下载文档原格式
免疫细胞的观察与小鼠脾脏淋巴细胞的提取一、实验目的1、明确各免疫器官分布与形态结构，能熟练找到各免疫器官，弄清中枢免疫器官与外周免疫器官的区别与联系。
2、掌握密度梯度离心法分离小鼠脾脏淋巴细胞的方法，熟悉脾脏淋巴细胞的形态与功能。
二、实验原理脾脏是外周免疫器官之一，是人体最大的淋巴器官。
它生在腹腔左上方，质地比较脆，容易外伤。
一般来讲，脾脏有三大功能：首先它是人体的“血库”，当人体休息、安静时，它贮存血液，当处于运动、失血、缺氧等应激状态时，它又将血液排送到血循环中，以增加血容量；其次，脾脏犹如一台“过滤器”，当血液中出现病菌、抗原、异物、原虫时，脾脏中的巨噬细胞、淋巴细胞就会将其吃掉；此外，脾脏还可以制造免疫球蛋白、补体等免疫物质，发挥免疫作用。
脾是血循环中重要的滤过器，能清除血液中的异物、病菌以及衰老死亡的细胞，特别是红细胞和血小板。
因此，脾功能亢进时可能会引起红细胞及血小板的减少。
脾脏还有产生淋巴细胞的功能。
我们利用小鼠来观察脾脏的淋巴细胞。
小鼠淋巴细胞的比重为1.088，利用比重为1.088的淋巴细胞分离液，将脾细胞悬液置于分离液上层，通过梯度离心的方法，在分离液与脾细胞悬液交界液面处分离得到脾脏淋巴细胞。
三、实验器材KM种小鼠，PBS缓冲液，淋巴细胞分离液，200目不锈钢网，解剖器械四、实验步骤1、杀死老鼠，取出小鼠的脾脏，在pbs缓冲液中冲洗干净。
2、将小鼠脾脏至于200目铜网中，铜网绑定在烧杯上面，剪碎、碾磨，边碾磨边加PBS 冲洗，制得脾细胞悬液。
3、将制得的脾细胞悬液转移到10ml的离心管中，1000r/min 5min离心洗涤，倒掉上清，加入5mlPBS再离心洗涤一次。
4、加入5mlPBS将洗涤的脾脏细胞吹散、悬浮，缓慢加入淋巴细胞分离液上层，细胞悬液与分离液体体积比为1:1。
5、2000r/min离心30min。
6、小心吸取中间层细胞，1000r/min 5min离心洗涤两次。
小鼠脾脏单个核细胞分离及细胞计数实验时间：____________ 实验地点：_____________ 实验人：__________________ 1实验原理小鼠脾脏位于上腹部左后侧，体积较大，长条形，属于外周免疫器官。
外周血中淋巴细胞可经再循环驻如脾脏等外周免疫器官的特定区域，所以富含各类免疫细胞。
免疫细胞的分离：采用红细胞裂解法，是根据细胞对渗透压变化的敏感度。
红细胞由于细胞结构较为简单，仅有细胞膜结构，对于膨胀的耐受能力较差，因此绝大部分就会涨破，受到破坏。
是一种比较温和的去除红细胞最简便易行的方法。
2实验材料：1）健康小鼠2）手术器械（剪刀、镊子）、解剖板3）70汇醇4）PBS缓冲液、红细胞裂解液（ACK5）0.2%台盼蓝6）细胞计数板、计数器7）离心机8）显微镜3实验方法：3.1取小鼠脾脏将小鼠颈椎脱位处死，用酒精消毒。
用剪刀剪开背部皮肤，再找到脾脏，用镊子夹出脾脏并剪除周围组织。
3.2制备单个核细胞悬液将取出的脾脏置于盛有3mlPBS缓冲液的平皿中，然后再置于尼龙指套中，用针芯轻轻碾压使得单个核细胞悬浮于平皿中。
