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花生毛状根诱导及其体外培养_刘杰

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不同发根农杆菌诱导花生发根研究

不同发根农杆菌诱导花生发根研究

不同发根农杆菌诱导花生发根研究作者：任艳江晨王辉等来源：《山东农业科学》2015年第01期摘要：利用5种发根农杆菌侵染不同花生外植体，对比其发根诱导率，分析寻找利于花生转化的外植体、花生品种及发根农杆菌。

结果表明，农杆菌94022诱导发根率较其它发根农杆菌高；后期继代培养中子叶诱导的发根易于培养，存活率高，生长状态好；在用培养后的子叶为外植体时，花育20较其它品种发根诱导率高。

关键词：发根农杆菌；花生；外植体；发根诱导中图分类号：S565.204.3 文献标识号：A 文章编号：1001-4942（2015）01-0014-03Abstract Five kinds of Agrobacterium rhizogenes were used to infect peanut explants and the root induction rates were contrasted to find the suitable explants， peanut varieties and A. rhizogenes for peanut transformation. The results showed that A. rhizogenes 94022 had higher root induction rate than the others. The hairy roots induced from cotyledon were easy to cultivate in the successive transfer culture with higher survival rate and good growth condition. With cultured cotyledon as explants， Huayu 20 had higher root induction rate than other peanut varieties.Key words Agrobacterium rhizogenes； Peanut； Explants； Hairy root induction发根农杆菌能诱导大多数双子叶植物和少数单子叶植物[1]，发根农杆菌所含Ri质粒的T-DNA通过整合进入植物核基因组，并稳定表达引起宿主植物发根[2]。

第六章毛状根培养

第六章毛状根培养

毛状根培养反应器
毛状根培养技术的优点
1.生长速度快
毛状根有大量的分枝和根毛, 生长快,可用于大量培养。 毛状根中的T-DNA片段上有生长 素合成酶基因。 毛状根是细胞分化而来的根组 织，属于单克隆,具有遗传稳 定性。 发根农杆菌中的Ri质粒是一个 很好的转基因载体,可把目的 基因导入植物细胞中
2.激素自养性
毛状根的培养方法
具体培养方法

固体培养
•
成批培养 连续培养

液体培养法
两相培养法
•

•
大规模发酵培养
毛状根的筛选与鉴定
筛选：选择生长速度较快、分枝较多的毛状根 株系进行扩大培养 鉴定：
形态学水平：激素自养，根丛生，多分枝
多根毛，无向地性 细胞水平：冠瘿碱的测定 （硝酸银染色）
，
毛状根培养反应器
利用发根农杆菌的Ri质粒中含有的T-DNA
整合到植物细胞上,使植物细胞诱导产生 毛状根。
2.毛状根培养体系
除菌
发根农杆菌菌株的筛选及活化
发根农杆菌菌株的类型： 农杆碱型（agropine type） 胭脂碱型 章碱型
农杆菌菌株的筛选及活化
将菌株在液体培养基上培养（含乙酰丁香酮），
激活vir区的基因，为Ri质粒的转移提供先决条件
生物技术，其次级代谢物质的生产能力遗传及生化稳定性增 加生物量的可操作性等特点都引起了人们相当大的兴趣 。 缺：目前的生物反应器还难以满足毛状根大规模培养的要求, 主要限制因素为物质的转移,毛状根生长时易成团,限制了营养 和氧气的进入。 缺：由于目前对农杆菌不同菌株间侵染物种能力的差异机理 还不够了解，并且不同物种间诱导形成毛状根的能力也不同 ，目前为止仅应用于部分的双子叶植物和少部分的单子叶植 物及裸子植物，应用范围较窄。

花生毛状根诱导及其体外培养_刘杰

花生毛状根诱导及其体外培养_刘杰

花生毛状根诱导及其体外培养刘杰1，2，任艳2，张宗申1，袁美2*，李双铃2，禹山林2（1．大连工业大学生物工程学院，辽宁大连116034；2．山东省花生研究所，山东青岛266100）摘要［目的］优化花生毛状根诱导条件，为体外培养毛状根生产白藜芦醇以及培养花生根结线虫奠定基础。

［方法］研究不同的发根农杆菌及其菌液浓度、外植体类型、侵染时间、共培养时间、乙酰丁香酮浓度对花生毛状根诱导的影响。

［结果］发根农杆菌ACCC10060的毛状根诱导率高于ATCC11325；幼叶外植体的毛状根诱导率高于子叶；最佳侵染菌液浓度为0．2 0．4；最佳共培养时间为2d ；最佳侵染时间为10 15min ；菌液中添加75μmol /L 乙酰丁香酮（AS ）可以提高毛状根诱导率。

