毛状根培养2

发根农杆菌诱导黄瓜毛状根的研究陈佳20072502613华南师范大学生命科学学院广州510630摘要：本实验用发根农杆菌对无菌黄瓜子叶侵染，诱导长出不定根。

并将不定根转入不同卡那霉素浓度的筛选培养基内筛选。

结果表明：MS+Cep500+Kana400的培养基筛选转化根效果最好，嫩根长出的毛状根平均长0.8cm，能明显看到黄瓜毛状根生长。

但总体上讲，黄瓜子叶的转化率并不高。

关键词：发根农杆菌；黄瓜；毛状根；卡那霉素Study on Inducing Cucumber Hairy Roots by AgrobacteriumRhizogenesChen Jia 20072502613College of Life Sciences of South China Normal University, Guangzhou, 510630 Abstract:The cucumber cotyledons were infected respectively by agrobacterium rhizogenes R160 and induced to grow adventitious roots. The results showed that the medium contain 400mg/L kanamycin have the best effect on screening the transformated one .It’s obvious that some hairy roots have growed and the average length is 0.8cm. Generally speaking, the conversion ratio is not high. Key word: Agrobacterium rhizogenes; Cucumber; Hairy Loot; Kanamycin含有Ri质粒的发根农杆菌对植物的侵染也是自然界存在的天然植物遗传转化系统。

一、实验目的1. 了解毛状根的生物学特性及生长规律。

2. 掌握毛状根的培养方法及实验操作技能。

3. 探究不同培养基、温度、光照等条件对毛状根生长的影响。

二、实验材料1. 植物材料：紫花苜蓿品种WL-525HQ2. 发根农杆菌：LBA9402、R16013. 培养基：MS培养基、1/2MS培养基、1/4MS培养基4. 药品与试剂：抗生素、温度计、pH计、紫外灯、移液器、培养皿、无菌操作台等三、实验方法1. 发根农杆菌的培养与活化：将发根农杆菌接种于含有抗生素的LB培养基中，37℃恒温培养过夜。

次日，将菌液按1:100的比例稀释，涂布于含有抗生素的LB培养基平板上，37℃恒温培养过夜，获得单菌落。

2. 外植体准备：将紫花苜蓿品种WL-525HQ的茎段剪成1-2cm长，用70%乙醇消毒30秒，无菌水冲洗3次，再用0.1%氯化汞消毒10分钟，无菌水冲洗5次，最后将茎段切成0.5cm长的小段。

3. 毛状根诱导：将外植体接种于含有发根农杆菌的培养基中，置于28℃、光照强度为1500lx的培养箱中培养。

每隔3天更换一次培养基，持续培养30天。

4. 培养基筛选：将诱导出的毛状根分别接种于MS培养基、1/2MS培养基、1/4MS培养基中，观察毛状根的生长情况。

5. 温度、光照条件探究：将毛状根分别置于不同温度（20℃、25℃、30℃）和光照强度（1000lx、1500lx、2000lx）的培养箱中培养，观察毛状根的生长情况。

6. 数据统计与分析：对毛状根的生长情况（长度、直径、分枝数等）进行统计与分析。

四、实验结果1. 发根农杆菌培养结果：在含有抗生素的LB培养基平板上，成功获得单菌落。

2. 外植体诱导结果：接种外植体后，部分外植体在培养基上形成了毛状根。

3. 培养基筛选结果：在1/2MS培养基中，毛状根生长情况最好，长度、直径、分枝数均较高。

4. 温度、光照条件探究结果：在25℃、1500lx条件下，毛状根生长情况最佳。

药用植物毛状根的诱导及其应用植物毛状根培养是植物组织培养中的一种，因其不仅克服了植物生长缓慢、有效成分积累有限的不足，且具有不依赖外源植物激素等优点，近年来研究较多。

文章介绍了目前药用植物毛状根的诱导情况，并总结了植物毛状根培养体系在次生代谢物的生产、生物合成机制及调控基因的研究、植物基因工程、生物转化以及药物蛋白中的应用，旨在为其他药用植物毛状根的培养及利用提供参考依据。

标签：毛状根；药用植物；次生代谢产物；发根农杆菌；生物转化1 药用植物毛状根的诱导1.1 毛状根的发根机制毛状根（hairy roots）是发根农杆菌Agrobacterium rhizogenes感染植物后，在植株创伤表面诱导产生的一种特殊表现型。

早在1907年，Smith和Townsend 就发现发根农杆菌能够诱导植物产生毛状根，此后，学者们发现无论是发根农杆菌还是根癌农杆菌A. tumefaciens，其致病原因均是由大分子质粒引起的[1-2]，但发根农杆菌的致病质粒与其他Ti质粒（根瘤诱导质粒）功能既有差异又有联系[3]。

