用环磷酰胺建立小鼠免疫抑制动物模型

小鼠免疫功能检测建立小鼠免疫功能低下模型的研究小鼠免疫功能检测是评估小鼠免疫系统状态的重要手段之一、小鼠作为常用的动物模型，在研究免疫相关疾病、发展新药和疫苗等方面具有广泛应用。

建立小鼠免疫功能低下模型可以为进一步研究免疫功能的途径提供重要参考。

本文将介绍建立小鼠免疫功能低下模型的研究。

首先，建立小鼠免疫功能低下模型需要选择合适的免疫抑制方法。

常用的方法包括药物免疫抑制、单克隆抗体介导的免疫抑制和基因敲除等。

其中，药物免疫抑制是最常用的方法之一、糖皮质激素是目前最常用的免疫抑制药物之一，常用的剂量为每天20-40 mg/kg体重的甲泼尼龙。

免疫抑制剂如环孢素A和他克莫司也可以应用于建立免疫功能低下模型。

此外，通过单克隆抗体特异性抑制免疫应答也是另一种选择。

例如，通过注射CD4或CD8特异性单克隆抗体可抑制小鼠的T细胞功能。

此外，基因敲除技术也可以通过敲除免疫相关基因来建立小鼠免疫功能低下模型。

其次，建立免疫功能低下模型后需要对小鼠的免疫功能进行评估。

评估免疫功能的方法包括机体免疫指标的检测和特定病原体感染模型的建立。

机体免疫指标的检测可以通过检测外周血白细胞数目、淋巴细胞亚群的分布和功能等来评估小鼠的免疫功能。

此外，还可以通过ELISA、免疫荧光或流式细胞术等技术检测小鼠体内的免疫球蛋白水平和细胞因子水平等指标。

特定病原体感染模型的建立可以通过注射特定病原体来评估小鼠免疫功能。

例如，通过感染流感病毒来评估小鼠的免疫功能。

最后，通过研究免疫功能低下模型可以深入了解免疫功能的调节机制，并为疾病的治疗和药物设计提供重要参考。

通过建立小鼠免疫功能低下模型，可以在影响免疫功能的基因和通路上进行深入研究，从而揭示免疫功能低下的机制。

此外，还可以利用这些模型开展新药和疫苗的研发，评估其免疫功能调节作用。

总之，小鼠免疫功能检测和建立免疫功能低下模型对于研究免疫系统的功能和调节机制具有重要意义。

通过评估小鼠免疫功能和建立免疫功能低下模型，可以深入了解免疫功能的调节机制，并为疾病治疗和药物设计提供重要参考。

一、实验背景针灸作为一种传统的中医疗法，在治疗多种疾病方面具有显著疗效。

近年来，随着科学研究的深入，针灸在实验动物模型中的应用逐渐受到关注。

本实验旨在探讨针灸对实验小鼠的免疫调节作用，以期为临床应用提供理论依据。

二、实验材料与方法1. 实验动物：选取健康昆明种小鼠32只，体重（20±2）g，随机分为空白对照组、模型组、针灸组。

2. 实验仪器：电针治疗仪、电子显微镜、酶标仪等。

3. 实验方法：（1）建立模型：采用环磷酰胺（CTX）诱导小鼠免疫抑制模型。

（2）针灸治疗：对针灸组小鼠进行电针治疗，选取“足三里”、“肾俞”、“肺俞”等穴位，每次治疗30分钟，每日1次，连续治疗7天。

（3）免疫指标检测：采用酶联免疫吸附试验（ELISA）检测小鼠血清中IL-2、IFN-γ水平。

（4）细胞因子检测：采用流式细胞术检测小鼠脾脏中CD4+、CD8+、CD4+/CD8+比值。

（5）组织学观察：采用苏木精-伊红（HE）染色法观察小鼠脾脏组织形态学变化。

三、实验结果1. 免疫指标：与空白对照组相比，模型组小鼠血清中IL-2、IFN-γ水平显著降低（P<0.05）；与模型组相比，针灸组小鼠血清中IL-2、IFN-γ水平显著升高（P<0.05）。

2. 细胞因子：与空白对照组相比，模型组小鼠脾脏中CD4+、CD8+细胞比例及CD4+/CD8+比值显著降低（P<0.05）；与模型组相比，针灸组小鼠脾脏中CD4+、CD8+细胞比例及CD4+/CD8+比值显著升高（P<0.05）。

3. 组织学观察：与空白对照组相比，模型组小鼠脾脏组织出现淋巴细胞减少、组织结构紊乱等病理变化；与模型组相比，针灸组小鼠脾脏组织病理变化明显减轻。

四、讨论本实验结果表明，针灸可以显著提高实验小鼠的免疫功能，其作用机制可能与以下方面有关：1. 调节细胞因子水平：针灸可上调小鼠血清中IL-2、IFN-γ水平，这些细胞因子在免疫调节中发挥重要作用，可增强机体免疫功能。

应用环磷酰胺对免疫抑制模型的建立及免疫抑制模型的检测摘要目的：应用环磷酰胺建立小鼠免疫抑制模型并检测免疫抑制模型建立是否成功方法：十六只小鼠分为四大组，每组四只。

将四只小鼠平均分为两组，分别为对照组和免疫抑制组，第一天对两组的四只小鼠进行初次免疫，对照组小鼠分别注射0.4mlNS和0.4mlOVA-AL(OH)3，免疫抑制组小鼠分别注射0.4mlNS 和0.4mlOVA-AL(OH)3。

此后分别于第8、10、12、14天给对照组小鼠注射0.4mlNS，给免疫抑制组小鼠注射100mg/kg的CTX。

于第十五天对两组小鼠加强免疫，对照组小鼠分别注射0.4mlNS和0.4mlOVA-AL(OH)3，免疫抑制组小鼠分别注射0.4mlNS和0.4mlOVA-AL(OH)3，即四组分别为NS-NS组、OVA-NS组、NS-CTX组、OVA-CTX组，免疫抑制模型建立。

用小鼠腹腔巨噬细胞吞噬墨汁试验对天然免疫功能进行检测，淋巴细胞转化试验对细胞免疫功能进行检测，双向免疫扩散试验、酶联免疫吸附试验对体液免疫功能进行检测。

结果：细胞免疫的检测（淋转实验）结果全为阴性，吞噬细胞功能的检测（吞噬实验）结果为阴性，体液免疫的检测（双扩实验和ELISA）结果有三项测定项目为阳性。

结论：虽然本实验不足以证明CTX对免疫功能的抑制作用，但从一些数据可以看出CTX的免疫抑制功能。

AbstractObjective:cyclophosphamide was applied to establish the mice immunos uppression model and detection whether the immunosuppression model s uccess or not.Meyhod:Divid the 16 mice into four groups, each group of four. Divid the four mice into two groups, control group and immunosuppressive gro ups. On the first day giver primary immune to the two groups of fou mic e, Control group mice were injected NS 0.4ml and OVA - AL (OH) 3 0.4 ml, Immunosuppressive mice were injected NS 0.4ml and OVA - AL (O H) 3 0.4 ml. In 8, 10, 12, 14 days inject 0.4 ml NS to the control group mice, inject 100 mg/kg CTX to the immunosuppressive mice. In the fift eenth day give strengthen immunity to the two groups of mice. Control g roup mice were injected NS 0.4 ml and OVA - AL (OH) 3 0.4 ml, Immu nosuppressive mice were injected NS 0.4ml and OVA - AL (OH) 3 0.4ml, which means the four groups were NS-NS group, OVA-NS grpoup, NS -CTX group, OVA-CTX group.,Immunosuppression model is established. Use macrophage cell in abdominal cavity of mice phagocytosis ink expe riment to test the natural immune function, The lymphocyte transformatio n test to test the cellular immune function, double immunodiffusion test, ELISA to test the humoral immune function.Result: The results cellular immune detection (lymphocyte transformation test) were all negative, the result Phagocytes function detection (Consuming experiment) was all negative, three of the results of humoral immunity test ( double immunodiffusion test and ELISA) are positive.Conclusion：Although this experiment is not enough to prove that CTX ‘s inhibitory effect on the immune function, but the CTX’s immunosuppressive function can be seen from some of the datas.关键词：免疫抑制环磷酰胺固有免疫体液免疫细胞免疫引言目前化疗仍是临床上治疗肿瘤的三大有效手段之一,化疗在杀灭患者体内的癌细胞方面有很好的效果,但均有不同程度的毒副作用,如化疗后往往会出现白细胞减少,特别是中性粒细胞减少,血小板减少等情况，严重的会造成人体免疫功能降低甚至是免疫功能缺陷[1],随着肿瘤化疗的不断发展，肿瘤的治疗效果有了很大提高，但其免疫抑制的毒副作用却难以克服。

环磷酰胺对小鼠免疫抑制的动物模型建立高芃;钱嘉林;刘长喜;严卫星【期刊名称】《环境与职业医学》【年(卷),期】2004(21)4【摘要】[目的 ]建立肿瘤化疗免疫抑制动物模型 ,为建立保健食品减轻化疗毒副作用功能的评价方法提供科学依据。

[方法 ]给予C57BL/6J正常小鼠和荷瘤小鼠腹腔内注射不同剂量的环磷酰胺 (CP) ,隔日连续腹腔注射 4～ 5次 ,观察对小鼠免疫学指标及肝肾功能的影响。

[结果 ]正常小鼠和荷瘤小鼠腹腔注射 2 0、5 0、10 0mg/kg体重的CP后 ,各剂量组均出现不同程度的免疫抑制和肝肾功能损伤。

①正常小鼠 2 0mg/kg体重以上剂量组 ,白细胞计数、抗体生成细胞以及巨噬细胞功能显著下降 ,谷草转氨酶 (AST)升高 ;5 0mg/kg体重剂量组的脾脏指数下降 ;50mg/kg体重以上剂量组天然杀伤细胞(NK)细胞活性均出现显著下降 ,以及谷丙转氨酶、尿素的升高。

②荷瘤小鼠 2 0mg/kg体重以上剂量组白细胞计数、巨噬细胞功能显著下降 ,5 0mg/kg体重以上剂量组脾脏指数、NK细胞活性、抗体生成细胞功能均出现显著下降 ,以及谷草转氨酶、谷丙转氨酶、尿素的升高。

③正常小鼠注射 60mg/kg体重的CP后 ,血清白细胞介素 2及肿瘤坏死因子均出现显著下降 ;荷瘤小鼠注射 60mg/kg体重的CP后 ,血清白细胞介素 2出现显著下降。

