免疫层析试验教学内容

胶体金免疫层析法实验报告胶体金免疫层析法实验报告胶体金免疫层析法是一种常用的生物化学实验技术，广泛应用于生物医学研究、临床诊断和药物研发等领域。

本实验旨在通过胶体金免疫层析法检测目标蛋白质的存在与浓度。

1. 实验原理胶体金免疫层析法基于抗原与抗体的特异性结合原理，利用胶体金颗粒的特殊性质进行检测。

胶体金颗粒具有较大的比表面积和表面增强效应，能够与抗体发生特异性结合。

当抗原与抗体结合形成免疫复合物时，会导致胶体金颗粒的聚集或分散，从而产生可见的颜色变化。

2. 实验步骤2.1 样品制备：将待检测的目标蛋白质样品进行提取和纯化，获取高纯度的目标蛋白质溶液。

2.2 胶体金标记：将胶体金颗粒与特异性抗体进行结合，形成胶体金-抗体复合物。

这一步需要注意控制反应条件，使得胶体金颗粒均匀分散，避免团聚。

2.3 免疫层析：将样品和胶体金-抗体复合物混合，使其发生特异性结合。

然后将混合物加载到层析柱中，通过重力或离心作用，将未结合的物质流出。

2.4 结果分析：观察层析柱中的颜色变化，根据颜色深浅判断目标蛋白质的存在与浓度。

3. 实验结果实验结果显示，当目标蛋白质存在于样品中时，胶体金颗粒会与其特异性抗体结合，导致胶体金颗粒聚集，层析柱呈现深色。

而当目标蛋白质不存在或浓度较低时，胶体金颗粒不会聚集，层析柱呈现浅色或无色。

4. 实验优势与应用胶体金免疫层析法具有以下几个优势：4.1 灵敏度高：胶体金颗粒具有较大的比表面积和表面增强效应，能够增强目标物的检测信号，提高灵敏度。

4.2 特异性强：通过特异性抗体与目标蛋白质结合，可以准确检测目标物，避免干扰物的干扰。

4.3 操作简便：实验步骤简单，无需复杂的仪器设备，适用于实验室和临床现场。

4.4 多样性应用：胶体金免疫层析法可用于检测血清中的生物标志物、药物残留、病原微生物等，广泛应用于临床诊断、食品安全和环境监测等领域。

5. 实验注意事项5.1 样品处理：样品的提取和纯化过程需要严格控制，以避免杂质的干扰。

免疫层析法操作指南《免疫层析法操作指南》嗨，朋友！今天我来给你讲讲免疫层析法的操作。

我还记得我刚接触这玩意儿的时候，那真是一头雾水，走了不少弯路呢。

现在我把我的经验都分享给你，希望能对你有点帮助。

一、基本注意事项首先呢，在开始操作之前，你得把要用的东西都准备好。

试剂盒应该放在一个干燥、阴凉的地方保存，可别把它放在太阳直晒或者很潮湿的地方，就像你不能把面包放在潮湿的角落一样，会坏掉的。

还有啊，你的操作台面要干净整洁，别乱七八糟的堆满了东西，这就好比你做饭得有个干净的厨房才行。

在使用试剂盒的时候，一定要检查保质期。

我一开始就是没注意这个，结果差点用了过期的，还好及时发现了。

记住了，这点很关键！如果试剂盒过期了，那测出来的结果可是不准的。

二、实用建议在进行操作的时候，取样这个步骤很重要。

如果是取液体样本，要尽量保持均匀。

我有个诀窍，在取之前轻轻晃一晃样本瓶，但也别太用力了，不然可能会产生气泡。

气泡这东西可麻烦了，就像不速之客，会影响检测结果的。

加样的时候，要严格按照说明书上的量来，一滴都不能多也不能少。

就像做菜放盐一样，放多放少味道就不对了。