通过毛状根能在无激素的MS 培养上自主生长以及毛状根冠瘿碱检测，确定发根农杆菌中Ri 质粒中已整合到花生基因组中。

毛状根体外培养的研究表明，液体培养效果好于固体培养，最佳液体培养基为无激素的MS 培养基。

［结论］该研究建立的花生毛状根培养体系，将为花生转基因技术的完善及利用毛状根生产白藜芦醇和无菌的花生根结线虫提供试验基础。

关键词花生；发根农杆菌；毛状根；体外培养中图分类号S565．2文献标识码A 文章编号0517－6611（2012）06－03229－05Induction and in vitro Culture of Hairy Roots in Peanut （Arachis hypogaea L．）LIU Jie et al （School of Biological Engineering ，Dalian Polytechnic University ，Dalian ，Liaoning 116034）Abstract ［Objective ］To optimize the induction conditions of hairy roots in peanut ，so as to lay foundation for producing resveratrol and thepropagation of root-knot nematode．［Method ］Effects of different Agrobacterium rhizogenes strains ，explants type ，bacteria concentration ，co-culture time ，infection time and AS concertration on the induction of hairy roots in peanuts were studied．［Result ］Agrobacterium rhizogenes ACCC10060had higher induction rate of hairy roots than strains ATCC11325．Leaflet had higher induction rate of hairy roots than cotyledon ，the optimal bacte-ria concentration was 0．2－0．4，the optimal co-culture time was 2d ，the best infection time was 10－15min ，the dose of 75μmol /L acetosyrin-gone （AS ）could improve induction rate of hairy roots．Hairy roots could grow independently on MS medium without hormone ，and presence of o-pines from hairy roots of peanut confirmed that Ri plasmid of Agrobacterium rhizogenes was integrated into the genome of peanut．Hairy roots grewfaster in liquid culture than in solid culture ，and the optimal medium was MS liquid medium without hormone．［Conclusion ］Establishment of hairy roots culture system of peanut provided a foundation for the improvement of peanut transgenic technique ，industrial production of resveratrol and propagation of sterile root-knot nematodes．Key words Arachis hypogaea L．；Agrobacterium rhizogenes ；Hairy roots ；in vitro culture基金项目科技部作物种业科技工程（2011BAD35B04）。

药用植物毛状根的诱导及其应用

药用植物毛状根的诱导及其应用

药用植物毛状根的诱导及其应用植物毛状根培养是植物组织培养中的一种，因其不仅克服了植物生长缓慢、有效成分积累有限的不足，且具有不依赖外源植物激素等优点，近年来研究较多。

文章介绍了目前药用植物毛状根的诱导情况，并总结了植物毛状根培养体系在次生代谢物的生产、生物合成机制及调控基因的研究、植物基因工程、生物转化以及药物蛋白中的应用，旨在为其他药用植物毛状根的培养及利用提供参考依据。

标签：毛状根；药用植物；次生代谢产物；发根农杆菌；生物转化1 药用植物毛状根的诱导1.1 毛状根的发根机制毛状根（hairy roots）是发根农杆菌Agrobacterium rhizogenes感染植物后，在植株创伤表面诱导产生的一种特殊表现型。

早在1907年，Smith和Townsend 就发现发根农杆菌能够诱导植物产生毛状根，此后，学者们发现无论是发根农杆菌还是根癌农杆菌A. tumefaciens，其致病原因均是由大分子质粒引起的[1-2]，但发根农杆菌的致病质粒与其他Ti质粒（根瘤诱导质粒）功能既有差异又有联系[3]。

直到1982年，美国科学家Chilton[4]发表文章阐述其发根机制：发根农杆菌中Ri质粒上T-DNA进入宿主植物细胞引发了毛状根的产生。

Ri质粒是发根农杆菌染色体外的一个约250 kb的大质粒，其上面存在2个与转化有关的功能区，即T-DNA（转移区）和Vir（致病区）。

T-DNA的主要功能是在转化时进入植物细胞并插入到寄主植物基因组中，表达决定毛状根生长和冠瘿碱合成的基因；Vir区的作用是协助T-DNA区完成转化。

Vir区上有7个操纵子VirA-G，轉化时，植物伤口产生小分子酚类化合物与VirA的表达产物结合，激活其他Vir基因，使T-DNA被剪切、转移并最终整合到宿主细胞基因组中。