[结论 ]给予C57BL/6J正常小鼠和荷瘤小鼠腹腔注射 2 0 5 0mg/kg体重的CP ,隔日连续 4 5次 ,即可建立免疫抑制动物模型。

建议采?【总页数】5页(P314-318)【关键词】荷瘤小鼠;免疫抑制;CP;体重;剂量;正常小鼠;环磷酰胺;下降;腹腔注射;抗体生成细胞【作者】高芃;钱嘉林;刘长喜;严卫星【作者单位】中国疾病预防控制中心营养与食品安全所;国家食品药品监督管理局【正文语种】中文【中图分类】R285.5;R730【相关文献】1.不同浓度环磷酰胺和地塞米松对小鼠免疫抑制模型建立的影响 [J], 张涵淇;王娇;崔圆圆;胡鑫;王德彬;2.小剂量环磷酰胺治愈荷膀胱癌小鼠动物模型的建立 [J], 李墨林;姜妙娜;舒晓宏;崔晓栋;李传刚;贾玉杰3.不同浓度环磷酰胺和地塞米松对小鼠免疫抑制模型建立的影响 [J], 张涵淇;王娇;崔圆圆;胡鑫;王德彬4.环磷酰胺免疫抑制小鼠模型的建立及其在肾包膜下移植中应用 [J], 唐超明;李汉贤因版权原因，仅展示原文概要，查看原文内容请购买。

环磷酰胺在动物模型体内抗肿瘤影响及抑瘤机制的研究目的探讨环磷酰胺（CTX）在动物模型体内抗肿瘤影响及抑瘤机制。

方法建立小鼠实体瘤模型和腹水瘤模型:分别在昆明系小鼠皮下接种S180肉瘤细胞、腹腔接种鼠源性H22肝癌细胞，同时给予环磷酰胺处理小鼠，其后观察各组肿瘤生长大小，小鼠存活率的变化；应用Western blot技术检测凋亡抑制基因（Bcl-2）、血管内皮细胞生长因子（VEGF）含量、抑癌基因P53及P21的蛋白表达。

结果环磷酰胺组肿瘤重量明显低于模型组（P ＜0.05），其抑瘤率为88.55%；小鼠存活天数均较模型组长，其生命延长率为57.73%；环磷酰胺可明显诱导P53的表达，抑制BCL-2的表达，从而促进肿瘤细胞的凋亡，但对P21没有作用；对瘤体组织中VEGF蛋白表达水平亦有抑制作用。

结论环磷酰胺可通过激活抑癌基因P53，抑制抗凋亡基因Bcl-2和促血管生成因子VEGF等多种途径，发挥抗肿瘤活性，为抗肿瘤动物模型尤其为调节抗肿瘤相关基因表达方面的阳性药物对照提供重要的实验依据。

标签：环磷酰胺；Western blot；S180肉瘤；H22肝癌细胞；抗肿瘤相关基因肿瘤目前是危害人类健康的主要疾病，环磷酰胺（cyclophosphamide，CTX）作为一种抗癌谱广、疗效较好的抗癌药物，已广泛应用于临床。

由于该药物的良好抗癌性能，尤其是具有对癌细胞与正常细胞杀伤力差别很大这一特性，使得其在临床得到了广泛应用。

环磷酰胺在细胞水平以及联合用药等方面的研究较多[1-2]，目前肿瘤化疗所应用的大多数药物，都经移植性动物肿瘤试验而被发现，并以此为模型进行疾病发生机制和药物筛选的研究，因此它是筛选抗肿瘤新药中最常用的模型[3]，对研究肿瘤的病因、发病机制、抗癌药物筛选及肿瘤防治等都具有非常重要的意义[4]。

现阶段进行的抗癌药物动物实验研究过程中，多采用环磷酰胺作为阳性对照药物，然而，关于环磷酰胺是否具有调节肿瘤相关基因表达而发挥抗肿瘤作用，尚鲜有人报道。

环磷酰胺不同剂量及停药周期构建小鼠卵巢早衰动物模型比较研究莫金桦;胡鸿;颜秋霞;李鹏东;陈彩蓉【期刊名称】《生殖医学杂志》【年(卷),期】2024(33)3【摘要】目的比较环磷酰胺(CTX)不同剂量和停药周期构建的小鼠卵巢早衰(POF)动物模型,寻找最佳造模方式,为进一步研究POF提供更为适用的实验模型。

方法8周龄动情周期规律的C57BL/6雌性小鼠共40只,随机分成5组:CON(对照组),CTX80(80 mg·kg^(-1)·d^(-1)),CTX100(100 mg·kg^(-1)·d^(-1)),CTX120(120 mg·kg^(-1)·d^(-1)),CTX150(150 mg·kg^(-1)·d^(-1)),连续腹腔注射10 d,CON组注射生理盐水,其余组注射不同剂量CTX。

记录小鼠体重、动情周期和卵巢脏器系数等,比较得出CTX诱导POF模型最佳暴露剂量。

使用最佳CTX暴露剂量重新造模,随机分为模型组和对照组,分别在停药后第1、2、3、4周,检测血清性激素,计数各级卵泡等,比较得出CTX诱导POF模型最佳停药周期。

结果(1)研究最佳造模剂量时,CTX150死亡2只,而CTX80小鼠仍有完整的动情周期,说明这两种剂量并非最佳。

CTX各组在暴露过程中体重呈进行性下降,停止暴露后体重开始回升,但至停药第7天各组体重仍显著低于CON组(P<0.05)。

停药第7天各CTX组卵巢脏器系数均显著低于CON组(P<0.01),CTX100最低(P<0.001),但各CTX组间差异无统计学意义(P>0.05)。

考虑到尽量缩小药物对实验动物伤害的伦理要求,得出CTX诱导卵巢早衰模型的最佳暴露剂量为100 mg·kg^(-1)·d^(-1)×10 d。

(2)研究最佳停药周期时,模型组停药后第1、2、3、4周血清抗苗勒管激素(AMH)水平、雌二醇(E_(2))水平、原始卵泡、初/次级卵泡均显著低于同期对照组(P<0.05),卵泡刺激素(FSH)水平在第1、3、4周均显著高于同期对照组(P<0.05),而第1、2、4周的闭锁卵泡计数均显著高于同期对照组(P<0.05),均表现出POF典型特征。

骨髓抑制模型现代研究进展苗明三陈纲领（河南中医学院艾滋病研究所 450008）骨髓抑制常见于化学疗法、放射疗法治疗癌症和高效抗病毒疗法(HAART，Highly Active Antiretroviral Therapy)治疗艾滋病的不良反应，骨髓抑制的出现可严重影响这些疾病的治疗，同时也给患者带来很大的痛苦。

为了开展相关研究，需要相应的动物模型，相关动物模型的研究也有助于防治放化疗法和抗病毒不良反应药物的研究开发。

目前也有不少重现性较好、实用性较强的动物骨髓抑制模型，现对常见的相关动物模型分析综述如下：1.环磷酰胺（CTX）致骨髓抑制模型张琰等[1]用昆明种小鼠，雌雄各半，适应1 周后，腹腔注射25 mg/kg（配制浓度1.25 g/l）的CTX ,每天1次，连续7 天.，小鼠腹腔注射CTX后，外周血白细胞和骨髓有核细胞明显减少，CD4/ CD8 T淋巴细胞亚群比值降低。

王德俊等[2]用昆明种纯系小白鼠，体重18-22g，雌雄各半，小鼠于实验第1天开始腹腔注射环磷酰胺(CTX) 100mg/ kg，每日1次，连续3天。

于实验第4，7，10天尾静脉采血，测定红细胞(RBC)、白细胞(WBC)、血小板(BPC)，均显著降低，且随时间延长三项测定值降低更为显著。

试验结束，脱臼处死小鼠，剥离股骨，每根股骨用Hank' s液1 ml反复冲洗骨髓腔，显微镜下计数骨髓有核细胞，模型组显著减少。

徐振晔等[3]用C57BL/ 6J小鼠纯系小鼠，雌性，体重18-20g，8-10周龄，实验第1天腹腔注射CTX100 mg/ kg，连续3天。

造模第4天髓内血窦壁破裂或呈波浪状弯曲变性，窦内皮细胞胞浆呈泡状突起脱落，线粒体肿胀。

第6天骨髓内血细胞数量少，细胞膜不规整，核内异染色质凝集成块状。

第8天骨髓内血细胞较前增多，细胞膜不规整，胞浆中内质网扩张，线粒体肿胀明显，峭减少，甚则成大泡状。

徐振晔等[4]用C57BL/ 6J小鼠模型组(生理盐水组)腹腔注射环磷酰胺100 mg/ kg/ d，连续注射3天。

免疫抑制模型的建立及其免疫功能检测孟庆东（吉林大学白求恩医学院，长春130000）摘要：目的：利用环磷酰胺（CTX）抑制小鼠的免疫力，建立免疫抑制模型，并检测其免疫功能。

方法:分别对注射了生理盐水的小鼠（对照组）和注射了卵清蛋白的小鼠（实验组）隔日连续腹腔注射环磷酰胺（100mg/kg）4次，再注射卵清蛋白加强免疫后，通过淋巴细胞转化试验（细胞免疫）、吞噬实验（吞噬细胞功能）、酶联免疫吸附试验（ELISA）（体液免疫）、双向琼脂扩散试验（体液免疫）检测小鼠免疫功能的变化。

结果：淋转实验结果全为阴性，吞噬实验仅一组对照为阳性，ELISA实验结果仅一组对照为阳性，双扩实验结果仅一组对照为阳性。

结论：只有体液免疫的实验中有两项阳性结果，此次试验失败，未能证明环磷酰胺对小鼠免疫功能的抑制效果。

关键词：环磷酰胺免疫抑制模型免疫功能检测ImmunosuppressionModel AndThe Establishment OfImmuneFunction TestingObjective: To use of cyclophosphamide (CTX) inhibiting mice immunity, the establishment of immunosuppression model, and test the immune function. Methods: Respectively on the physiological saline injection (control group) and mice injected with the egg albumin in mice (experimental group) alternate days continuous celiac injection cyclophosphamide (100 mg/kg) four times, reinject ovalbumin strengthen immunity, through the lymphocyte transformation test (cellular immune), the devouring experiment (macrophage abilities), enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA) (humoral immunity), double AGAR diffusion test (humoral immunity) test the change of immune functions in mice. Results: The tube turn experimental results for all negative, devouring experiment is only a group of control for positive, ELISA experimental results only a group of control for positive, double expanding experimental results only a group of control for positive. Conclusion: Only the humoral immune experiments have two positive results .The test failure, failed to prove cyclophosphamide on immune function in mouse inhibitory effect.keywords:cyclophosphamide; immunosuppression die; immune function testing 环磷酰胺是一种烷化剂，1958年首次人工合成，主要用于肿瘤免疫，对多种肿瘤有明显的抑制作用，已有研究显示CTX具有抑制小鼠肝癌的作用，能够明显促进肝癌细胞的凋亡[1]。