吸取平皿中细胞悬液置于刻度离心管（15ml）中，以1500rpm离心10min, 弃去上清液，加入ASK至2-3ml，轻轻吹打混匀并放置2min,以破坏红细胞。
然后加入PBS缓冲液至10ml，以1500rpm离心10min。
弃去上清液，用PBS缓冲液定容至2ml，吹打混匀即为小鼠脾脏单个核细胞悬液。
3.3 计算细胞浓度稀释十倍，随机选取一个大方格计数细胞计数为324个，计算细胞浓度为324X 104X 10=3.24 X 107/ml3.4 计算细胞活力在总计为324个细胞中计数，死亡细胞有16 个，计算细胞活力为：324- 16/324 X 100%=95.1%在理论范围之内4 实验结果4.1 研磨脾脏得到细胞悬液本实验中将小鼠的脾脏放入尼龙指套内，置于少量PBS液中缓慢研磨，获得细胞悬液。
小鼠免疫组织及免疫细胞的观察【实验原理】免疫器官、组织及细胞是机体免疫系统的重要组成部分。
中枢免疫器官包括胸腺和骨髓，是T淋巴细胞及其他各类免疫细胞发生、发育和分化的场所，外周免疫器官包括脾胀、淋巴结和粘膜相关淋巴组织是免疫应答的场所。
各类免疫细胞直接参与免疫系统对抗原类物质的免疫应答，完善的免疫器官组织结构和正常的免疫细胞种类和数量是机体免疫功能发挥正常的基本条件。
【试剂和器材】小鼠、棉签、解剖台、平皿、大头针、手术剪子、手术镊子、载玻片、瑞士染液、细胞筛【操作方法】1.取一只小鼠，采用颈部脱臼法处死，将小鼠放到解剖台上，沿腹中线剪开皮肤且不破坏腹膜和胸膜，剪开腹膜，打开腹腔和胸腔，观察胸腺所在的位置和形状。
2.分离脾细胞：取出脾胀，去除其周围的脂肪组织，用剪子剪碎脾脏，放入细胞筛中，用载玻片清研脾胀，滴加生理盐水，使脾细胞分散成细胞悬液。
3.脾细胞染色观察：取少量细胞悬液置于载玻片上，与室温晾干，加瑞士染色液甲染色1min，甩掉染液，用瑞士染色液乙染色5min，用自来水冲洗，让染液漂走，置于光学显微镜下观察染色脾细胞。
【结果观察】小鼠脾细胞瑞士染色镜下观察【注意事项】1.正确抓取小鼠，防止被鼠咬伤。
2.脾脏分离完整，清研轻柔。
3.染色时间不宜过长或过短。
.【讨论】脾脏具有多种重要的生理功能, 参与并调节血液、免疫、内分泌系统的运转, 绝非可有可无;脾脏功能在疾病的不同阶段扮演不同的角色,有时甚至完全相反, 即具有双向性、时向性的特点。
1.脾切除术后暴发性感染全脾切除术后 OPSI 的发生率约为 1 %～2.4 %。
虽然 OPSI的发生率不是很高,但脾脏切除后,在由肺炎球菌导致的感染中毒性休克中, 50 %患者的病情迅速进展, 并最终导致死亡。
脾脏为全身最大的淋巴器官, 血循环相当丰富, 且脾脏具有延缓微循环的作用, 有利于清除和吞噬多种抗原, 减轻机体感染的发生。
同时脾脏拥有大量重要的免疫细胞及免疫因子, 如 T 细胞、B 细胞、K 细胞、单核巨噬细胞、自然杀伤细胞、杀伤细胞、淋巴因子活化杀伤细胞(LAK 细胞)、树突状细胞。
医学免疫学实验指导病原生物与免疫学教研室实验一免疫系统组织和细胞形态学一、实验目的观察小鼠胸腺、脾脏等免疫器官及免疫细胞二、实验内容机体免疫系统由免疫器官、免疫细胞、免疫分子组成。
