第六章毛状根培养

浅谈Ri质粒介导的毛状根技术在获得人参药用成分研究中的应用-论文【关键词】人参；,Ri质粒；毛状根【关键词】人参；Ri质粒；毛状根Ri质粒介导的毛状根技术是20世纪80年代后期，在植物细胞培养技术领域中发展起来的一项新技术。

它是将发根农杆菌含有的Ri质粒中的TDNA片段整合到植物细胞的DNA上，诱导出毛状根，从而建立起毛状根培养系统用于次生代谢物的生产［1］。

由于Ri质粒转化的毛状根具有生长快、易于培养、有用成分高、代谢通路表达完整的特点［２］，在利用生物技术生产药用植物有效成分领域，显示出极大的应用潜力和广阔的发展前景。

在利用Ri质粒介导的毛状根技术生产人参皂苷、人参多糖等次生代谢物方面已经做了大量的研究。

本文就该方面的研究作一综述。

1Ri质粒转化形成毛状根的机制［3~7］Ri质粒是位于发根农杆菌染色体之外的独立的双链环状DNA，一般在180～250kb之间，具有2个非常主要的功能区：TDNA区（TransferredDNAregion）和Vir区（virulanceregion）。

农杆碱型Ri质粒上的TDNA是不连续的，分为TLDNA和TR-DNA。

TRDNA上带有编码农杆碱合成酶基因（ags）和生长素合成酶基因（tms1和tms2），后者指导IAA的合成。

发根农杆菌侵染形成毛状根的过程可分为四个步骤：①发根农杆菌感染植物伤口后，受伤的植物细胞合成一种特殊的小分子化合物，如酚类化合物，从而诱导Ri质粒的Vir区基因群活化；②在Vir基因表达产生的酶的作用下，TDNA被切下；③TDNA转移到植物细胞并整合到植物基因组DNA；④TDNA在植物细胞中得到转录和翻译，发挥其机能，刺激植物细胞形成毛状根。

2Ri质粒介导的毛状根技术在获取人参药用成分研究中的应用众多的学者已经对人参毛状根体系的建立，不同的培养基成分、菌株、诱导子对毛状根生成以及对产生次生物质的影响，人参毛状根生理生化活性，利用人参毛状根合成其他药物成分以及人参毛状根的生物反应器培养等方面进行了大量的工作，为获取人参药物成分的工业化生产奠定了基础。

发根农杆菌诱导黄瓜毛状根的研究陈佳20072502613华南师范大学生命科学学院广州510630摘要：本实验用发根农杆菌对无菌黄瓜子叶侵染，诱导长出不定根。

并将不定根转入不同卡那霉素浓度的筛选培养基内筛选。

结果表明：MS+Cep500+Kana400的培养基筛选转化根效果最好，嫩根长出的毛状根平均长0.8cm，能明显看到黄瓜毛状根生长。

但总体上讲，黄瓜子叶的转化率并不高。

关键词：发根农杆菌；黄瓜；毛状根；卡那霉素Study on Inducing Cucumber Hairy Roots by AgrobacteriumRhizogenesChen Jia 20072502613College of Life Sciences of South China Normal University, Guangzhou, 510630 Abstract:The cucumber cotyledons were infected respectively by agrobacterium rhizogenes R160 and induced to grow adventitious roots. The results showed that the medium contain 400mg/L kanamycin have the best effect on screening the transformated one .It’s obvious that some hairy roots have growed and the average length is 0.8cm. Generally speaking, the conversion ratio is not high. Key word: Agrobacterium rhizogenes; Cucumber; Hairy Loot; Kanamycin含有Ri质粒的发根农杆菌对植物的侵染也是自然界存在的天然植物遗传转化系统。