单次大剂量㊁多次小剂量环磷酰胺腹腔注射构建小鼠免疫抑制模型对比观察李燕华ꎬ梁月琴ꎬ夏洪颖ꎬ王崇静ꎬ李仲昆昆明市延安医院ꎬ昆明６５００５１㊀㊀摘要:目的㊀对比观察单次大剂量㊁多次小剂量环磷酰胺(ＣＹ)腹腔注射构建小鼠免疫抑制模型的效果ꎮ方法㊀３０只ＩＣＲ健康雄性小鼠随机分为单次组㊁多次组㊁对照组各１０只ꎬ单次组在实验第７天腹腔注射１００ｍｇ/ｋｇ的ＣＹꎬ多次组在实验第１㊁３㊁５㊁７ｄ腹腔注射５０ｍｇ/(ｋｇ ｄ)的ＣＹꎬ对照组在实验第１㊁３㊁５㊁７ｄ腹腔注射等量生理盐水ꎮ比较各组小鼠体质量㊁脾脏指数㊁胸腺指数㊁ＰＰｓ计数㊁ＣＤ３＋细胞比例㊁ＣＤ１９＋细胞比例㊁肠道黏膜ＳＩｇＡ含量ꎮ结果㊀与空白组比较ꎬ单词组实验第８ｄ及多次组实验第３㊁５㊁７㊁８ｄ体质量降低(Ｐ均<０.０５)ꎻ与多次组比较ꎬ单次组实验第３㊁５㊁７㊁８ｄ体质量升高(Ｐ均<０.０５)ꎮ与空白组比较ꎬ单词组和多次组脾脏指数㊁胸腺指数降低(Ｐ均<０.０５)ꎻ与多次组比较ꎬ单次组脾脏指数㊁胸腺指数降低(Ｐ均<０.０５)ꎮ与空白组比较ꎬＰＰｓ计数㊁ＣＤ１９＋细胞比例㊁肠道黏膜ＳＩｇＡ含量降低ꎬＣＤ３＋细胞比例升高(Ｐ均<０.０５)ꎻ与多次组比较ꎬ单词组ＰＰｓ计数㊁ＣＤ１９＋细胞比例㊁肠道黏膜ＳＩｇＡ含量降低ꎬＣＤ３＋细胞比例升高(Ｐ均<０.０５)ꎮ结论㊀单次大剂量和多次小剂量的ＣＹ均可建立免疫抑制动物模型ꎬ前者对小鼠体质量影响更小ꎬ且造模效果佳ꎮ㊀㊀关键词:环磷酰胺ꎻ动物模型ꎻ免疫抑制模型㊀㊀ｄｏｉ:１０.３９６９/ｊ.ｉｓｓｎ.１００２￣２６６Ｘ.２０２０.０３.０１１㊀㊀中图分类号:Ｒ９６５㊀㊀文献标志码:Ａ㊀㊀文章编号:１００２￣２６６Ｘ(２０２０)０３￣００４２￣０５ＣｏｍｐａｒｉｓｏｎｏｆｉｍｍｕｎｏｓｕｐｐｒｅｓｓｉｖｅｅｆｆｅｃｔｓｏｆｓｉｎｇｌｅｈｉｇｈｄｏｓｅａｎｄｍｕｌｔｉｐｌｅｌｏｗｄｏｓｅｃｙｃｌｏｐｈｏｓｐｈａｍｉｄｅａｂｄｏｍｉｎａｌｉｎｊｅｃｔｉｏｎｉｎｅｓｔａｂｌｉｓｈｉｎｇｉｍｍｕｎｏｓｕｐｐｒｅｓｓｉｏｎｍｏｕｓｅｍｏｏｌｅｌｓＬＩＹａｎｈｕａꎬＬＩＡＮＧＹｕｅｑｉｎｇꎬＸＩＡＨｏｎｇｙｉｎｇꎬＷＡＮＧＣｏｎｇｊｉｎｇꎬＬＩＺｈｏｎｇｋｕｎＹａｎᶄａｎＨｏｓｐｉｔａｌｏｆＫｕｎｍｉｎｇＣｉｔｙꎬＫｕｎｍｉｎｇ６５００５１ꎬＣｈｉｎａ基金项目:昆明市卫生科技人才培养项目(２０１６ＳＷＲＣ)ꎮ通信作者:李仲昆(Ｅ￣ｍａｉｌ:ｙａｙｙｌｚｋ＠１６３.ｃｏｍ)[１１]ＶｉｔｏｒａｔｏｕＤＩꎬＴｏｌｉａＭꎬＬｉａｋｏｓＰꎬｅｔａｌ.Ｃｌｉｎｉｃａｌｖａｌｕｅｏｆｓｉｇｎｉｆｉ￣ｃａｎｃｅｏｆｈｙｐｏｘｉａｉｎｄｕｃｉｂｌｅＦａｃｔｏｒ￣１αꎬｇｌｕｃｏｓｅｔｒａｎｓｐｏｒｔｅｒ￣１ａｎｄｃａｒｂｏｎｉｃａｎｈｙｄｒａｓｅＩＸｉｎｒｅｃｔａｌｃａｎｃｅｒａｆｔｅｒｐｒｅｏｐｅｒａｔｉｖｅｃｈｅｍｏｒａ￣ｄｉｏｔｈｅｒａｐｙ[Ｊ].ＪＢｕｏｎꎬ２０１９ꎬ２４(２):４５６￣４６３.[１２]熊艳峰ꎬ赖晓红ꎬ梁桦ꎬ等.七氟醚对单肺通气大鼠肺癌ＨＩＦ１α/ＥＭＴ通路活性及侵袭力的影响[Ｊ].实用医学杂志ꎬ２０１８ꎬ３４(１２):１９７０￣１９７２.[１３]ＬｉＹＸꎬＤｉｎｇＳＪꎬＸｉａｏＬꎬｅｔａｌ.Ｄｅｓｆｅｒｏｘａｍｉｎｅｐｒｅｃｏｎｄｉｔｉｏｎｉｎｇｐｒｏｔｅｃｔｓａｇａｉｎｓｔｃｅｒｅｂｒａｌｉｓｃｈｅｍｉａｉｎｒａｔｓｂｙｉｎｄｕｃｉｎｇｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎｓｏｆｈｙｐｏｘｉａｉｎｄｕｃｉｂｌｅｆａｃｔｏｒ１ａｌｐｈａａｎｄｅｒｙｔｈｒｏｐｏｉｅｔｉｎ[Ｊ].ＮｅｕｒｏｓｃｉＢｕｌｌꎬ２００８ꎬ２４(２):８９￣９５.[１４]ＣｈｅｎＹꎬＦａｎＺꎬＬｉａｏＬꎬｅｔａｌ.Ｅｆｆｅｃｔａｎａｌｙｓｉｓｏｆｈｙｐｅｒｂａｒｉｃｏｘｙｇｅｎｔｈｅｒａｐｙｗｉｔｈｍｅｔｈｙｌｐｒｅｄｎｉｓｏｌｏｎｅｏｎｐｒｅｖｅｎｔｉｏｎｏｆｓｐｉｎａｌｃｏｒｄｉｓｃｈｅ￣ｍｉａ￣ｒｅｐｅｒｆｕｓｉｏｎｉｎｊｕｒｙ[Ｊ].ＪＣｏｌｌＰｈｙｓｉｃｉａｎｓＳｕｒｇＰａｋꎬ２０１９ꎬ２９(１０):１０１６￣１０１７.[１５]蒋智永ꎬ胡子健ꎬ孟承颖ꎬ等.ＨＩＦ￣１α对大鼠内皮细胞通透性的影响及作用机制[Ｊ].安徽医科大学学报ꎬ２０１９ꎬ５４(７):１６０１￣１０６５.[１６]ＺｈｏｕＹꎬＦａｔｈａｌｉＮꎬＬｅｋｉｃＴꎬｅｔａｌ.Ｒｅｍｏｔｅｌｉｍｂｉｓｃｈｅｍｉｃｐｏｓｔｃｏｎ￣ｄｉｔｉｏｎｉｎｇｐｒｏｔｅｃｔｓａｇａｉｎｓｔｎｅｏｎａｔａｌｈｙｐｏｘｉｃ￣ｉｓｃｈｅｍｉｃｂｒａｉｎｉｎｊｕｒｙｉｎｒａｔｐｕｐｓｂｙｔｈｅｏｐｉｏｉｄｒｅｃｅｐｔｏｒ/Ａｋｔｐａｔｈｗａｙ[Ｊ].Ｓｔｒｏｋｅꎬ２０１１ꎬ４２(２):４３９￣４４４.[１７]孙志超.胃癌中ＨＩＦ￣１α㊁ＶＥＧＦ和ＥＧＦＲ的表达及临床病理意义[Ｊ].齐齐哈尔医学院学报ꎬ２０１８ꎬ３９(２４):２８５６￣２８５９. [１８]ＫｉｔａｕｒａＪꎬＭｕｋａｉＳꎬＭｏｒｉｍｏｔｏＨꎬｅｔａｌ.Ｍｅｄｉａｓｔｉｎａｌｈｅｍａｔｏｍａａｆ￣ｔｅｒｉｎｔｒａｖｅｎｏｕｓｔｈｒｏｍｂｏｌｙｔｉｃｔｈｅｒａｐｙｆｏｒｃｅｒｅｂｒａｌｉｎｆａｒｃｔｉｏｎｉｎａｐａ￣ｔｉｅｎｔｗｉｔｈａｈｉｓｔｏｒｙｏｆｔｏｔａｌａｏｒｔｉｃａｒｃｈｒｅｐｌａｃｅｍｅｎｔ[Ｊ].ＫｙｏｂｕＧｅ￣ｋａꎬ２０１９ꎬ７２(９):６７３￣６７６.[１９]ＬｉｕＢＮꎬＨａｎＢＸꎬＬｉｕＦ.ＮｅｕｒｏｐｒｏｔｅｃｔｉｖｅｅｆｆｅｃｔｏｆｐＡｋｔａｎｄＨＩＦ￣１αｏｎｉｓｃｈｅｍｉａｒａｔｓ[Ｊ].ＡｓｉａｎＰａｃＪＴｒｏｐＭｅｄꎬ２０１４ꎬ７(３):２２１￣２２５.[２０]ＣｈｅｎｇＺꎬＬｉＬꎬＭｏＸꎬｅｔａｌ.Ｎｏｎ￣ｉｎｖａｓｉｖｅｒｅｍｏｔｅｌｉｍｂｉｓｃｈｅｍｉｃｐｏｓｔｃｏｎｄｉｔｉｏｎｉｎｇｐｒｏｔｅｃｔｓｒａｔｓａｇａｉｎｓｔｆｏｃａｌｃｅｒｅｂｒａｌｉｓｃｈｅｍｉａｂｙｕｐ￣ｒｅｇｕｌａｔｉｎｇＳＴＡＴ３ａｎｄｒｅｄｕｃｉｎｇａｐｏｐｔｏｓｉｓ[Ｊ].ＩｎｔＪＭｏｌＭｅｄꎬ２０１４ꎬ３４(４):９５７￣９６６.(收稿日期:２０１９￣１０￣１４)２４㊀㊀Ａｂｓｔｒａｃｔ:Ｏｂｊｅｃｔｉｖｅ㊀Ｔｏｃｏｍｐａｒｅｔｈｅｅｆｆｅｃｔｓｏｆｓｉｎｇｌｅｈｉｇｈｄｏｓｅａｎｄｍｕｌｔｉｐｌｅｌｏｗｄｏｓｅｃｙｃｌｏｐｈｏｓｐｈａｍｉｄｅ(ＣＹ)ａｂ￣ｄｏｍｉｎａｌｉｎｊｅｃｔｉｏｎｉｎｅｓｔａｂｌｉｓｈｉｎｇｔｈｅａｐｐｒｏｐｒｉａｔｅｉｍｍｕｎｏｓｕｐｐｒｅｓｓｉｏｎｍｏｕｓｅｍｏｄｅｌｓ.Ｍｅｔｈｏｄｓ㊀ＴｈｉｒｔｙｈｅａｌｔｈｙｍａｌｅＩＣＲｍｉｃｅｗｅｒｅｒａｎｄｏｍｌｙｄｉｖｉｄｅｄｉｎｔｏｔｈｅｃｏｎｔｒｏｌｇｒｏｕｐꎬｓｉｎｇｌｅｄｏｓｅｇｒｏｕｐꎬａｎｄｍｕｌｔｉｐｌｅｄｏｓｅｇｒｏｕｐꎬｒｅｓｐｅｃｔｉｖｅｌｙ.ＴｈｅｍｉｃｅｉｎｔｈｅｓｉｎｇｌｅｄｏｓｅｇｒｏｕｐｗｅｒｅｉｎｔｒａｐｅｒｉｔｏｎｅａｌｌｙｉｎｊｅｃｔｅｄｗｉｔｈＣＹ１００ｍｇ/ｋｇｏｎｔｈｅ７ｔｈｄａｙꎬｔｈｅｍｉｃｅｉｎｍｕｌｔｉｐｌｅｄｏｓｅｇｒｏｕｐｗｅｒｅｉｎｔｒａｐｅｒｉｔｏｎｅａｌｌｙｉｎｊｅｃｔｅｄｗｉｔｈＣＹ５０ｍｇ/(ｋｇ ｄ)ｏｎｔｈｅ１ｓｔꎬ３ｒｄꎬ５ｔｈａｎｄ７ｔｈｄａｙｓꎬｗｈｉｌｅｔｈｅｍｉｃｅｉｎｔｈｅｃｏｎｔｒｏｌｇｒｏｕｐｗｅｒｅｉｎｔｒａｐｅｒｉｔｏｎｅａｌｌｙｉｎｊｅｃｔｅｄｗｉｔｈｎｏｒｍａｌｓａｌｉｎｅｏｎｔｈｅｔｈｅ１ｓｔꎬ３ｒｄꎬ５ｔｈａｎｄ７ｔｈｄａｙｓ.ＴｈｅｂｏｄｙｗｅｉｇｈｔꎬｖｉｓｃｅｒａｌｉｎｄｅｘꎬｔｈｙｍｕｓｉｎｄｅｘꎬＰＰｓｃｏｕｎｔꎬｔｈｅｐｒｏｐｏｒｔｉｏｎｏｆＣＤ３＋ꎬｔｈｅｐｒｏｐｏｒｔｉｏｎｏｆＣＤ１９＋ａｎｄｉｎｔｅｓｔｉｎａｌｍｕｃｏｓａＳＩｇＡｃｏｎｔｅｎｔｏｆｍｉｃｅｗｅｒｅｃｏｍｐａｒｅｄｂｅｔｗｅｅｎｇｒｏｕｐｓ.Ｒｅｓｕｌｔｓ㊀Ｃｏｍｐａｒｅｄｗｉｔｈｔｈｅｂｌａｎｋｇｒｏｕｐꎬｔｈｅｂｏｄｙｗｅｉｇｈｔｏｆｔｈｅｍｉｃｅｉｎｔｈｅｓｉｎｇｌｅｄｏｓｅｇｒｏｕｐｏｎｔｈｅ８ｔｈｄａｙａｎｄｉｎｔｈｅｍｕｌｔｉｐｌｅｄｏｓｅｇｒｏｕｐｏｎｔｈｅ３ｒｄꎬ５ｔｈꎬ７ｔｈａｎｄ８ｔｈｄａｙｓｄｅｃｒｅａｓｅｄ(ａｌｌＰ<０.０５).Ｃｏｍｐａｒｅｄｗｉｔｈｔｈｅｂｌａｎｋｇｒｏｕｐꎬｔｈｅｖｉｓｃｅｒａｉｎｄｅｘａｎｄｔｈｙｍｕｓｉｎｄｅｘｄｅｃｒｅａｓｅｄｉｎｔｈｅｓｉｎｇｌｅｄｏｓｅｇｒｏｕｐａｎｄｍｕｌｔｉｐｌｅｄｏｓｅｇｒｏｕｐ(ｂｏｔｈＰ<０.０５)ꎻｃｏｍｐａｒｅｄｗｉｔｈｔｈｅｍｕｌｔｉｐｌｅｄｏｓｅｇｒｏｕｐꎬｔｈｅｖｉｓｃｅｒａｉｎｄｅｘａｎｄｔｈｙｍｕｓｉｎｄｅｘｄｅｃｒｅａｓｅｄｉｎｔｈｅｓｉｎｇｌｅｄｏｓｅｇｒｏｕｐ(ｂｏｔｈＰ<０.０５).ＣｏｍｐａｒｅｄｗｉｔｈｔｈｅｂｌａｎｋｇｒｏｕｐꎬｔｈｅｉｎｔｅｓｔｉｎａｌｍｕｃｏｓａＰＰｓꎬｐｒｏｐｏｒｔｉｏｎｏｆＣＤ１９＋ａｎｄｉｎｔｅｓｔｉ￣ｎａｌｍｕｃｏｓａＳＩｇＡｉｎｔｈｅｓｉｎｇｌｅｄｏｓｅｇｒｏｕｐａｎｄｍｕｌｔｉｐｌｅｄｏｓｅｇｒｏｕｐｄｅｃｒｅａｓｅｄｓｉｇｎｉｆｉｃａｎｔｌｙꎬａｎｄｔｈｅｐｒｏｐｏｒｔｉｏｎｏｆＣＤ３＋ｉｎ￣ｃｒｅａｓｅｄ(ａｌｌＰ<０.０５).ＣｏｍｐａｒｅｄｗｉｔｈｔｈｅｍｕｌｔｉｐｌｅｄｏｓｅｇｒｏｕｐꎬｔｈｅｉｎｔｅｓｔｉｎａｌｍｕｃｏｓａＰＰｓꎬｐｒｏｐｏｒｔｉｏｎｏｆＣＤ１９＋ａｎｄｉｎ￣ｔｅｓｔｉｎａｌｍｕｃｏｓａＳＩｇＡｄｅｃｒｅａｓｅｄｓｉｇｎｉｆｉｃａｎｔｌｙꎬａｎｄｔｈｅｐｒｏｐｏｒｔｉｏｎｏｆＣＤ３＋ｉｎｃｒｅａｓｅｄｉｎｔｈｅｓｉｎｇｌｅｄｏｓｅｇｒｏｕｐ(ａｌｌＰ<０.０５).Ｃｏｎｃｌｕｓｉｏｎ㊀ＢｏｔｈｔｈｅｓｉｎｇｌｅｈｉｇｈｄｏｓｅａｎｄｍｕｌｔｉｐｌｅｌｏｗｄｏｓｅｓｏｆＣＹｃａｎｅｓｔａｂｌｉｓｈａｎｉｍａｌｍｏｄｅｌｓｏｆｉｍｍｕｎｏｓｕｐ￣ｐｒｅｓｓｉｏｎꎬａｎｄｔｈｅｆｏｒｍｅｒｈａｓｌｅｓｓｉｎｆｌｕｅｎｃｅｏｎｂｏｄｙｗｅｉｇｈｔａｎｄｂｅｔｔｅｒｍｏｄｅｌｉｎｇｅｆｆｅｃｔ.Ｋｅｙｗｏｒｄｓ:ｃｙｃｌｏｐｈｏｓｐｈａｍｉｄｅꎻａｎｉｍａｌｍｏｄｅｌｓꎻｉｍｍｕｎｏｓｕｐｐｒｅｓｓｉｏｎｍｏｄｅｌｓ㊀㊀免疫器官㊁免疫细胞和免疫分子共同组成了免疫系统ꎬ是对抗感染和肿瘤至关重要的因素[１]ꎮ近年来ꎬ由环境污染㊁生态失衡等所引发的免疫抑制性疾病的发病率逐年上升ꎬ而建立适合的免疫抑制模型对进一步研究该类疾病尤为重要[２]ꎮ环磷酰胺(ＣＹ)是一种抗肿瘤药物ꎬ其也具有显著的免疫抑制作用[３]ꎬ是治疗免疫疾病的常用药物ꎬ特别在作为联合应用的免疫调节剂和抗肿瘤药物方面已广泛应用[４ꎬ５]ꎮＣＹ在抑制癌细胞增殖的同时ꎬ也抑制免疫细胞的增殖ꎬ可造成机体免疫应答(包括体液免疫和细胞免疫)的全面抑制ꎮ因此ꎬ许多国家和国际机构均推荐ＣＹ作为免疫毒性的阳性物[６~８]ꎮ采用ＣＹ建立免疫抑制模型的方法常采用单次大剂量(１００㊁１５０ｍｇ/ｋｇ)和多次小剂量[２０㊁４０㊁８０ｍｇ/ (ｋｇ ｄ)]两种给药方法ꎬ但是较大剂量[８０ｍｇ/ (ｋｇ ｄ)]腹腔连续注射３ｄ后可造成实验后期动物的死亡[９]ꎮ为减少实验动物的病死率ꎬ提高造模的成功率ꎬ为免疫抑制实验模型的建立提供参考ꎬ本研究采用单次大剂量注射和小剂量多次注射的给药方法制备小鼠免疫抑制模型ꎬ并对小鼠的体质量及末次注射ＣＹ后２４ｈ的脏器指数㊁肠道黏膜派氏结(ＰＰｓ)计数㊁肠道黏膜ＰＰｓ淋巴细胞表型㊁肠道黏膜ＳＩｇＡ含量等免疫指标进行比较ꎬ旨在为选择ＣＹ制备免疫抑制模型时的合适剂量提供参考ꎮ１㊀材料与方法１.１㊀实验动物㊀ＳＰＦ级ＩＣＲ雄性小鼠３０只ꎬ６~８周龄ꎬ体质量(２０ʃ２)ｇꎬ购自湖南斯莱克景达实验动物有限公司ꎬ动物许可证号ＳＣＸＫ(湘)２０１１￣０００３ꎮ１.２㊀药物㊁试剂及仪器㊀０.９％氯化钠注射液(四川科伦药业股份有限公司ꎬ生产批号ａｄ１６０２０１ｂ２)ꎻ注射用ＣＹ(江苏盛迪医药有限公司生ꎬ批号１７１０２５２５)ꎻＤＡＢ试剂盒(北京中杉金桥生物科技有限公司)ꎮ抗小鼠ＣＤ３ｅ￣ＦＩＴＣ㊁抗小鼠ＣＤ１９￣ＰＥ㊁ＣＤ６９￣ＰＥ￣ＣＹＴＭ７(美国ＢＤ￣Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎ公司ꎬ批号分别为５５３０６２㊁５５７３９９㊁５５２８７９)ꎻＡｎｔｉ￣ＴＬＲ４ａｎｔｉｂｏｄｙ试剂盒(Ａｂｃａｍ公司ꎬ批号ＧＲ３２５０３４￣５)ꎻ胎牛血清(ＦＢＳ)(法国Ｂｉｏｗｅｓｔ公司ꎬ批号０２０４１３￣ＵＹ)ꎻ改良型ＲＰＭＩ１６４０培养基[赛默飞世尔生物化学制品(北京)有限公司ꎬ批号ＮＡＣ１３６１]ꎮＦＡＣＳＣａｌｉｂｕｒ流式细胞仪(ＦＣ￣５００)(美国Ｂｅｃｋｍａｎ公司)ꎻ全自动酶标仪Ｍｏｄｅｌ５５０(美国ＢＩＯ￣ＲＡＤ公司)ꎻＬＥＧＥＮＤＭＩＣＲＯ１７台式微量离心机(美国Ｔｈｅｒｍｏ公司)ꎻ倒置相差显微镜(ＢＤＳ２００)(重庆奥特光学仪器有限责任公司)ꎻＴＤ５Ｍ低速多管架自动平衡离心机(长沙万佳森仪器设备有限责任公司)ꎻ光学显微镜(Ｎｉｋｏｎ５０ｉ):日本Ｎｉｋｏｎ公司ꎻＦＡ２００４电子分析天平(上海精密科学仪器有限公司)ꎻ血球计数板(上海市求精生化试剂仪器有限公司)ꎻＣｅｌｌＳｔｒａｉｎｅｒ(１００μｍꎬ７０μｍ)(美国Ｆａｌ￣ｃｏｎ公司)ꎻ眼科剪㊁眼科镊ꎮ１.３㊀实验动物分组及免疫抑制模型制备㊀将ＩＣＲ健康雄性小鼠适应性暂养１周后ꎬ称重㊁标记ꎬ后随机分为单次组㊁多次组㊁对照组各１０只ꎮ单次组在实验第７天腹腔注射１００ｍｇ/ｋｇ的ＣＹꎬ多次组在实验第１㊁３㊁５㊁７ｄ腹腔注射５０ｍｇ/(ｋｇ ｄ)的ＣＹꎬ以免疫抑制模型ꎻ对照组在实验第１㊁３㊁５㊁７ｄ腹腔注射等量生理盐水ꎮ各注射后自由取食饮水ꎮ３４１.４㊀小鼠体质量测定㊀采用电子秤测定实验第１㊁３㊁５㊁７㊁８ｄ每只小鼠的体质量ꎬ并记录ꎮ１.５㊀小鼠处死及相关指标测定㊀实验第８ｄꎬ以颈椎脱臼法处死小鼠３０只ꎬ按下列步骤测定小鼠脏器指数㊁肠黏膜ＰＰｓ计数㊁肠黏膜ＣＤ３＋㊁ＣＤ１９＋细胞比例测算㊁小鼠肠道黏膜ＳＩｇＡꎮ１.５.１㊀小鼠脏器指数测定㊀沿胸部和腹部中线切开小鼠ꎬ按解剖位置摘取脾脏和胸腺ꎬ小心剔除其周围的筋膜及组织ꎬ滤纸吸干残余的血液后进行称重(ｇ)ꎬ将称得的重量(ｇ)除以小鼠体质量(ｇ)ꎬ计算胸腺指数和脾脏指数ꎬ脾脏指数(％)＝脾脏重量(ｇ)/小鼠体质量ˑ１００ꎬ胸腺指数(％)＝胸腺重量(ｇ)/小鼠体质量ˑ１００ꎮ１.５.２㊀小鼠肠黏膜ＰＰｓ计数㊀打开小鼠腹腔ꎬ取出全段小肠ꎬ迅速放入含有５％胎牛血清(５％ＦＢＳ)的ＲＰＭＩ１６４０液的培养皿中ꎬ剔除肠系膜及肠黏膜表面的脂肪组织ꎬ在外肠壁上可看见麦粒样的圆形突起ꎬ即为ＰＰｓ[１０]ꎬ肉眼计数并记录ＰＰｓ数目ꎮ１.５.３㊀小鼠肠黏膜ＣＤ３＋细胞比例㊁ＣＤ１９＋细胞比例测算㊀ＰＰｓ淋巴细胞获取及表型测定肉眼计数并记录ＰＰｓ数目完成后ꎬ将小鼠肠腔冲洗干净ꎬ迅速放入含５％ＦＢＳ的ＲＰＭＩ１６４０液的培养皿中ꎻ用眼科镊和眼科剪小心分离出ＰＰｓꎻ将其浸入含５％ＦＢＳ的ＲＰ￣ＭＩ１６４０液的培养皿中ꎬ先用５％ＦＢＳ的ＲＰＭＩ１６４０液浸润１２０目细胞筛ꎬ并将ＰＰｓ小心移入细胞筛中ꎬ用研磨棒以适当的力度轻轻研磨ꎬ再用５％ＦＢＳ的ＲＰ￣ＭＩ１６４０液冲洗细胞筛过滤ꎻ以上滤液用２００目细胞筛过滤ꎻ收集滤液ꎬ加至５ｍＬꎬ以２０００ｒ/ｍｉｎ速度离心１０ｍｉｎꎬ弃上清液ꎬ加入５％ＦＢＳ的ＲＰＭＩ１６４０液约３ｍＬꎬ重悬细胞即得ＰＰｓ细胞悬液ꎮ将收集到的ＰＰｓ细胞计数并调节细胞浓度至１ˑ１０７/ｍＬꎬ分别取１００μＬ细胞加入流式检查专用试管中进行荧光标记ꎬ每管依次加入抗小鼠ＣＤ３ｅ￣ＦＩＴＣ㊁ＣＤ１９￣ＰＥ单克隆抗体各０.５μｇꎬ混匀后４ħ避光孵育３０ｍｉｎꎬ用ＰＢＳ洗涤细胞两次(１５００ｒ/ｍｉｎꎬ５ｍｉｎ)ꎬ弃上清ꎬ用ＰＢＳ３００μＬ重悬后进行流式细胞仪检测[１０]ꎮ１.５.４㊀小鼠肠道黏膜ＳＩｇＡ测定㊀取出全段小肠ꎬ用带有灌胃针的１０ｍＬ注射器向肠腔内注入ＮＳ约３ｍＬꎬ并在小肠内保留３ｍｉｎꎬ轻轻晃动使肠腔内的内容物充分溶解ꎬ将肠腔内灌洗液收集于ＥＰ管中ꎬ以３０００ｒ/ｍｉｎ的速度离心１０ｍｉｎꎬ收集上清液于冻存管ꎬ－８０ħ储存ꎬ编号备用ꎮ待样本收齐后ꎬ严格按酶联免疫技术(ＥＬＩＳＡ)鼠ＳＩｇＡ试剂盒说明书操作[１０]ꎬ即取１００μＬ不同浓度梯度的标准品㊁样品㊁阳性对照品和空白分别加入酶标板ꎬ３７ħ孵育２ｈꎻ用拍板纸拍干板子ꎬ不洗板ꎻ提前２０ｍｉｎ配制Ｄｅｔｅｃ￣ｔｉｏｎｒｅａｇｅｎｔＡ工作液ꎻ加入１００μＬＤｅｔｅｃｔｉｏｎｒｅａｇｅｎｔＡ工作液到酶标板ꎬ轻轻震荡混匀ꎬ３７ħ孵育６０ｍｉｎꎻ洗板３次ꎻ每个孔加３００μＬ１ˑ洗液工作液放置２ｍｉｎ后用拍板纸拍干板子ꎻ提前２０ｍｉｎ配制ＤｅｔｅｃｔｉｏｎｒｅａｇｅｎｔＢ工作液ꎻ加入１００μＬＤｅｔｅｃｔｉｏｎｒｅａｇｅｎｔＢ工作液到酶标板ꎬ轻轻震荡混匀ꎬ３７ħ避光孵育３０ｍｉｎꎻ洗板５次ꎻ加入９０ｌ显色底物(ＴＭＢ)到酶标板ꎬ轻轻震荡混匀ꎬ３７ħ避光孵育１５ｍｉｎꎻ加入５０μＬ终止液到酶标板ꎬ轻轻震荡混匀ꎬ用酶标仪在４５０ｎｍ处检测标准品和样本ＯＤ值ꎻ以ＯＤ值为纵坐标ꎬ以标准品浓度为横坐标ꎬ绘制标准曲线ꎬ根据ＯＤ值在标准曲线上查出浓度ꎮ１.６㊀统计学方法㊀采用ＳＰＳＳ２３.０统计软件ꎮ计量资料以 ｘʃｓ表示ꎬ组间比较采用单因素方差分析ꎮＰ<０.０５为差异有统计学意义ꎮ２㊀结果２.１㊀不同时点各组小鼠体质量比较㊀不同时点小鼠体质量比较见表１ꎮ表１㊀不同时点各组小鼠体质量比较(ｇꎬ ｘʃｓ)细胞体质量实验第１ｄ实验第３ｄ实验第５ｄ实验第７ｄ实验第８ｄ单次组２１.４２ʃ０.２８２２.８３ʃ０.２８ｂ２４.０９ʃ０.３２ｂ２５.４４ʃ０.３７ｂ２５.１３ʃ０.３８ａｂ多次组２１.３３ʃ０.３０２２.３６ʃ０.２７ａ２３.４０ʃ０.３４ａ２４.４２ʃ０.２４ａ２４.８２ʃ０.２３ａ空白组２１.４６ʃ０.３３２２.９２ʃ０.３２２４.０７ʃ０.６４２５.２３ʃ０.４９２５.７５ʃ０.１９㊀㊀注:与空白组比较ꎬａＰ<０.０５ꎻ与多次组比较ꎬｂＰ<０.０５ꎮ２.２㊀各组脾脏指数㊁胸腺指数比较㊀脾脏指数㊁胸腺指数比较见表２ꎮ２.３㊀各组肠黏膜ＰＰｓ计数㊁ＣＤ３＋细胞比例㊁ＣＤ１９＋细胞比例㊁肠道黏膜ＳＩｇＡ含量比较㊀肠黏膜ＰＰｓ计数㊁ＣＤ３＋细胞比例㊁ＣＤ１９＋细胞比例㊁肠道黏膜ＳＩｇＡ含量比较见表３ꎮ表２㊀各组脾脏指数㊁胸腺指数比较(％ꎬ ｘʃｓ)组别脾脏指数胸腺指数单次组０.２７ʃ０.０２ａｂ０.０７ʃ０.０１ａｂ多次组０.３６ʃ０.０２ａ０.１１ʃ０.０４ａ空白组０.４６ʃ０.０３０.１７ʃ０.０５㊀㊀注:与空白组比较ꎬａＰ<０.０５ꎻ与多次组比较ꎬｂＰ<０.０５ꎮ４４表３㊀各组肠黏膜ＰＰｓ计数㊁ＣＤ３＋细胞比例㊁ＣＤ１９＋细胞比例㊁肠道黏膜ＳＩｇＡ含量比较( ｘʃｓ)组别ＰＰｓ计数(个)ＣＤ３＋细胞比例(％)ＣＤ１９＋细胞比例(％)肠道黏膜ＳＩｇＡ含量(μｇ/ｍＬ)单次组４.７０ʃ０.