该系统具有识别和排除抗原性异物、维持机体内环境稳定和生理平衡的功能，是执行体液免疫和细胞免疫的物质基础。
本次实验主要观察免疫器官大体解剖学、免疫细胞的形态学特征。
小鼠是啮齿目中体形较小的动物，淋巴系统很发达，包括胸腺、脾脏、淋巴管、外周淋巴结及肠道派氏集合淋巴结。
本实验在带教老师指导下，解剖小鼠，观察胸腺、脾脏等免疫器官，并制血涂片，观察小鼠免疫细胞。
（一）小鼠免疫器官解剖学观察【材料】１动物：昆明种小白鼠。
２试剂：3%来苏尔水，瑞特氏染液。
３器材：眼科镊，眼科剪，玻片。
【方法】１小鼠脱臼处死，投入盛有3%来苏尔水的缸内，浸泡5分钟。
取出小鼠，仰卧位置于试验台上，使动物腹部朝上。
２以镊子提起耻骨处皮肤，用剪刀沿正中线直剪开至下颌部，然后钝性分离皮肤，再把皮肤向四肢剪开。
３注意观察腹壁，用剪刀沿正中线自阴部至膈肌为止剪开，观察腹腔液量及性状，观察脾脏。
４切开膈肌，剪断胸骨，翻起胸骨，观察胸腺、心脏及肺脏，胸腺位于小鼠胸腔心脏前上方，内有许多大淋巴细胞（即前胸腺细胞）及特定的上皮网状细胞（分泌胸腺激素）。
５解剖结束，深埋动物。
（二）免疫细胞的形态观察【材料】１动物：昆明种小白鼠。
２试剂：3%来苏尔水，瑞特氏染液，pH8.6硫酸盐缓冲液，20%盐酸甲醇。
３器材：眼科镊，眼科剪，玻片。
【方法】１准备洁净玻片两张，一张用于推片，另一张用于固定标本。
２剪断小鼠尾巴取血或小鼠眼球取血，迅速在玻片上涂血膜制备血涂片，自然干燥。
３瑞氏染色（１）染色：甲醇固定标本２分钟（亦可省略），滴加瑞氏染液数滴覆盖血膜，染色１分钟，再加等量的pH8.6硫酸盐缓冲液或新制蒸馏水，用洗耳球吹打，使之与染液混匀，静置染色8～10分钟，弃去染料，水洗。
（２）脱色：用20%盐酸甲醇脱色，肉眼观察玻片呈粉红色为宜，显微镜下观察结果。
小鼠脾脏单个核细胞分离及细胞计数实验时间：实验地点：实验人：1实验原理小鼠脾脏位于上腹部左后侧，体积较大，长条形，属于外周免疫器官。
外周血中淋巴细胞可经再循环驻如脾脏等外周免疫器官的特定区域，所以富含各类免疫细胞。
免疫细胞的分离：采用红细胞裂解法，是根据细胞对渗透压变化的敏感度。
红细胞由于细胞结构较为简单，仅有细胞膜结构，对于膨胀的耐受能力较差，因此绝大部分就会涨破，受到破坏。
是一种比较温和的去除红细胞最简便易行的方法。
2实验材料：1)健康小鼠2)手术器械（剪刀、镊子）、解剖板3)70%乙醇4)PBS缓冲液、红细胞裂解液（ACK）5)0.2%台盼蓝6)细胞计数板、计数器7)离心机8)显微镜3实验方法：3.1取小鼠脾脏●将小鼠颈椎脱位处死，用酒精消毒。
●用剪刀剪开背部皮肤，再找到脾脏，用镊子夹出脾脏并剪除周围组织。
3.2制备单个核细胞悬液●将取出的脾脏置于盛有3mlPBS缓冲液的平皿中，然后再置于尼龙指套中，用针芯轻轻碾压使得单个核细胞悬浮于平皿中。
●吸取平皿中细胞悬液置于刻度离心管（15ml）中，以1500rpm离心10min，弃去上清液，加入ASK至2-3ml，轻轻吹打混匀并放置2min，以破坏红细胞。
然后加入PBS缓冲液至10ml，以1500rpm离心10min。