因此，单子叶植物不能合成特异性小分子酚类化合物是其难以被侵染诱导出毛状根的主要原因[5-7]。

1.2 药用植物毛状根诱导情况目前，已有近百种药用植物成功诱导出毛状根，总结发现其中76%为草本植物，也有少量藤本及木本植物，比例分别占到7%，17%；在植物学分类方面，已诱导出毛状根的药用植物科属分类较为分散，其中豆科、茄科、菊科和唇形科占有相对较大的比例（表1）。

植物毛状根的培养及其化学进展：1.植物毛状根的诱导形成？…

植物毛状根的培养及其化学进展：1.植物毛状根的诱导形成？…

植物毛状根的培养及其化学进展：1.植物毛状根的诱导形
成？…
周立刚;杨崇仁
【期刊名称】《天然产物研究与开发》
【年(卷),期】1998(010)003
【摘要】本文综述了发根农杆菌诱导植物毛状根的方法及其分子机制。

对毛状根的鉴定技术进行了介绍。

诱导出毛状根的植物主要集中在双子叶植物，对单子叶植物毛状根诱导的可能性进行了讨论。

由于毛状根的激素自主性、稳定性和高产性，这一技术为植物有用成分的大量生产提供了新的途径。

【总页数】9页(P87-95)
【作者】周立刚;杨崇仁
【作者单位】华中理工大学药物研究所;中国科学院昆明植物研究所
【正文语种】中文
【中图分类】Q944.6
【相关文献】
1.药用植物毛状根诱导及其培养技术研究 [J], 李亚璞;闫静辉
2.发根农杆菌诱导植物毛状根形成的研究进展 [J], 潘野;王晓峰;林丽;吕春茂
3.发根农杆菌诱导植物毛状根的发生及次生代谢物生产的研究进展 [J], 胡亚忱;曲德业
4.植物毛状根的培养及其化学进展：2.植物毛状根的次生代谢 [J], 周立刚;杨崇仁
5.应用毛状根转化技术获得植物次生代谢产物的研究Ⅰ.萝芙木毛状根的诱导与培养 [J], 孙敏;汤绍虎
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药用植物毛状根诱导及其培养技术研究

药用植物毛状根诱导及其培养技术研究

导出毛状根，并用 ＨＰＬＣ 法测定了筛选出了高产发根 系 Ｒ９９２３ 发根系中各种单体皂甙的含量，测定出人参 总皂甙的含量为 １５．２ｍｇ／ｇ，并进一步探讨了人参发根 大规模培养的可能性［１０］。１９９７ 年，Ｌａｕｒａｉｎ 从银杏原叶 体及悬浮细胞获得了转化根，其药用成分占干重的 ０． ０６５％和 ０．０８７％ 。 ［１１］ ２００３ 年 Ｙａｍａｚａｋｉ 用发根农杆菌 （Ｒｈｉｚｏｂｉａｃｅａｅ）和矮蛇根草（Ｏｐｈｉｏｒｒｈｉｚａ ｐｕｍｉｌａ）毛状根 的培养来生产喜树碱，获得毛状根干重 １０００ｍｇ／ｇ［１］。另 外，丹参［１２］、长春花［１３，１４］、西洋参［１５，１６］、银杏［４］、黄芪［１７］、绞股 兰［１８］、枸杞［１９］、何首乌［２０］等药用植物的发根，也都有相应 的研究报导。 １ 发根农杆菌 Ｒｉ 质粒及其作用机理
利用发根农杆菌诱导产生毛状根后，必须尽快除 去毛状根吸附的微生物，使毛状根在无菌条件下快速 生长。除菌的方法有抗生素除菌法和温度除菌法，或将 两者联合使用。抗生素除菌法是将毛状根转移至含有 抗生素的培养基上，经数代转移直到完全无菌为止，常 用的抗菌素有羧苄青霉素、利福霉素和头孢霉素等；温 度除菌法是将毛状根转移至不含有抗生素的培养基 上，经过 ３９￣４０℃温度条件处理，再转移到新培养基 上，达到完全除菌的目的。除菌后，挑选生长速度较快、 分支较多的的发状根转至液体培养基中继续培养。在 连续培养过程中，对发状根进行驯化，使其适合发酵培 养。获得生长状态稳定的发状根后，须进一步开展发酵 工艺研究，优化培养条件，提高发状根培养及次生代谢 产物的发酵水平，最终建立规模化培养毛状根生产药 用植物次生代谢产物的发酵技术体系［２４］。 ３ 影响发根农杆菌转化的因素
现已成功诱导出毛状根的植物外植体材料有叶 片、茎段、子叶、愈伤组织等。研究表明，植物材料的幼 嫩部位，特别是用种子萌发直接获得的无菌幼苗更易 获得毛状根。这是因为幼嫩的生长旺盛的组织对农杆 菌更敏感，被感染后，伤口附近的细胞易脱分化形成较 多的感受态细胞，从而有利于农杆菌的诱导而产生毛 状根。此外，外植体材料预先在无激素的固体培养基上 培养 １￣３ｄ，可以提高毛状根的诱导率。 ２．３ 毛状根的转化方法