４８ａｂ５５.３７ʃ４.９５ａｂ４５.１１ʃ５.３６ａｂ２２.７３ʃ３.２７ａｂ多次组５.９０ʃ０.７４ａ４８.８５ʃ２.６８ａ５１.１６ʃ４.８１ａ３２.４７ʃ３.２９ａ空白组７.３０ʃ０.８２３８.６９ʃ４.１７６１.４０ʃ５.１５４０.８６ʃ２.９４㊀㊀注:与空白组比较ꎬａＰ<０.０５ꎻ与多次组比较ꎬｂＰ<０.０５ꎮ３㊀讨论㊀㊀免疫系统的各种细胞㊁组织和器官的组成成分和功能的正常是机体免疫功能的基本保证ꎬ任何一方面的缺陷都将导致免疫功能障碍ꎮ机体自发㊁病原或药物㊁营养因素㊁环境因素均可引起免疫系统的功能异常ꎬ进而导致功能障碍㊁免疫应答和保护功能的降低或消失ꎬ最后引发机体丧失抵抗感染能力或形成免疫性疾病ꎬ容易受到细菌㊁病毒㊁真菌等感染ꎬ甚至容易长肿瘤[１１~１３]ꎮ目前ꎬ对免疫抑制性疾病的治疗主要以调整机体的自身免疫功能为主ꎬ免疫增强剂在医学上的应用已经引起了人们的广泛关注[１４]ꎮ中药免疫增强剂是目前使用较多的免疫增强剂ꎬ它可激活免疫活性细胞ꎬ增强机体的免疫功能ꎻ还可作为辅助药物与一些疫苗合用ꎬ增强免疫应答ꎬ提高免疫效应ꎻ主要用于一些免疫功能缺陷及难治性感染ꎮ但其仅在动物饲料添加中使用较为广泛ꎻ在临床使用方面ꎬ受到一定的限制ꎬ需要进入深入的研究开发[１５]ꎮ为此ꎬ建造安全有效的免疫抑制动物模型显得尤为重要ꎮ在生命科学研究中ꎬ免疫抑制动物模型建造的主要方法包括去胸腺动物模型㊁基因敲除动物模型㊁辐射损伤模型和免疫抑制剂模型等[１６~１８]ꎬ其中使用免疫抑制剂进行建模的方法由于总体成本较低㊁操作简便并且重复性好ꎬ因此在目前的研究中广泛应用ꎮ用于建立免疫抑制动物模型的免疫抑制剂包括微生物酵解产物类㊁激素类㊁抗代谢物类㊁抗体类㊁烷化剂类等ꎬ其中烷化剂类免疫抑制剂是建立的免疫抑制模型研究中最常用的方法ꎮ烷化剂按化学结构可分为氮芥类㊁磺酸酯及多元醇类㊁亚硝基脲类㊁三氮烯咪唑类和胼类㊁乙撑亚胺类ꎮ㊀㊀ＣＹ是一种抗肿瘤药物ꎬ对白血病和实体瘤都有效ꎬ是第一个所谓 潜伏化 广谱抗肿瘤药ꎮＣＹ是一种无活性的前药ꎬ在氮芥部分上连有一个吸电子的环状磷酰基ꎬ降低了烷基化的能力ꎬ体外几乎无活性ꎬ当其进入人体后ꎬ被肝脏或肿瘤内存在的过量的磷酰胺酶或磷酸酶水解ꎬ变为活化作用型的磷酰胺氮芥而起作用的氮芥类衍生物ꎮ磷酰胺氮芥作为烷化剂的一种在体内能和细胞的蛋白质和核酸相结合ꎬ使蛋白质和核酸失去正常的生理活性ꎬ发挥其抑制肿瘤细胞生长的作用ꎬ同时由于其非特异性ꎬ也会产生针对骨髓㊁胃肠道上皮和生殖系统等生长旺盛的细胞毒性ꎻ此外ꎬ还对免疫器官和敏感的淋巴细胞产生影响ꎬ进而对免疫功能产生明显抑制ꎮ可用于乳腺癌㊁恶性淋巴瘤ꎬ多发性骨髓瘤㊁白血病㊁卵巢癌㊁宫颈癌㊁前列腺癌㊁结肠癌㊁支气管癌㊁肺癌等肿瘤的化疗ꎻ还可作为免疫抑制剂用于各种自身免疫性疾病ꎬ如天疱疮以及溃疡性结肠炎㊁严重类风湿性关节炎㊁全身性红斑狼疮㊁多发性肉芽肿㊁特发性血小板减少性紫癜㊁儿童肾病综合征等ꎬ以及用于器官移植时抗排斥反应[１９~２３]ꎮＣＹ因其效果稳定㊁较易获得同时成本不高ꎬ常用于建立免疫抑制模型并有较多的文献报道ꎬ因而被广泛接受并应用于药物药效学评价和安全性评价ꎮ㊀㊀文献[６]报道ꎬ实验动物腹腔注射ＣＹ后ꎬ可导致动物体质量不同程度的降低ꎬ这与使用ＣＹ的剂量和时间有关ꎬ尤其是在注射后的第１周ꎬ但大剂量单次注射体质量明显高于小剂量连续注射组ꎮ与空白组比较ꎬ单词组实验第８天及多次组实验第３㊁５㊁７㊁８天体质量降低ꎻ与多次组比较ꎬ单次组实验第３㊁５㊁７㊁８天体质量升高ꎮ脾脏是机体最大的外周免疫器官ꎬ当抗原刺激机体后ꎬ免疫细胞(Ｔ细胞㊁Ｂ细胞和巨噬细胞)过度增生ꎬ导致其体积增大ꎻ胸腺是机体的中枢免疫器官ꎬ是Ｔ细胞分化成熟的场所ꎻ而机体免疫抑制时ꎬ使得淋巴组织萎缩ꎬ免疫器官的体积缩小ꎮ故免疫器官的脏器指数体现了其发育情况ꎬ可间接的反映机体的免疫状态ꎮ本研究显示ꎬ单次组和多次组均出现了脾脏指数和胸腺指数的降低ꎬ且单次组较多次组明显ꎬ间接说明两组实验动物均存在免疫抑制ꎬ且单次组较多次组明显ꎮＰＰｓ是沿着小肠纵向分布位于膜系膜固有层和黏膜下层的微小淋巴样组织ꎬ含有胸腺源性Ｔ细胞和Ｂ细胞ꎬ其中心区域富含Ｂ细胞ꎬ是诱导肠道黏膜进行免疫应答的重要部位ꎬＰＰｓ淋巴细胞数量和活性状态等可以反映肠道黏膜局部的免疫功能状态ꎮＣＤ３＋Ｔ淋巴细胞代表总的Ｔ淋巴细胞ꎬ而ＣＤ１９＋是Ｂ淋巴细胞表面抗原ꎬ除了浆细胞外的Ｂ细胞谱系所有发育阶段都有ＣＤ１９分布ꎬＣＤ１９也是ＣＤ１９/ＣＤ２１/ＣＤ８１信号复合物的重要组成部分ꎬ故ＣＤ１９＋代表了ＰＰｓ内除了浆细胞外的Ｂ细胞谱系不同发育阶段Ｂ细胞的总和ꎮ在既往的研究中ꎬ不同的ＣＹ造模实验５４均可导致Ｔ淋巴细胞㊁Ｔｈ细胞㊁Ｔｓ细胞比例升高ꎬＢ淋巴细胞比例下降[６]ꎮ本文发现ꎬ单次组和多次组均出现了ＣＤ３＋细胞比例升高ꎬＣＤ１９＋细胞比例降低ꎬ且单次组较多次组更为明显ꎬ进一步说明两组实验动物均存在免疫抑制ꎬ造模成功且单次组效果更佳ꎮ有研究[９ꎬ２４]表明ꎬ大剂量ＣＹ(１００ｍｇ/ｋｇ)制造免疫抑制模型效果更佳ꎻ在连续腹腔注射ＣＹ的动物模型中ꎬ４０ｍｇ/(ｋｇ ｄ)和６０ｍｇ/(ｋｇ ｄ)的用量均可完成免疫抑制模型的成功造模[２５]ꎬ但后者的效果优于前者ꎮ康慧琳等[２６]发现ꎬ高剂量ＣＹ通过抑制ＤＮＡ的复制㊁促进细胞凋亡ꎬ降低免疫细胞功能ꎬ使机体处于免疫抑制状态ꎮ免疫效应分子ＳＩｇＡ由肠道黏膜固有层浆细胞分泌ꎬ是机体内分泌量最大的免疫球蛋白ꎬ也是肠黏膜表面主要的免疫球蛋白ꎬ对消化道黏膜起着重要防御作用ꎬ当ＣＹ免疫引起抑制时ꎬ可引起肠道粘膜ＳＩｇＡ水平下降[２７]ꎮ本研究中ꎬ肠道粘膜ＳＩｇＡ的含量也出现了相同的变化趋势ꎬ且以单次组更为明显ꎮ㊀㊀总之ꎬ单次大剂量和多次小剂量的ＣＹ均可建立免疫抑制动物模型ꎬ前者对体质量影响更小㊁造模效果更佳ꎮ参考文献:[１]ＬｉｎｄｓａｙＢ.Ｔｈｅｉｍｍｕｎｅｓｙｓｔｅｍ[Ｊ].ＥｓｓａｙｓＢｉｏｃｈｅｍꎬ２０１６ꎬ６０(３):２７５￣３０１.[２]钟金凤ꎬ方热军.环磷酰胺免疫抑制机制及在动物模型上的应用[Ｊ].中国免疫学杂志ꎬ２０１６ꎬ３２(１０):１５４１￣１５４５. 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环磷酰胺诱导的小鼠骨髓抑制模型及中药对其防治作用机制研究进展王成龙;赵东峰;杨志烈;贾友冀;常君丽;王拥军;杨燕萍【摘要】Patients with chemotherapy-induced myelosuppression is prone to infection or bleeding,which has a serious impact on their treatment,prognosis and quality of life and even endangers life and leads patients and their family to suffering.In recent years,traditional Chinese medicine in preventing and treating chemotherapy-induced myelosuppression have gradually garnered increasing attention.As the animal model of myelosuppression is being established,applied and mature,research on mechanism of Chinese meteria medica in preventing and treating chemotherapy-induced myelosuppression has made great achievements,showing the advantages and prospect of Chinese meteria medica in the treatment of this disease.%化疗后骨髓抑制容易导致患者发生感染或出血,严重影响患者治疗、预后和生命质量,甚至危及生命,给患者及家属带来很大痛苦.中医药防治化疗导致骨髓抑制越来越受到重视.随着骨髓抑制动物模型的建立、应用和成熟,中药防治化疗导致骨髓抑制机制的研究也取得许多进展,显出中药治疗的优势和前景.【期刊名称】《世界中医药》【年(卷),期】2017(012)009【总页数】6页(P2252-2257)【关键词】环磷酰胺;化疗;骨髓抑制;小鼠模型;机制研究【作者】王成龙;赵东峰;杨志烈;贾友冀;常君丽;王拥军;杨燕萍【作者单位】上海中医药大学附属龙华医院脊柱病研究所,上海,200032;上海中医药大学附属龙华医院科技中心实验室,上海,200032;上海中医药大学附属龙华医院脊柱病研究所,上海,200032;上海中医药大学附属龙华医院脊柱病研究所,上海,200032;滨州医学院中西医结合学院,烟台,264003;上海中医药大学附属龙华医院脊柱病研究所,上海,200032;上海交通大学医学院附属瑞金医院骨科,上海,200025;上海中医药大学附属龙华医院脊柱病研究所,上海,200032;上海中医药大学附属龙华医院脊柱病研究所,上海,200032;上海中医药大学附属龙华医院脊柱病研究所,上海,200032【正文语种】中文【中图分类】R285.5化疗是肿瘤治疗的重要手段,骨髓抑制是化疗最常见的不良反应,严重影响化疗进行,使临床疗效降低。