●弃去上清液，用PBS缓冲液定容至2ml，吹打混匀即为小鼠脾脏单个核细胞悬液。
3.3计算细胞浓度稀释十倍，随机选取一个大方格计数细胞计数为324个，计算细胞浓度为324×104×10=3.24×107/ml3.4计算细胞活力在总计为324个细胞中计数，死亡细胞有16个，计算细胞活力为：324-16/324×100%=95.1%在理论范围之内4实验结果4.1研磨脾脏得到细胞悬液本实验中将小鼠的脾脏放入尼龙指套内，置于少量PBS液中缓慢研磨，获得细胞悬液。
实验中，我们发现尼龙指套不能滤去所有结缔组织，操作中会有结为絮状团块的结缔组织。
实验某些（10分）1、计算胸腺指数、脾指数公式：单位mg/10 g胸腺指数=胸腺重量/（小鼠体重×10）脾脏指数=脾脏重量/（小鼠体重×10）2、（1）白细胞（WBC）计数公式：X/4×10 ×20 ×106/L=白细胞/LX：为4个大方格内白细胞总数。
÷4：为每大方格（即0.1ul）内白细胞平均数。
×10：1个大方格容积为0.1ul，换算成1ul。
×20：血液稀释倍数。
×106：将ul换算成L（2）计数办法：自小鼠尾静脉采血0.02mL将其插入稀释液底部，轻轻将血放出，混匀。
用微量吸管或玻璃棒取混匀细胞悬液1滴，充入计数池与盖片缝隙中，静置2-3min，使白细胞下沉。
在显微镜下用低倍镜（10×）计数四角4个大方格白细胞总数。
注意事项：①在大方格内压线细胞应按“数上不数下，数左不数右”原则计数。
②稀释液要过滤，小试管、计数板须清洁，以免杂质、微粒等被误以为细胞。
③冲池前要摇匀，要注意，冲池时不可气泡，否则应重新冲池。
（3）血液稀释液用是3%稀乙酸3、腹腔巨噬细胞实验（1）实验原理：巨噬细胞是机体非特异性免疫功能重要构成某些，可非特异吞噬较大颗位性异物如鸡红细胞、白色念珠菌等，称为大吞噬现象。
将鸡红细胞注入小鼠腹腔中，巨噬细胞由于具备趋化性，便向鸡红细胞处汇集，将之内吞入胞质，形成吞噬泡，然后在胞内与溶酶体融合，将鸡红细胞消化分解一段时间后取巨噬细胞，运用巨噬细胞贴壁特性观测吞噬现象，作为鉴定其吞噬活性指标。
(2)染料及染色办法：Giemsa（姬姆萨应用液）染色5min后再用蒸馏水漂洗晾干（3）淀粉肉汤作用：诱导腹腔内产生较多巨噬细胞4、肝脏DNA提取实验，（1）研磨抽提各步所用试剂：研磨肝脏先用冰冷生理盐水水洗3次再置于加入2ml匀浆液研钵中，研磨至无明显组织块存在。
离心弃上清加消化液55℃水浴酶解过夜，沉淀加Rnase。
Balb c、KM、ＮIH三种小鼠血常规、主要脏器质量、主要脏器系数的测定与比较摘要：为了测定ＳＰＦ级Ｂａｌｂ／ｃ、ＫＭ、ＮＩＨ小鼠血常规、主要脏器质量、主要脏器系数并进行比较，采用Ｃｏｕｌｔｅｒ－ＪＴ全自动血常规检测仪检测小鼠血常规；精确称量小鼠主要脏器质量，计算其脏器系数。
结果表明，ＳＰＦ级ＫＭ小鼠与Ｂａｌｂ／ｃ小鼠相比，血常规指标中有１４项指标有显著性差异（Ｐ＜０．０１或Ｐ＜０．０５，下同），主要脏器质量指标中有８项指标有显著性差异，主要脏器系数指标中有５项指标有显著性差异；ＳＰＦ级ＮＩＨ小鼠与Ｂａｌｂ／ｃ小鼠相比，血常规中有１５项指标有显著性差异，主要脏器质量指标中有１０项指标有显著性差异，主要脏器系数指标中有９项指标有显著性差异。