这里一定要当心啊。

三、容易忽视的点大家往往会忽视的一点是操作的环境温度。

不同的免疫层析法试剂盒可能对温度有一些要求，如果温度不合适，也可能影响结果。

我之前做的时候，在一个很冷的屋子里，结果就有点不对劲，后来把温度调整好了就正常了。

不过你得看看试剂盒的说明书，每个可能不太一样。

还有就是操作的连贯性，不要做做停停的，要一气呵成。

四、特殊情况如果在检测过程中出现了一些奇怪的现象，比如说显色异常之类的，先别慌。

我给你说一下我的经历，有一次我检测的时候，显色比正常的要浅很多，当时吓了我一跳。

后来发现是因为加样之后等待的时间没有掌握好。

这个时候你可以重新检测一次，但要细心检查每个环节有没有出错的地方。

还有一种特殊情况就是样本可能受到了污染。

如果样本本身质量不好，那肯定会影响结果的。

实验二十三斑点免疫层析试验(Dot immunogold chromatographic assay)斑点金免疫层析试验是将胶体金标记技术和蛋白质层析技术相结合的以硝酸纤维素膜为载体的快速的固相膜免疫分析技术。

本法除层析条装置外，不需任何仪器设备。

本实验以双抗体夹心法测定HBsAg为例。

【实验原理】金标抗HBsAg抗体(兔型)干片粘贴在近下端，抗HBsAg单克隆抗体(鼠型)羊抗兔IgG抗体分别包被在NC膜的测试区和质控区。

测试时，试纸条下端浸入血清样品中或滴加血清样品，通过层析作用，上端移动，流经干片时将金标抗HBsAg抗体复溶，若待检血清中含HBsAg，即形成金标抗HBsAg-HBsAg复合物，移至测试区时，形成金标抗HBsAg-HBsAg-抗HBsAg复合物，金标抗HBsAg 被固定下来显示红色线条，呈阳性反应，多余的金标抗HBsAg抗体移至质控区被羊抗兔免疫球蛋白抗体捕获，呈现红色质控线条。

【主要试剂与器材】1.胶体金层析条所用试剂全部为干试剂被组合在该层析条上，有商品供应。

2.样品待检血清和HBsAg阳性质控血清【操作方法】1.将试剂条标记线一端浸入待检样品中2～5秒或在样品加样处加一定量待检样品，平放于水平桌面上。

2.室温下5～15min，目测观察结果。

【结果判断】结果判断见图23-1。

HBsAg阳性(+)：两条紫红色条带出现，样品中含有乙肝表面抗原。

HBsAg阴性(-)：仅质控区(C)出现一条紫红色条带，样品中检测不出乙肝表面抗原。

试剂条无效：质控区(C)未出现紫红色条带，表明不正确的操作过程或试剂盒已变质失效。

图23-1 斑点免疫层析试验结果判断示意图【注意事项】1.打开试剂条包装后应在1h内应使用。

2.将试剂条插入血清/血浆样品中，血清/血浆样品液面不能超过试剂条的标记线。

3.若发现试剂条无效，应再次仔细阅读说明书，并用新的试剂盒重新测试。

如果问题仍然存在，应立即停止使用此批号产品。

免疫层析试验以双抗体夹心法测尿hCG 为例来介绍免疫层析试验的方法。

[目的](1) 掌握免疫层析试验的原理。

(2) 熟悉双抗体夹心法测尿hCG 的方法、结果判定及应用。

[原理]抗hCG 免疫金复合物干片粘贴在试剂条近下端G区(图1- 17)，抗hCG 单克隆抗体和小鼠IgG 抗体分别固化于NC 膜的测试区(T区) 和质控参照区(C 区)。

当试纸条下端(A区) 浸入液体标本中，吸水材料即吸取液体，通过层析作用，液体向B 端移动，流经干片时，使抗hCG免疫金复合物复溶，并带动其向膜条渗移。

若标本中有hCG，可与抗hCG 免疫金复合物结合。

此抗原体复合物流至T 区时即被固相抗hCG 单克隆抗体所获，形成金标抗体一抗原一抗体复合物，在T 区显现出红色反应线条。

过剩的免疫金复合物继续前行，至C 区被固相抗小鼠IgG 捕获，呈现出红色质控线条。

[材料](1) “一步金”法早早孕妊娠诊断试纸条(有商品供应)。

(2) 孕妇尿液，待测尿液。

(3) 尿液收集杯等。

[方法](1) 将试剂条及待测标本置室温一定时间以充分复温。

(2) 从原包装铝箔袋中取出试剂条，将试剂条按箭头方向插人尿液标本中。

注意: 尿液液面不能超过试剂条的标记线。

(3) 约5 S 后取出放于干净平整的台面上观察，3 min 时读取结果，10 min 后判定无效。

在戏迟出死~条心线待技床样无h(G(阴临)[结果判断]1.阴性试剂条上仅质控区出现条紫红色线，在测试区内无紫红色线出现(图1- 18a)。

2.阳性试剂条上出现两条紫红色线，一条位于测试区内，另一条位于质控区内(图1-18b)。

3.弱阳性试剂条测试区的线条颜色明显浅于质控区内的紫红色线，表明可疑，2 d 后应重新测试，以免漏诊(图1- 18c)。

4.无效试剂条上无任何线条出现，或仅出现测试区线条而质控区未出现，表明操作过程不正确或试剂条已变质失效。

如有侵权请联系告知删除，感谢你们的配合！。

实验四实验名称：免疫印迹法测定风湿病自身抗体实验目的与要求：掌握测定血清中风湿病自身抗体的实验原理，操作步骤，熟悉测定结果的临床意义。

实验仪器、试剂：离心机，37℃温箱，试管、免疫印迹法测定风湿病自身抗体试剂盒实验原理：待测血清与印迹膜上的ENA反应，如血清中有自身抗体，则与膜上的抗原结合，再加上酶联免疫二抗及显色试剂，就会在抗原抗体结合位置出现显色区带，与标准谱带对照即知所含抗体。

操作方法：1、将25ml试剂应用液用蒸馏水稀释至500ml。

2、在反应槽中加洗涤液1ml，血清10μl,37℃温育30分钟。

3、弃去槽内的液体，滤纸吸干，加洗涤液1ml，摇动洗涤1分钟弃液，反复4次。

4、槽内加洗涤液0.5ml，酶试剂10μl, 37℃温育30分钟后洗涤，同步骤35、槽内加显色剂A0.5ml，显色剂B0.5ml，震荡5分钟显色6、待显色清晰后加终止液0.5ml，震摇2分钟后弃液，自来水冲洗，取出膜条，待干，与标准对照。

实验现象与数据：记录自身抗体的类型及可能的相关疾病结果分析与结论：分子量（单位KD）相应抗体相应疾病29/28 13.5 抗Sm抗体SLE标记抗体73 32 17.5 抗U1RNP抗体混合性结缔组织病38 16.5 15 抗Rib抗体SLE标记抗体52 抗ssA抗体干燥综合症48/47 45 抗ssB抗体干燥综合症86 70 抗Scl-70抗体PSS标记抗体55 抗Jo-I抗体PM/DM60 抗Ro60抗体干燥综合症、类风湿性关节炎实验五实验名称：斑点免疫层析实验实验目的与要求：掌握斑点免疫层析测定的实验原理。

实验仪器、试剂：待检尿，“早早孕”试纸条实验原理：当试纸条下端浸入液体标本时，下端吸水材料即吸取液体向上移动，流经干片时使免疫金复合物复溶，并带动其向膜条渗移，如标本中有抗原存在，可与抗体免疫金复合物结合，此复合物流至测试区时即被固相抗体所获，形成红色反应条，多余的免疫金复合物继续前行，至质控参照区与固相二抗结合，呈现出红色质控线。

免疫层析法免疫层析法（immuno－affinitychromatography），是一种利用特殊的抗体-抗原结合的生物物理方法，它可被用来分离和纯化多种有机结构上相似的复杂混合物。

这种方法源于实验室分子反应中使用抗体来选择性捕获具有特定抗原性质的分子，经过几十年的发展，在今天已被广泛应用于生物分离、纯化以及生物工程领域等。

免疫层析法通常由抗原与抗体结合反应、抗原-抗体复合物吸附到层析塔上以及抗原-抗体复合物从层析塔上分离等几个步骤组成。

首先，抗原与抗体进行反应，抗原分子与抗体结合催化生成抗原-抗体复合物，然后将结合后的复合物吸附在层析塔上，该复合物可因为其标志性抗原而与其他物质形成分离层，最后采用不同的溶剂从层析塔中收集抗原-抗体复合物，从而达到分离和纯化的目的。

免疫层析法的特殊优势在于其可以分离分子结构相似、非特异性蛋白或相似的复杂混合物，这一特点使得它可以用于采集和深入研究特定蛋白的生物功能、生物学功能及健康关系，并且在众多研究领域都得到了广泛的应用，如分离具有特异性的表达蛋白、抗原结构研究、蛋白质、小分子抑制剂研究等。