不同剂量环磷酰胺对小鼠免疫功能抑制作用的研究李璐;黄宏业;韦现色;王秋华;杨善忠;何家康;杨剑;胡庭俊【摘要】The aims of the present study were to observe the immunosuppression effect of cyclophosphamide with different dosage regimen on mice and to explore the method for establishing immunosuppression model induced by cyclophosphamide in mice. Single or multiple doses of cyclophosphamide were intraperitoneally injected in mice. The immune organ index, serous level of alanine aminotransferase, aspartate aminotransferase, urea nitrogen and creatinine, blood leukocyte count, and splenic lymphocyte transformation were determined to evaluate the effect of cyclophosphamide on immunity and hepatic and renal function of mice. The results showed that both the multiple administration of 10, 20, 30, 40 mg/ (kg·BW) of cyclophosphamide for consecutive seven days respectively and single administration of 150 mg/ (kg·BW) of cyclophosphamide exhibited immunosuppression effect on mice and caused the changes of indicators associated with hepatic and renal function;the immunosuppression effect produced by multiple administration with lower dosage of cyclophosphamide was superior to that produced by single administration with higher dosage, and the immunosuppression effect was improved with the increase of dosage under multiple administration mode. The combined data suggest that the immunosuppression model in mice can be established by multiple administration of 30-40 mg/(kg·BW) of cyclophosphamide for consecutiveseven days.%旨在观察不同剂量及不同给药方式下环磷酰胺对健康小鼠的免疫抑制作用，探索建立小鼠环磷酰胺免疫抑制模型的方法。

