT-PCR为基础的肺癌分子检测试剂盒，该检测为92个基因芯片，可以区分32种肺癌组织学类型。
其原理是将1个大的微阵列数据库转换为适合临床检测的RT-PCR数据，其诊断准确率可达到87％。
这两种方法都有助于肺腺癌与DMM的鉴别。
2.2反应性间皮增生与肿瘤性间皮增生反应性间皮细胞增生与DMM的鉴别很困难，特别是穿刺活检小标本。
分子分析在诊断方面具有潜在应用价值。
根据DMM存在高频率的p16/CDKN2A纯合性缺失，采用FISH方法进行p16/CDKN2A 缺失检测是确定DMM诊断的重要指标之一，尤其是在穿刺标本材料有限，且又缺乏浸润依据的情况下。
另外，还可以通过FISH进行细胞学标本或组织标本9p21位点缺失检测来辅助DMM的诊断。
Illei等发现，在细胞学确定为恶性间皮瘤的患者标本中，85.7％(6/7)检出纯合性p16/CDKN2A缺失；细胞学为可疑恶性间皮瘤的患者标本中，100％(6/6)检出纯合性p16/CDKN2A缺失；而19例细胞学阴性标本中均未检出p16/CDKN2A缺失。
值得一提的是，免疫组化标记物可以很容易明确间皮细胞来源。
其中以EMA、p53联合desmin检测对两者的鉴别诊断最有帮助。
EMA、p53优先表达于肿瘤性间皮细胞，而desmin优先表达于反应性间皮细胞。
此外，葡萄糖转运蛋白-1(glucose transporter protein-1，Glut-1)对间皮增生或纤维性胸膜炎与DMM的鉴别亦非常有帮助。
Husain等采用Glut-l抗体对一组DMM和反应性间皮增生病例进行了研究，结果发现60例良性胸膜病变(31例间皮增生，29例纤维性胸膜炎)均为阴性，而78例DMM中45例(58％)Glut 1抗体呈阳性。
2.3滑膜肉瘤滑膜肉瘤偶尔也可发生于胸膜、心包膜或腹膜，与DMM在诊断上易于混淆。
滑膜肉瘤也可分为单相和双相型、梭形细胞型、上皮样型、未分化型等诸多亚型。
由于间皮瘤标记物calretinin在滑膜肉瘤中也可呈阳性，目前免疫组化方法对这两种肿瘤的诊断存在局限性。
t(x；18)(p11.2；q11.2)易位可引起18号染色体上SSXT基因(又称SYT基因)和相邻的SSX1或SSX2基因发生融合。
无论是单相型还是双相型，>90％的滑膜肉瘤存在x：18染色体易位。
分子诊断可作为滑膜肉瘤诊断的必备手段之一，FISH以及RT-PCR方法均可用于新鲜组织或石蜡包埋组织的t(X；18)易位分析。
SSXT-SSX1基因融合多见于双相型滑膜肉瘤，与肿瘤细胞高增殖活性及预后不良相关；而SSXT-SSX2基因融合多见于单相型滑膜肉瘤。
在DMM未见有这种易位的报道。
此外，多数滑膜肉瘤为局部肿瘤，而DMM多为弥漫性肿瘤，这点对鉴别诊断亦非常重要。
2.4促纤维增生性小圆细胞肿瘤促纤维增生性小圆细胞肿瘤(desmoplastic small round cell tumor，DSRCT)起源于组织来源未定的间充质干细胞，特点为小而低分化的肿瘤细胞散布于大量促纤维增生组织中并呈多向分化。
胸膜、腹膜为DSRCT常见的好发部位。
DSRCT存在特异性基因t(11；22)(p13；q12)易位。
通过检测尤文肉瘤基因EWS和WT-1融合可以确诊并与MM相鉴别。
2.5原始神经外胚层肿瘤大多数尤文肉瘤和原始神经外胚层肿瘤(primitive neuroectodermaltumor，PNET)存在特异t(11；22)(q24；q12)易位，通过检测Fli-1基因和EWS基因融合可确诊。
免疫组化检测Fli-1蛋白亦有一定帮助，Fli-1蛋白特异性较CD99更强，多数PNET存在Fli-1蛋白核表达。
2.6透明细胞肉瘤透明细胞肉瘤又称为软组织恶性黑色素瘤，已有文献报道过胸膜假性间皮瘤样透明细胞肉瘤。
采用细胞遗传学分析有助于与其他肿瘤的鉴别。
约75％的透明细胞肉瘤存在t(12；22)(q13；q12)易位，通过检测ATF基因与EWS基因融合可加以确认。
迄今尚未见DMM有该易位的相关报道。
3.总结与展望分子诊断在软组织肿瘤的诊断中发挥着重要作用。
然而，DMM 缺乏特异的分子异常改变，如果能找到特异性分子异常改变显然有助于DMM的诊断，特别是疑难病例的诊断，但迄今为止的研究结果还不令人满意。
分子诊断最大的作用是能够对酷似DMM的其他肿瘤做出确定诊断，如滑膜肉瘤、DSRCT和PNET等，其次是分子检测或多或少会对肿瘤细胞学或穿刺小标本的诊断起到一定的辅助作用。
某些分子异常的检测还有助于判断DMM的预后。
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