另外，免疫层析法不但适用于高效提取和纯化特定蛋白质，而且可以利用于治疗某些疾病的治疗方法。

例如，对于乙型肝炎的潜伏期患者，可以使用免疫层析法快速和高效地纯化抗乙型肝炎精子，从而为乙型肝炎潜伏期患者提供治疗。

带有抗原-抗体复合物的免疫层析法可以成功地实现抗原分离，并具有选择性、特异性以及高效率等优点，因此，它在分子生物学、生物技术、分离纯化以及生物制品研究领域都被广泛应用。

然而，由于免疫层析法需要事先获得合适的抗原-抗体复合物，因此，在实际分离研究过程中，可能需要花费大量的时间和金钱来生产和维护抗体，以确保分离效率的高度可控性。

总的来说，免疫层析法具有众多优点，它可以成功地实现抗原分离和纯化，在众多研究领域都得到了广泛的应用，但是也存在一些限制和问题，一定程度上影响了其在实际应用中的灵活性和适用性。

胶体金法免疫层析法胶体金法免疫层析法是一种现代生物医学研究中常用的实验技术，它具有简单、快速、灵敏和特异性高的特点。

下面将详细介绍这一技术的原理、实验步骤以及在医学研究中的应用。

胶体金法免疫层析法原理简单易懂，利用胶体金颗粒的特殊性质与生物分子相互作用，实现对特定生物分子的检测。

胶体金颗粒表面覆有一层稳定的染色剂，当与目标生物分子结合后，会发生凝集现象，形成可见的颜色变化。

这种颜色变化与样品中目标分子的含量成正比，从而可以定量检测目标物质的浓度。

这种特性使得胶体金法免疫层析法成为医学研究中常用的无标记检测技术。

在实验中，胶体金法免疫层析法通常包含以下步骤：制备胶体金溶液、制备抗体与胶体金的复合物、准备免疫层析纸条和进行样品检测。

首先，制备胶体金溶液是实验的关键步骤之一。

胶体金溶液是由金纳米颗粒悬浮于溶液中形成的，具有特定的粒径和稳定性。

制备胶体金溶液需要精确控制金纳米颗粒的粒径和浓度，遵循特定的实验条件。

接下来，制备抗体与胶体金的复合物。

这一步骤是为了将目标分子的抗体与胶体金颗粒结合，形成一种稳定的复合物。

复合物的制备需要考虑抗体的浓度、胶体金的浓度以及反应时间等参数，以保证复合物的稳定性和活性。

准备免疫层析纸条是实验中的重要步骤之一。

免疫层析纸条是一种特殊的纸条，具有高吸附性和分离性。

在纸条上，可以固定目标分子的抗体，并与胶体金复合物相互作用。

纸条的制备需要准备特定尺寸的纸条，将抗体吸附于纸条上，并进行固定，确保纸条的功能和稳定性。

最后，进行样品检测。

将待测样品滴加在准备好的免疫层析纸条上，允许样品与固定的抗体发生反应。

当样品中存在目标分子时，胶体金和目标分子的抗体会结合并形成可见的颜色变化。

利用专业的检测设备或者目视检测，可以定量检测样品中目标分子的含量。

胶体金法免疫层析法在医学研究中具有广泛的应用。

例如，它可以用于检测临床样品中的蛋白质标记物，如肿瘤标志物，用于早期癌症的诊断和监测。

此外，该技术还可以用于检测传染病病原体，如流感病毒和结核杆菌，为疾病的诊断和流行病学调查提供重要的信息。

免疫层析法免疫层析法是一种分子生物学技术，用于检测和鉴定有机物质的结构、物性和功能，其原理是利用生物体中的免疫反应物质（抗体）对有机物质的特异性结合作用来识别和结构分析某种有机物质。

通常情况下，免疫层析法有抗原层析、抗体层析和抗原-抗体双层析三种形式。

抗原层析是指将有机物质加入抗体溶液中，通过特异性结合作用将其抗原与抗体结合，而使其抗体溶液中抗体与抗原结合形成免疫复合物，最终在层析过程中，抗原-抗体复合物将在离心力的作用下离心到检测杯的底部形成一层块状的膜层。