不同途径和剂量环磷酰胺建立小鼠免疫抑制模型的对比研究一、本文概述本文旨在对比研究不同途径和剂量环磷酰胺在小鼠免疫抑制模型建立中的应用效果。

环磷酰胺作为一种免疫抑制剂，在医学研究和药物开发中具有广泛应用。

然而，关于其最佳使用途径和剂量在不同免疫抑制模型中的研究尚未得出一致结论。

因此，本文通过对小鼠进行不同途径和剂量的环磷酰胺处理，对比其免疫抑制效果，以期为相关研究提供参考。

本研究将采用不同途径（如腹腔注射、静脉注射等）和不同剂量（如低剂量、中剂量、高剂量）的环磷酰胺处理小鼠，观察其免疫功能的变化。

通过对比分析各组小鼠的免疫指标（如淋巴细胞数量、细胞因子水平等），评估不同处理条件下的免疫抑制效果。

本研究还将关注环磷酰胺处理对小鼠生存状况的影响，以确保实验结果的可靠性和实用性。

通过本文的研究，我们期望能够明确不同途径和剂量环磷酰胺在小鼠免疫抑制模型建立中的优劣，为相关领域的研究提供有力支持。

本研究还将为环磷酰胺在临床应用中的剂量选择和给药途径提供理论依据，推动其在免疫治疗领域的发展。

二、材料与方法选用健康、雄性、6-8周龄的C57BL/6小鼠，体重在20-25g之间，购自北京华阜康生物科技股份有限公司。

小鼠饲养在恒温（22±2℃）、恒湿（55±5%）、光照周期12h/12h的环境中，自由饮水和摄食。

所有动物实验均按照《实验动物管理条例》进行，并得到了伦理委员会的批准。

环磷酰胺（Cyclophosphamide，CT）购自Sigma-Aldrich公司。

小鼠免疫球蛋白G（IgG）购自北京博奥森生物技术有限公司。

其他常用试剂如生理盐水、PBS等均为国产分析纯。

实验所用仪器包括：电子天平、微量移液器、离心机、酶标仪、流式细胞仪等。

将小鼠随机分为4组，每组10只。

分别给予不同剂量和途径的环磷酰胺处理：组1（对照组，Ctrl）：生理盐水腹腔注射；组2（低剂量CT组，Low-CT）：CT 50mg/kg腹腔注射；组3（中剂量CT组，Medium-CT）：CT 100mg/kg腹腔注射；组4（高剂量CT组，High-CT）：CT 200mg/kg腹腔注射。