苦参毛状根及愈伤组织培养研究苦参毛状根及愈伤组织培养研究植物组织培养技术是一种能够实现植物体外生长和发育的关键技术之一，对于植物根系的研究和利用具有重要意义。

本文将对苦参（Sophora flavescens Ait.）的毛状根及愈伤组织培养研究进行探讨。

苦参是一种草本植物，广泛分布于我国华北、华东、华南和西南等地区。

其根系富含多种生物碱、黄酮类化合物和皂甙等有效成分，具有抗菌、抗炎、抗肿瘤等药理活性，被广泛应用于中药制剂和功能食品中。

毛状根是苦参植物根系生长过程中形成的一种特殊结构，具有未分化的细胞和较高增殖能力。

通过毛状根培养，可以大量繁育苦参植物，并提取其有效成分。

在实验室条件下，以苦参幼苗为材料进行细胞悬浮培养、愈伤组织诱导和愈伤组织分化等步骤，可成功获得愈伤组织。

愈伤组织是在植物组织培养过程中诱导和分化的一种未分化、增殖能力强的细胞群体。

通过愈伤组织培养，可以实现大规模生产苦参有效成分的愈伤组织悬浮培养液，具有较高的药用价值。

同时，愈伤组织还可以作为研究苦参生物合成途径和代谢调控的模型系统，为深入研究苦参药理作用提供了重要工具。

本研究以苦参幼苗为材料，在适当培养基中进行毛状根和愈伤组织培养试验。

实验结果表明，通过调节培养基中植物生长调节剂的浓度和配比，可以有效诱导苦参幼苗形成毛状根和愈伤组织。

并通过显微镜观察和组织切片技术对所培养的毛状根和愈伤组织进行形态学和组织学分析。

进一步的研究发现，愈伤组织呈现出较高的细胞分裂活性和增殖能力，通过增加培养基中激素的浓度，可以进一步促进愈伤组织的增殖。

同时，对培养过程中的营养供给、光照和温度等环境因素进行优化，也对苦参毛状根和愈伤组织的形成和生长起到重要作用。

本研究为深入了解苦参植物根系的发育规律和有效成分的生物合成机制提供了重要依据。

通过组织培养技术，可以实现苦参植物的快速繁育和有效成分的大规模生产，为苦参的利用和开发提供了重要途径。

此外，本研究还为其他草本植物毛状根和愈伤组织培养技术的研究和应用提供了一定的借鉴意义综上所述，本研究通过苦参幼苗的毛状根和愈伤组织培养试验，成功诱导了苦参幼苗形成毛状根和愈伤组织，并对其进行了形态学和组织学分析。

花生毛状根诱导及其体外培养刘杰1，2，任艳2，张宗申1，袁美2*，李双铃2，禹山林2（1．大连工业大学生物工程学院，辽宁大连116034；2．山东省花生研究所，山东青岛266100）摘要［目的］优化花生毛状根诱导条件，为体外培养毛状根生产白藜芦醇以及培养花生根结线虫奠定基础。

［方法］研究不同的发根农杆菌及其菌液浓度、外植体类型、侵染时间、共培养时间、乙酰丁香酮浓度对花生毛状根诱导的影响。

［结果］发根农杆菌ACCC10060的毛状根诱导率高于ATCC11325；幼叶外植体的毛状根诱导率高于子叶；最佳侵染菌液浓度为0．2 0．4；最佳共培养时间为2d ；最佳侵染时间为10 15min ；菌液中添加75μmol /L 乙酰丁香酮（AS ）可以提高毛状根诱导率。