直到1982年，美国科学家Chilton[4]发表文章阐述其发根机制：发根农杆菌中Ri质粒上T-DNA进入宿主植物细胞引发了毛状根的产生。

Ri质粒是发根农杆菌染色体外的一个约250 kb的大质粒，其上面存在2个与转化有关的功能区，即T-DNA（转移区）和Vir（致病区）。

T-DNA的主要功能是在转化时进入植物细胞并插入到寄主植物基因组中，表达决定毛状根生长和冠瘿碱合成的基因；Vir区的作用是协助T-DNA区完成转化。

Vir区上有7个操纵子VirA-G，轉化时，植物伤口产生小分子酚类化合物与VirA的表达产物结合，激活其他Vir基因，使T-DNA被剪切、转移并最终整合到宿主细胞基因组中。

因此，单子叶植物不能合成特异性小分子酚类化合物是其难以被侵染诱导出毛状根的主要原因[5-7]。

1.2 药用植物毛状根诱导情况目前，已有近百种药用植物成功诱导出毛状根，总结发现其中76%为草本植物，也有少量藤本及木本植物，比例分别占到7%，17%；在植物学分类方面，已诱导出毛状根的药用植物科属分类较为分散，其中豆科、茄科、菊科和唇形科占有相对较大的比例（表1）。

黄芩毛状根培养体系的研究-Ⅱ黄芩（Radix scutellariae）是一种常用的中药材，其根具有较高的药用价值。

然而，由于黄芩的生长环境限制和人工种植困难，进一步研究黄芩的栽培技术成为重要的任务之一。

近年来，细胞培养技术的发展为黄芩栽培提供了新的途径。

在前期研究的基础上，本文将探讨黄芩毛状根培养体系的研究进展。

首先，本文选取了适合黄芩毛状根生长的培养基。

经过多次试验和改良，最终确定了一种富含植物生长调节剂的培养基配方，包括激素、氮源、炭源和无机盐等组分。

通过调整培养基的配方和浓度，使黄芩毛状根的生长得到了明显提升。

其次，本文研究了不同生长因子对黄芩毛状根生长的影响。

实验结果显示，外源植物生长调节剂对黄芩毛状根的生长具有显著的促进作用。

特别是生长素和赤霉素等植物生长调节剂，在一定浓度范围内，能够增加黄芩毛状根的长度和数量。

此外，光照、温度和湿度等环境因素也对黄芩毛状根的生长具有一定影响。

然后，本文探究了适宜黄芩毛状根生长的体外条件。

通过调整培养器的容积和通气量，优化了黄芩毛状根的培养条件。

结果表明，黄芩毛状根在较小的培养器中生长得更好，而过高或过低的通气量会影响其生长速度和品质。

此外，本文还研究了黄芩毛状根的营养需求和抗病性等方面的问题，为进一步改进黄芩毛状根培养体系提供了科学依据。

最后，本文对黄芩毛状根培养体系的应用前景进行了展望。

黄芩毛状根不仅可以作为中药材使用，还可以用于提取有效成分制备药物。

目前已有一些研究表明，黄芩毛状根具有一定的抗菌和抗炎作用，对多种疾病具有治疗效果。

因此，通过进一步研究和优化黄芩毛状根培养体系，有望提高其产量和质量，为黄芩的应用开发提供更多可能性。

综上所述，黄芩毛状根培养体系的研究具有重要的意义和应用价值。

通过不断优化培养条件和培养技术，有望提高黄芩毛状根的产量和质量，满足人们对黄芩的需求。

此外，黄芩毛状根的应用前景广阔，将为中药材的开发和利用带来新的机遇和挑战。

热带作物学报2020, 41(8): 1535 1542Chinese Journal of Tropical Crops丛枝菌根真菌与胡萝卜毛状根双重培养体系研究张金莲1,2，刘金华3，包涵4，李冬萍1，宋娟1，黄京华4*，陈廷速1*1. 广西农业科学院微生物研究所，广西南宁 530007；2. 厦门大学公共卫生学院，福建厦门 361102；3. 浙江养生堂天然药物研究所有限公司，浙江杭州 310007；4. 广西大学农学院，广西南宁 530001摘要：以发根农杆菌（Agrobacterium rhizogenes）K599诱导胡萝卜产生毛状根，接种丛枝菌根（AM）真菌摩西斗管囊霉（Funneliformis mosseae）建立双重培养体系，研究不同消毒方法、超声波、低温预处理和培养基pH对摩西斗管囊霉孢子萌发的影响及其与胡萝卜毛状根建立双重培养体系的最佳条件。

研究结果表明：消毒方法3孢子萌发率最高，孢子污染率最低，15 d孢子萌发率达48.88%，而污染率仅为9.98%；超声波处理能降低孢子污染率11.17%~14.53%；低温预处理可有效提高孢子的萌发率，4 ℃低温处理10 d和15 d效果较好，其萌发率分别为70%和65%；AM真菌孢子在水琼脂培养基萌发最佳pH为6.5，萌发率达到48.50%，pH<5.5或pH>8.0均抑制孢子萌发，pH 5.5和pH 8.0的萌发率分别为15.43%和16.06%。