Chinese Journal of Veterinary Medicine中国兽医杂志㊀2019年(第55卷)第2期环磷酰胺构建动物免疫抑制模型的研究进展伍维高,钟金凤(湖南环境生物职业技术学院,湖南衡阳421005)中图分类号:O571.21+1㊀㊀㊀㊀㊀文献标志码:A㊀㊀㊀㊀㊀文章编号:05296005(2019)02008703收稿日期:20180528基金项目:湖南省教育厅项目(16C0563);湖南省科技厅项目(2017JJ5026)作者简介:伍维高(1979-),男,畜牧师,硕士,研究方向为动物繁殖与生产,E-mail:30942422@通讯作者:钟金凤,E-mail:498379002@㊀㊀近几年来,动物疫病肆意流行,免疫接种成为预防传染病的有效措施之一,而免疫反应过程相当复杂,诸多因素会影响接种效果,如免疫抑制性疾病㊁不良的饲养环境㊁微量元素和蛋白质的缺乏等,常导致免疫接种失败,给生产带来不可挽回的重大损失㊂为提高机体抗病力,增强动物免疫力,免疫增强剂得以广泛运用㊂为了进一步研究此类制剂,人为构建免疫抑制模型的研究手段得到了诸多研究者的青睐㊂而环磷酰胺(Cyclophosphamide,CTX),以其诱导动物产生免疫抑制作用效果显著,且成本低廉,越来越广泛地运用到制备动物免疫抑制模型中㊂为此,本文对环磷酰胺构建免疫抑制模型进行综述㊂1㊀环磷酰胺的药理作用经口服或静脉注射的环磷酰胺主要在肝脏进行代谢,生成低毒性的4-羟基环磷酰胺和醛磷酰胺,分布全身,进一步降解为磷酰氮芥㊁丙烯醛和去甲氮芥,结合于快速生长细胞的DNA 上,产生强烈的细胞毒性㊂极少部分可进一步氧化成4-酮环磷酰胺和羧基环磷酰胺,无毒性,随尿排出[1]㊂2㊀CTX 免疫抑制机理2.1㊀环磷酰胺对免疫基因的影响2.1.1㊀抑制抗菌蛋白基因表达㊀内源性抗菌蛋白是天然免疫的重要组成部分,其中杀菌/渗透增强蛋白(Bactericidal /permeability increasing protein,BPI)㊁防御素(Defensins,DF)以及血小板型磷脂酶A 2(Phospholipase A 2,PLA 2)备受关注[2]㊂大鼠连续5d 腹腔注射环磷酰胺40mg /kg㊃bw,对照组注射等体积生理盐水,结果显示,对照组大鼠的睾丸㊁附睾㊁胸腺㊁肝㊁小肠㊁大肠6种器官均表达BPI㊁β-DF-1㊁血小板型PLA 2;而环磷酰胺组胸腺㊁肝无BPI 表达,睾丸㊁胸腺㊁肝无β-DF-1表达,睾丸㊁胸腺无血小板型PLA 2表达,其他有表达的组织中其含量比对照组低[3],试验提示,环磷酰胺可抑制体内抗菌蛋白基因表达㊂2.1.2㊀影响免疫相关基因的表达㊀环磷酰胺对免疫相关基因有一定影响㊂经环磷酰胺处理的荷瘤鼠脾脏㊁骨髓和血浆相关多种免疫调节因子基因上调,包括危险信号㊁模式识别受体㊁炎症介质㊁生长因子㊁细胞因子㊁趋化因子和趋化因子受体[4]㊂通过基因芯片技术检测环磷酰胺干预的胚胎干细胞发现:自体免疫激活和移植排斥相关基因如CD 3㊁CD 28㊁CTLA 4㊁MHC II ㊁PRF 1㊁GZMB 和IL-2R 基因下调,而免疫相关受体基因如IL 1R 2㊁IL 18R 1和FLT 3上调[5]㊂2.2㊀环磷酰胺对动物转录水平的影响2.2.1㊀抑制骨髓细胞相关mRNA 表达㊀环磷酰胺诱导骨髓抑制,造成骨髓细胞(BM)降低㊂雄性昆明种小鼠连续3d 腹腔注射150mg /kg㊃d 环磷酰胺,7d 后采骨髓细胞通过Real time PCR 检测发现,试验组BM 细胞钙敏感受体(Calcium-sensing recep-tor,CaSR)和丝裂素活化蛋白激酶(Mitogen-activa-ted protein kinase,MAPK)mRNA 水平极显著高于对照组(P <0.01),引起BM 造血干细胞㊁间充质干细胞和内皮祖细胞增殖㊁分化和动员产生明显障碍[6]㊂2.2.2㊀调节细胞凋亡相关mRNA 表达㊀环磷酰胺对细胞凋亡的影响主要体现在两方面:增加促凋亡基因mRNA 表达而抑制抗凋亡基因mRNA 表达,从而诱导细胞凋亡㊂SPF 级NIH 雄性小鼠于试验期第9㊁11㊁13天腹腔注射环磷酰胺10mg /kg,于14d㊁28d 取脾脏采用半定量RT-PCR 检测促凋亡基因-Caspase-9mRNA 和抗凋亡基因-B 淋巴细胞基因2(B-cell lymphonma gene 2,BCL-2)的表达,两次结果均显示,模型组Caspase-9mRNA 表达较对照组显著升高而BCL-2mRNA 表达显著降低[7]㊂8~12周远78中国兽医杂志㊀2019年(第55卷)第2期Chinese Journal of Veterinary Medicine交系昆明种小鼠腹腔注射环磷酰胺100mg/kg,1次/d,连续3d,第10天取小鼠脾脏测定凋亡相关基因,结果显示,BAX(Bcl-2associated X protein)mR-NA表达水平明显上升,而BCL-2mRNA表达明显下降[8]㊂2.2.3㊀降低免疫相关受体mRNA表达㊀环磷酰胺可降低免疫相关受体mRNA的表达㊂树突状细胞相关C-型凝集素-1(Dectin-1)和Toll样受体(Toll-like receptor,TLR)主要表达在免疫细胞上,为免疫相关受体,与免疫状态有关[9]㊂给予150mg/kg环磷酰胺的BALB/c小鼠与第4㊁7㊁9天取肺组织测定Dectin-1mRNA,结果显示,在第4㊁7天肺组织Dec-tin-1mRNA表达较对照组明显下降(P<0.05)[10]㊂24只昆明种小鼠(雌性)腹腔注射环磷酰胺150 mg/kg,4h后肺泡巨噬细胞TLR2mRNA表达与对照组相比极显著下降(P<0.01);8h后TLR4mR-NA表达极显著降低(P<0.01)[11]㊂2.2.4㊀影响免疫因子mRNA表达㊀环磷酰胺对Th1㊁Th2类细胞因子mRNA表达均有不同程度影响㊂汪祯等[12]用SPF级昆明种小鼠按50mg/kg㊃bw剂量隔日腹腔注射环磷酰胺,共7次,14d后,无菌取脾脏测定IL-2mRNA㊁IL-10mRNA,结果显示, IL-2mRNA㊁IL-10mRNA表达水平与对照组相比显著下降;易有金等[13]腹腔注射40mg/kg㊃d环磷酰胺,结果显示,脾脏和胸腺中IL-2㊁IL-10㊁IL-12㊁IL-4㊁TNF-α和IFN-γmRNA的表达量降低,以上试验提示,环磷酰胺对Th1㊁Th2类细胞因子表达均呈现下调现象[14]㊂2.3㊀环磷酰胺对动物蛋白水平的影响2.3.1㊀抑制细胞周期相关蛋白表达㊀环磷酰胺降低着丝粒蛋白B(Centromere Protein,CenpB),Cen-pB是染色体着丝粒/动粒复合体上一种最重要的功能蛋白,其特异性结合位点位于着丝粒α1-卫星DNA上17bp的CenpB盒,参与着丝粒异染色质的形成,环磷酰胺可致CenpB蛋白含量异常,致细胞无法正常分裂㊂昆明种小鼠连续7d腹腔注射50 mg/kg㊃bw环磷酰胺,5d后取血通过Western Blot-ting方法检测CenpB蛋白,其含量显著低于对照组[15]㊂2.3.2㊀增加细胞凋亡相关蛋白表达㊀环磷酰胺可通过增加细胞凋亡蛋白的表达影响Fas/Fas L系统介导的凋亡蛋白㊂SPF级ICR纯种雄性小鼠腹腔注射环磷酰胺100mg/kg㊃bw,用流式细胞术检测Fas 抗原(CD95)介导细胞凋亡的蛋白,其表达量与对照组相比显著升高[16]㊂人T淋巴细胞白血病细胞株Jurkat加入环磷酰胺3mg/L,于12㊁24㊁48h收取细胞,Western Blot检测FasL(Fas ligand,fas配体)和FADD(Floationg Point Addition,胞浆死亡信号衔接蛋白)表达,结果表明,未处理的细胞无FasL和FADD表达,而环磷酰胺处理组表达FasL和FADD,且表达水平随环磷酰胺刺激时间延长而增加[17]㊂除此,环磷酰胺能显著诱导Fas/Fas L下游蛋白Caspases产生[18],使凋亡不可逆进行㊂3　环磷酰胺在动物上的应用因环磷酰胺主要作用于快速生长细胞的DNA,并能从基因转录㊁翻译和蛋白表达等多方面产生细胞毒性㊂免疫细胞属于快速生长细胞,因此,环磷酰胺对免疫系统影响甚大,故可用环磷酰胺作为免疫抑制剂构建免疫抑制模型,这是环磷酰胺在动物上的主要用途㊂3.1㊀环磷酰胺抑制动物免疫器官㊀在环磷酰胺作用下鸡表现出形态退行性改变,包括腔上囊囊泡不发达,即腔上囊初级滤泡严重萎缩,皮质和髓质间隔不明显且滤泡间结缔组织严重增值[19]㊂Marsh J 研究发现,脾脏内正常椭球相关细胞在环磷酰胺作用后1周变为空泡[20]㊂3.2㊀环磷酰胺降低动物免疫细胞数量㊀连续3d 给7~8周龄雌性尼古拉斯火鸡注射环磷酰胺(0~ 100mg/kg㊃bw),测定血液学指标发现,环磷酰胺在初始注射后24~72h引起明显的白细胞减少㊁淋巴细胞减少㊁血小板减少和白细胞减少㊂但对单核细胞循环数㊁细胞体积㊁血浆蛋白无明显影响㊂同时,无法确定对嗜碱性粒细胞和嗜酸性粒细胞的变化,因为它们在机体内的数量微量[21]㊂3.3㊀环磷酰胺减少免疫分子产生㊀研究表明,环磷酰胺可减少免疫分子产生:用80mg/kg㊃bw环磷酰胺腹腔注射小鼠,同位素标记法显示24h和48h其肠道蛋白损失显著高于对照组,连续2d注射环磷酰胺(50mg/kg㊃bw),可造成肠黏膜SIgA损伤,肠道固有层IgA表达量减少[22]㊂环磷酰胺(10mg/ kg㊃bw)与单剂量长春新碱(0.025mg/kg㊃bw,静脉注射)和单剂量的L-天冬酰胺酶(400IU/kg㊃88Chinese Journal of Veterinary Medicine中国兽医杂志㊀2019年(第55卷)第2期bw,静脉注射)同时注射狗,3d后抗体反应受抑制[23]㊂环磷酰胺在抑制免疫系统的同时,其他新陈代谢旺盛的组织如胃肠㊁毛发等亦会受影响,因此,用环磷酰胺造模的同时,动物可出现采食量降低㊁生长性能受阻㊁毛发脱落等现象[24-25]㊂4　小结环磷酰胺主要作用快速生长细胞DNA,并从基因水平㊁转录水平和蛋白水平影响免疫系统,它可下调抗菌蛋白基因㊁免疫相关基因的表达,增加促凋亡基因mRNA和抑制抗凋亡基因mR-NA转录,降低着丝粒蛋白B含量,抑制细胞正常分裂;诱导促凋亡蛋白Caspases产生,促使凋亡不可逆进行,从而广泛引起细胞周期改变㊁诱导细胞凋亡发生,最终表现出免疫器官㊁免疫细胞和免疫分子的现象,可广泛应用在动物免疫抑制模型上㊂参考文献:[1]㊀钟金凤,方热军.环磷酰胺免疫抑制机制及在动物模型上的应用[J].中国免疫学杂志,2016,10(32):15411546. [2]㊀Calafat J,Janssen H,Tool A,et al.The bactericidal/permeabili-ty increasing protein(BPI)is present in specific guanules of hu-man eosinophilsl[J].Blood,1998,91(12):44704475. [3]㊀王昕昕,梁宁生,张炜炜,等.环磷酰胺对抗菌蛋白的影响[J].黑龙江科技信息,2014(30):45.[4]㊀Moschella F,Valentini M,AricòE.et al.Unraveling cancer che-moimmunotherapy mechanisms by gene and protein expression pro-filing of responses to cyclophosphamide[J].Cancer Res,2011, 71(10):35283539.[5]㊀El-Serafi I,Abedi-Valugerdi M,PotácováZ,et al.Cyclophosphamidealters the gene expression profile in patients treated with high doses prior to stem cell transplantation[J].PLoS One,2014,9(1):111.[6]㊀徐尚福.人参皂苷Rg1对环磷酰胺诱导骨髓抑制小鼠骨髓功能的改善及机制研究[D].遵义:遵义医学院,2009. 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环磷酰胺对小鼠免疫抑制的动物模型建立摘要:[目的]建立环磷酰胺对小鼠的免疫抑制的动物模型，从天然免疫功能和获得免疫功能两方面检测对小鼠的影响。

[方法]初次免疫设立实验组给予OVA-AL(OH)3(0.5/只)和对照组给予NS（0.5/只）；8d,10d,12d,14d分别给实验组和对照组注射NS和CTX(100mg/kg);与15d加强免疫分别注射NS和OVA-AL(OH)3(0.5/只)；22d检测免疫功能[结果]与NS-NS组相比，CTX-NS组的SI值，双向免疫及ELISA的效价无明显差别，但吞噬细胞指数及吞噬细胞百分率明显降低；与NS-OVA相比CTX-OVA组的SI 明显降低，双向免疫剂ELISA效价都降低[结论]环磷酰胺对小鼠的T淋巴细胞，B淋巴细胞以及吞噬细胞有抑制作用Abstract:[aims] To establish animal model of cyclophosphamide in mice immunosuppression , test in mice from two aspects of natural immune function and immunity function [methods] Primary immune to set up the experimental group given OVA-AL(OH)3 and The control group given NS ; the 8th,10th,12th,14th day give the experimental group NS and the control group CTX ,and the 15th strengthen the immune;the 22th test the immune function [results] Compared with NS - NS group, the SI value of CTX - NS group, bidirectional immune potency and ELISA has no obvious difference, but the phagocyte index and phagocytes percentage decreased obviously; Compared with NS - OVA CTX - SI of OVA group was obviously lower, bidirectional immune agent ELISA titer were reduced [conclusion] Cyclophosphamide in mice of T lymphocyte, B lymphocyte and phagocytes have inhibition关键词：环磷酰胺 CTX 免疫抑制动物模型淋巴细胞建立一种环磷酰胺免疫抑制小鼠模型，并将其与正常小鼠进行对照，通过检测小鼠的天然及获得免疫功能对比其改变与不同，从而可知环磷酰胺对免疫抑制的作用，有利于进一步进行对临床应用抗肿瘤的研究。