通过毛状根能在无激素的MS 培养上自主生长以及毛状根冠瘿碱检测，确定发根农杆菌中Ri 质粒中已整合到花生基因组中。

毛状根体外培养的研究表明，液体培养效果好于固体培养，最佳液体培养基为无激素的MS 培养基。

［结论］该研究建立的花生毛状根培养体系，将为花生转基因技术的完善及利用毛状根生产白藜芦醇和无菌的花生根结线虫提供试验基础。

关键词花生；发根农杆菌；毛状根；体外培养中图分类号S565．2文献标识码A 文章编号0517－6611（2012）06－03229－05Induction and in vitro Culture of Hairy Roots in Peanut （Arachis hypogaea L．）LIU Jie et al （School of Biological Engineering ，Dalian Polytechnic University ，Dalian ，Liaoning 116034）Abstract ［Objective ］To optimize the induction conditions of hairy roots in peanut ，so as to lay foundation for producing resveratrol and thepropagation of root-knot nematode．［Method ］Effects of different Agrobacterium rhizogenes strains ，explants type ，bacteria concentration ，co-culture time ，infection time and AS concertration on the induction of hairy roots in peanuts were studied．［Result ］Agrobacterium rhizogenes ACCC10060had higher induction rate of hairy roots than strains ATCC11325．Leaflet had higher induction rate of hairy roots than cotyledon ，the optimal bacte-ria concentration was 0．2－0．4，the optimal co-culture time was 2d ，the best infection time was 10－15min ，the dose of 75μmol /L acetosyrin-gone （AS ）could improve induction rate of hairy roots．Hairy roots could grow independently on MS medium without hormone ，and presence of o-pines from hairy roots of peanut confirmed that Ri plasmid of Agrobacterium rhizogenes was integrated into the genome of peanut．Hairy roots grewfaster in liquid culture than in solid culture ，and the optimal medium was MS liquid medium without hormone．［Conclusion ］Establishment of hairy roots culture system of peanut provided a foundation for the improvement of peanut transgenic technique ，industrial production of resveratrol and propagation of sterile root-knot nematodes．Key words Arachis hypogaea L．；Agrobacterium rhizogenes ；Hairy roots ；in vitro culture基金项目科技部作物种业科技工程（2011BAD35B04）。

一、实验目的1. 了解毛状根的生物学特性及生长规律。

2. 掌握毛状根的培养方法及实验操作技能。

3. 探究不同培养基、温度、光照等条件对毛状根生长的影响。

二、实验材料1. 植物材料：紫花苜蓿品种WL-525HQ2. 发根农杆菌：LBA9402、R16013. 培养基：MS培养基、1/2MS培养基、1/4MS培养基4. 药品与试剂：抗生素、温度计、pH计、紫外灯、移液器、培养皿、无菌操作台等三、实验方法1. 发根农杆菌的培养与活化：将发根农杆菌接种于含有抗生素的LB培养基中，37℃恒温培养过夜。

次日，将菌液按1:100的比例稀释，涂布于含有抗生素的LB培养基平板上，37℃恒温培养过夜，获得单菌落。

2. 外植体准备：将紫花苜蓿品种WL-525HQ的茎段剪成1-2cm长，用70%乙醇消毒30秒，无菌水冲洗3次，再用0.1%氯化汞消毒10分钟，无菌水冲洗5次，最后将茎段切成0.5cm长的小段。

3. 毛状根诱导：将外植体接种于含有发根农杆菌的培养基中，置于28℃、光照强度为1500lx的培养箱中培养。

每隔3天更换一次培养基，持续培养30天。

4. 培养基筛选：将诱导出的毛状根分别接种于MS培养基、1/2MS培养基、1/4MS培养基中，观察毛状根的生长情况。

5. 温度、光照条件探究：将毛状根分别置于不同温度（20℃、25℃、30℃）和光照强度（1000lx、1500lx、2000lx）的培养箱中培养，观察毛状根的生长情况。

6. 数据统计与分析：对毛状根的生长情况（长度、直径、分枝数等）进行统计与分析。

四、实验结果1. 发根农杆菌培养结果：在含有抗生素的LB培养基平板上，成功获得单菌落。

2. 外植体诱导结果：接种外植体后，部分外植体在培养基上形成了毛状根。

3. 培养基筛选结果：在1/2MS培养基中，毛状根生长情况最好，长度、直径、分枝数均较高。

4. 温度、光照条件探究结果：在25℃、1500lx条件下，毛状根生长情况最佳。