抗体层析是指，将抗体加入抗原溶液中，当抗原与抗体结合时，抗体溶液中抗原将与抗体结合形成抗原-抗体复合物，最终在离心力的作用下将复合物离心至检测杯底部形成一层块状的膜层。

抗原-抗体双层析是指将抗原和抗体同时加入溶液中，当抗原与抗体结合时，溶液中抗原与抗体结合形成抗原-抗体双层复合物，复合物最终将在离心力的作用下离心到检测杯的底部形成一层块状的膜层。

免疫层析法的原理极其复杂，它结合了化学、生物学等多种学科，利用高度特异性的可逆结合作用，精确测定某种物质的结构、物性和功能。

它的用途非常多，可用于生物医学领域，如病原体检测、发现新药物、环境污染检测等。

它也可用于工业检测，识别和监测某种物质的含量，以探索物质的结构和特征、研究新产品的性能等。

此外，免疫层析法具有灵敏度高、可重复性强、体积小等特点，且简便快捷、易于操作。

由于该方法的众多优势，如今已经成为分子生物学实验中最常用的一种技术，在药物研发、病原检测、蛋白质组学、基因表达定量研究等方面发挥着重要作用。

然而，由于免疫层析法受环境因素影响较大，抗原-抗体结合受抗体活性和抗原浓度限制，实验结果非常容易受到影响。

因此，在实验前应考虑加以控制，分析时应对抗体活性进行测定和校正，以确保实验的可靠性和准确性。

就目前而言，免疫层析法在药物研发、病原检测、蛋白质组学、基因表达定量研究等方面发挥着重要作用。

它的用途非常广泛，已经成为分子生物学实验中最常用的一种技术，在这方面取得了很大的成就。

免疫层析实验1．原理金免疫层析试验（dot immunogold chromatographic assay，DICA）是用胶体金标记技术和蛋白质层析技术结合的以微孔滤膜为载体的快速的固相膜免疫分析技术。

本项技是将各种反应试剂分点固定在试纸条上，检测标本加在试纸条的一端，通过毛细血管作用使样品溶液在层析材料上泳动，样本中的待测物与层析材料中的反应试剂发生特异性结合反应，形成的复合物被富集或固定在层析条上的特定区域（检测线）,通过标记免疫技术显色。

本项技术的特点是可进行单份标本检测且简便、快速、不需任何仪器设备，因此，发展非常迅速。

DICA也是GICA（goldimmunochromatography assay）GICA试剂为试纸条形式。

在以塑料条上依次黏贴上以下几种组分，1--吸水纸，2—-破璃纤维膜，抹上固定着干燥的金标抗体，3——硝酸纤维素膜,膜上包被着线条状抗体,4—-吸水纸。

因为1,4都是吸水纸,由于吸水作用，一，使样品液从1端向4端移动二,当样品液达到2时，金标抗体被溶解，同时与标本中的抗原反应形成复合物三，样品液继续移动至3 时，金标记的抗体复合物与膜上的抗体结合，呈现红色的线条四，多余的金条抗体继续前移到4，1 2 3 42.方法学类型DICA多用于检测抗原，但亦可用于检测抗体。

常见方法学类型有：1）双抗体夹心法测抗原：若图—2所示，G处为金标抗体（免疫金),T处包被抗体，C处包被抗金标抗体，B处为吸水纸。

测试时A端滴加待测标本，通过层析作用,待测标本向B端移动,流经G处时将金标抗体复溶，若待测标本中含待测抗原，即形成金标抗体—抗原复合物，移至T区时，形成金标抗体—抗原-抗体复合物，金标抗体被固定下来，在T区显示红色线条，呈阳性反应，多余的金标记抗体移至C区被抗金标抗体捕获，呈现红色质控线条.图—2免疫层析试验双抗体夹心法测大分子抗原2）竞争法测小分子抗原:若图1-3所示，G处为金标抗体，T处包被标准抗原，C处包被抗免疫金抗体，测试时待测标本加于A端，若待测标本中含有待测抗原，流经G处时结合金标抗体,当混合物移至T 处时，因无足够游离的金标抗体与膜上标准抗原结合，T处无棕红色线条出现,实验结果为阳性，游离金标抗体或金标抗体复合物流经C处，与该处的抗金标抗体结合出现棕红色的质控带,若标本中不含待测抗原，金标抗体则与T处膜上的标准抗原结合，在T处出现棕红色的线条，实验结果为阴性。