消毒孢子先于水琼脂萌发后，再挑取萌发管多，菌丝较长的孢子并将菌丝生长方向正对毛状根方向进行转接，可以提高双重培养的成功率。

MSR培养基为双重培养的最优培养基。

胡萝卜毛状根与AM真菌双重培养可为菌根真菌繁殖及相关分子机理研究提供可行有效的途径。

关键词：胡萝卜毛状根；发根农杆菌；丛枝菌根真菌；摩西斗管囊霉；双重培养中图分类号：S154.3 文献标识码：AA Study to Develop an in Vitro Dual Culture System with Carrot Hairy Roots and Arbuscular Mycorrhizal FungiZHANG Jinlian1,2, LIU Jinhua3, BAO Han4, LI Dongping1, SONG Juan1, HUANG Jinghua4*,CHEN Tingsu1*1. Microbiology Institute, Guangxi Academy of Agricultural Sciences, Nanning, Guangxi 530007, China;2. Public Health Care College, Xiamen University, Xiamen, Fujian 361102, China;3. Zhejiang Yangshengtang Institute of Natural Medication Coopration, Hangzhou, Zhejiang 310007, China;4. College of Agronomy, Guangxi University, Nanning, Guangxi 530001, ChinaAbstract: Agrobacterium rhizogenes K599 was used to induce carrot hair roots. An in vitro dual culturing system with Funneliformis mosseae and carrot hairy roots was then developed, and factors including methods to obtain ax-enic, supersonic processing, chilling treatment and medium pH that might affect both AM fungal spores germination and dual culturing were optimized. It was found that the third axenic method resulted in the highest germination rate (48.88%) and the lowest contamination rate (9.98%) at 15 days. Supersonic processing helped reduce AM fungal spores’ contamination by 11.17% to 14.53%, while a chilling pretreatment at 4 ℃ for 10 days and 15 days increased the germination rate of AM fungal spores to 70% and 65%, respectively. In water agar, the highest germination rate was achieved at a pH of 6.5 (48.50%), whereas spore germination was inhibited when pH was lower than 5.5 or higher than 8.0, with germination rate decreased to 15.43% at pH 5.5 and 16.06% at pH 8.0. Furthermore, it was found that the success rate of dual culturing was enhanced when sterilized spores were first germinated on agar medium and long hy-phae were then selected for inoculation with their extension direction towards the growth direction of the carrot root. The MSR medium was found to be optimal for dual culture. The successful in vitro dual culture of carrot hairy roots and收稿日期 2019-09-20；修回日期 2019-11-06基金项目 国家自然科学基金项目（No. 31760137）；广西自然科学基金重点项目（No. 2019GXNSFDA245013）；广西科技基地和人才专项（桂科AD16380054）。

药用植物毛状根的诱导及其应用植物毛状根培养是植物组织培养中的一种，因其不仅克服了植物生长缓慢、有效成分积累有限的不足，且具有不依赖外源植物激素等优点，近年来研究较多。

文章介绍了目前药用植物毛状根的诱导情况，并总结了植物毛状根培养体系在次生代谢物的生产、生物合成机制及调控基因的研究、植物基因工程、生物转化以及药物蛋白中的应用，旨在为其他药用植物毛状根的培养及利用提供参考依据。

标签：毛状根；药用植物；次生代谢产物；发根农杆菌；生物转化1 药用植物毛状根的诱导1.1 毛状根的发根机制毛状根（hairy roots）是发根农杆菌Agrobacterium rhizogenes感染植物后，在植株创伤表面诱导产生的一种特殊表现型。

早在1907年，Smith和Townsend 就发现发根农杆菌能够诱导植物产生毛状根，此后，学者们发现无论是发根农杆菌还是根癌农杆菌A. tumefaciens，其致病原因均是由大分子质粒引起的[1-2]，但发根农杆菌的致病质粒与其他Ti质粒（根瘤诱导质粒）功能既有差异又有联系[3]。

直到1982年，美国科学家Chilton[4]发表文章阐述其发根机制：发根农杆菌中Ri质粒上T-DNA进入宿主植物细胞引发了毛状根的产生。

Ri质粒是发根农杆菌染色体外的一个约250 kb的大质粒，其上面存在2个与转化有关的功能区，即T-DNA（转移区）和Vir（致病区）。

T-DNA的主要功能是在转化时进入植物细胞并插入到寄主植物基因组中，表达决定毛状根生长和冠瘿碱合成的基因；Vir区的作用是协助T-DNA区完成转化。

Vir区上有7个操纵子VirA-G，轉化时，植物伤口产生小分子酚类化合物与VirA的表达产物结合，激活其他Vir基因，使T-DNA被剪切、转移并最终整合到宿主细胞基因组中。

因此，单子叶植物不能合成特异性小分子酚类化合物是其难以被侵染诱导出毛状根的主要原因[5-7]。

1.2 药用植物毛状根诱导情况目前，已有近百种药用植物成功诱导出毛状根，总结发现其中76%为草本植物，也有少量藤本及木本植物，比例分别占到7%，17%；在植物学分类方面，已诱导出毛状根的药用植物科属分类较为分散，其中豆科、茄科、菊科和唇形科占有相对较大的比例（表1）。