说明不同品系小鼠某些血常规值、主要脏器质量、主要脏器系数方面有较大不同。
关键词：小鼠；血常规；主要脏器质量；主要脏器系数；比较Ａｂｓｔｒａｃｔ：Ｔｏｍｅａｓｕｒｅａｎｄｃｏｍｐａｒｅｔｈｅｈｅｍａｔｏｌｏｇｉｃａｌｐａｒａｍｅｔｅｒｓ，ｍａｉｎｏｒｇａｎmass ａｎｄｍａｉｎｏｒｇａｎｓｃｏｅｆｆｉｃｉｅｎｔｏｆＳＰＦＢａｌｂ／ｃ、ＫＭａｎｄＮＩＨｍｉｃｅ，Ｃｏｕｌｔｅｒ－ＪＴＡｕｔｏｍａｔｉｃＨｅｍａｔｏｌｏｇｙＡｎａｌｙｚｅｒｗａｓｕｓｅｄｔｏｔｅｓｔｈｅｍａｔｏｌｏｇｉｃａｌｐａｒａｍｅｔｅｒｓ；ａｎｄｔｈｅｃｏｅｆｆｉｃｉｅｎｔｏｆｍａｉｎｏｒｇａｎｓｗｅｒｅｃａｌｃｕｌａｔｅｄｂｙｅｘａｃｔｗｅｉｇｈｉｎｇ．ＴｈｅｒｅｓｕｌｔｓｓｈｏｗｅｄｔｈａｔｃｏｍｐａｒｅｄｗｉｔｈＢａｌｂ／ｃｍｉｃｅ，１４ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌｐａｒａｍｅｔｅｒｓ，８ｏｒｇａｎｗｅｉｇｈｔｓ，５ｏｒｇａｎｃｏｅｆｆｉｃｉｅｎｔｓｉｎＳＰＦＫＭｍｉｃｅ；ａｎｄ１５ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌｐａｒａｍｅｔｅｒｓ，１０ｏｒｇａｎｗｅｉｇｈｔｓ，９ｏｒｇａｎｃｏｅｆｆｉｃｉｅｎｔｓｉｎＳＰＦＮＩＨｍｉｃｅｗｅｒｅｓｉｇｎｉｆｉｃａｎｔｌｙｄｉｆｆｅｒｅｎｔ（Ｐ＜０．０１ｏｒＰ＜０．０５）．Ｉｔwas ｉｎｄｉｃａｔｅｄｔｈａｔｓｏｍｅｈｅｍａｔｏｌｏｇｉｃａｌｐａｒａｍｅｔｅｒｓ，ｍａｉｎｏｒｇａｎｗｅｉｇｈｔｓａｎｄｍａｉｎｏｒｇａｎｃｏｅｆｆｉｃｉｅｎｔｓｉｎｍｉｃｅｗｅｒｅｉｎｆｌｕｅｎｃｅｄｂｙｉｔｓｓｔｒａｉｎ．Ｋｅｙｗｏｒｄｓ：ｍｉｃｅ；ｈｅｍａｔｏｌｏｇｉｃａｌｐａｒａｍｅｔｅｒ；ｍａｉｎｏｒｇａｎmass；ｍａｉｎｏｒｇａｎｃｏｅｆｆｉｃｉｅｎｔ；ｃｏｍｐａｒｉｓｏｎＢａｌｂ／ｃ小鼠是我国常用的近交系小鼠，ＮＩＨ小鼠、ＫＭ小鼠是我国常用的封闭群小鼠。
⼩⿏的饲养与管理⼩⿏的饲养与管理⼩⿏（Mouse. Mus. musculus）属哺乳纲（Mammalia）、啮齿⽬（Rodentia）、⿏科（Muridae）、⼩⿏属（Mus）。
⼩⿏来源于野⽣鼷⿏，从17世纪开始⽤于解剖学研究及动物实验，经长期⼈⼯饲养选择培育，已育成多达千余个独⽴的远交群和近交系，分布遍及世界各地。
由于⼩⿏繁殖快，饲养管理费⽤低，所以成为⽣物医学研究中⼴泛使⽤的实验动物，也是当今世界上研究最详尽的哺乳类实验动物。
第⼀节⽣物学特性⼀、⾏为和习性1. ⼩⿏胆⼩，易于受惊，对外界环境的改变反应敏感。
受惊时,尾巴挺直并猛⼒甩动，如强光或噪声刺激可导致哺乳母⿏神经紊乱，发⽣⾷仔现象。
2. ⼩⿏在⼈⼯驯养条件下,性情温顺易于捕捉，⼀旦逃出笼外过夜则恢复野性，⾏动敏捷难以捕捉。
3. ⼩⿏喜欢阴暗，固定⼀处睡眠营巢。
傍晚活动加强，夜间更加活跃，其进⾷、交配、分娩多发⽣在夜间。
4. ⼩⿏是典型的啮齿动物，门齿终⽣⽣长。
因此⼩⿏有啃咬习惯，以此来磨损门齿并保持其长短的恒定。
5. ⼩⿏为群居动物，当群饲时，其饲料消耗量⽐单个饲养时多，⽣长发育也快。
6. ⼩⿏群体中性成熟的雄⿏放在⼀起易发⽣互⽃。
源于⼀窝的雄⿏或断奶后同笼饲养的雄⿏间则较少攻击。
外来雄⿏常招致⼏只雄⿏的集体攻击。
群居优势在雄性很明显，表现为群体中处于优势者保留胡须,被称为“理发师”,⽽处于劣势者胡须被拔光。
这⼀现象应与因寄⽣⾍性或真菌性⽪炎所致的掉⽑相区别。
雄⿏具有分泌醋酸胺臭⽓的特性，是⼩⿏饲养室内特异臭⽓的主要原因。
7. ⼩⿏对外界温度的变化特别是低温⾮常敏感，由于运输、环境改变⽽致低温可很快引起⼩⿏死亡。
⼆、解剖学特点1. 外观⼩⿏体形⼩，90⽇龄的昆明种⼩⿏体长为90～110mm，体重为35～55g 。
近交系如615⼩⿏体长为85～94mm，体重为24～35g。
⼀般雄⿏⼤于雌⿏。
嘴尖，头呈锥体形，嘴脸前部两侧有触须，⽿耸⽴呈半圆形。
小鼠免疫组织及免疫细胞的观察【实验原理】免疫器官、组织及细胞是机体免疫系统的重要组成部分。
中枢免疫器官包括胸腺和骨髓，是T淋巴细胞及其他各类免疫细胞发生、发育和分化的场所，外周免疫器官包括脾胀、淋巴结和粘膜相关淋巴组织是免疫应答的场所。
各类免疫细胞直接参与免疫系统对抗原类物质的免疫应答，完善的免疫器官组织结构和正常的免疫细胞种类和数量是机体免疫功能发挥正常的基本条件。
【试剂和器材】小鼠、棉签、解剖台、平皿、大头针、手术剪子、手术镊子、载玻片、瑞士染液、细胞筛【操作方法】1.取一只小鼠，采用颈部脱臼法处死，将小鼠放到解剖台上，沿腹中线剪开皮肤且不破坏腹膜和胸膜，剪开腹膜，打开腹腔和胸腔，观察胸腺所在的位置和形状。
2.分离脾细胞：取出脾胀，去除其周围的脂肪组织，用剪子剪碎脾脏，放入细胞筛中，用载玻片清研脾胀，滴加生理盐水，使脾细胞分散成细胞悬液。
3.脾细胞染色观察：取少量细胞悬液置于载玻片上，与室温晾干，加瑞士染色液甲染色1min，甩掉染液，用瑞士染色液乙染色5min，用自来水冲洗，让染液漂走，置于光学显微镜下观察染色脾细胞。
【结果观察】小鼠脾细胞瑞士染色镜下观察【注意事项】1.正确抓取小鼠，防止被鼠咬伤。
2.脾脏分离完整，清研轻柔。
3.染色时间不宜过长或过短。
.【讨论】脾脏具有多种重要的生理功能, 参与并调节血液、免疫、内分泌系统的运转, 绝非可有可无;脾脏功能在疾病的不同阶段扮演不同的角色,有时甚至完全相反, 即具有双向性、时向性的特点。
1.脾切除术后暴发性感染全脾切除术后OPSI 的发生率约为1 %～2.4 %。
虽然OPSI的发生率不是很高,但脾脏切除后,在由肺炎球菌导致的感染中毒性休克中, 50 %患者的病情迅速进展, 并最终导致死亡。
脾脏为全身最大的淋巴器官, 血循环相当丰富, 且脾脏具有延缓微循环的作用, 有利于清除和吞噬多种抗原, 减轻机体感染的发生。
同时脾脏拥有大量重要的免疫细胞及免疫因子, 如T 细胞、B 细胞、K 细胞、单核巨噬细胞、自然杀伤细胞、杀伤细胞、淋巴因子活化杀伤细胞(LAK 细胞)、树突状细胞。