花生不同外植体愈伤组织的诱导及植株再生

花生不同外植体愈伤组织的诱导及植株再生窦秉德;何晔;王芳;杨晋彬;陈菊萍;刘润润【期刊名称】《淮阴师范学院学报（自然科学版）》【年(卷),期】2007(6)2【摘要】以成熟花生种子的上、下胚轴和叶片外植体为对象,在离体培养下,考察几种外植体再生能力的差异并对其作出对比分析.结果表明:上述外植体均能诱导出愈伤组织并能够进一步再生出幼苗,但不同外植体的再生能力有所差异,其再生能力大小依次为:上胚轴＞叶片＞下胚轴,培养基的差异对外植体愈伤组织诱导及再生起决定性作用,不同预培养时间对愈伤诱导及再生也有影响,总的来看是预培养时间短的外植体要好于预培养时间长的外植体.【总页数】4页(P164-167)【作者】窦秉德;何晔;王芳;杨晋彬;陈菊萍;刘润润【作者单位】淮阴师范学院,生物系,江苏,淮安,223300;新疆农业大学,农学院,新疆,乌鲁木齐,830052;淮阴师范学院,生物系,江苏,淮安,223300;新疆农业大学,农学院,新疆,乌鲁木齐,830052;淮阴师范学院,生物系,江苏,淮安,223300;淮阴师范学院,生物系,江苏,淮安,223300;新疆农业大学,农学院,新疆,乌鲁木齐,830052;新疆农业大学,农学院,新疆,乌鲁木齐,830052;新疆农业大学,农学院,新疆,乌鲁木齐,830052【正文语种】中文【中图分类】S565.2【相关文献】1.玉米不同外植体愈伤组织的诱导及植株再生的研究 [J], 王昌涛;杨爱国;高树仁;赵琦;赵玉锦;张世煌2.葡萄抗寒砧木外植体愈伤组织诱导和植株再生体系的研究 [J], 赵榆;刘中华;郭修武3.花生不同外植体丛生芽的诱导和植株再生 [J], 石文山;滕娜;唐旭日4.裸燕麦不同外植体愈伤组织诱导及再生植株变异研究 [J], 崔林;范银燕5.巨峰葡萄外植体愈伤组织的诱导和植株再生 [J], 冯莎莎;刘守义因版权原因，仅展示原文概要，查看原文内容请购买。

一种山豆根毛状根的快速繁殖方法[发明专利]

专利名称：一种山豆根毛状根的快速繁殖方法
专利类型：发明专利
发明人：李林轩,韦坤华,韦范,缪剑华,李翠,韦莹,王一诺,肖东申请号：CN201510862709.7
申请日：20151130
公开号：CN105494090A
公开日：
20160420
专利内容由知识产权出版社提供
摘要：一种山豆根毛状根的快速繁殖方法，包括如下步骤：(1)取山豆根种子进行消毒后接种到1/2MS培养基中萌发，获得山豆根无菌苗；(2)用R1601发根农杆菌诱导山豆根无菌子叶发根；(3)将步骤(2)所得到的毛状根分株置于培养液中进行快速繁殖培养，繁殖倍数达到39-55倍，通过本发明所获得的山豆根毛状根具有生长速度快、遗传稳定性好、合成能力强且稳定、向培养基中释放部分代谢产物的特点，能够用于大规模生产生产工业用山豆根的替代资源。

申请人：广西壮族自治区药用植物园
地址：530023 广西壮族自治区南宁市兴宁区长堽路189号
国籍：CN
代理机构：广西南宁公平专利事务所有限责任公司
代理人：黄永校
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一种花生组培苗根诱导培养基及其制备方法和应用[发明专利]

专利名称：一种花生组培苗根诱导培养基及其制备方法和应用专利类型：发明专利
发明人：迟晓元,陈明娜,潘丽娟,王通,陈娜,王冕,许静,杨珍,焦坤,谢宏峰,禹山林
申请号：CN201911297169.7
申请日：20191216
公开号：CN110786245A
公开日：
20200214
专利内容由知识产权出版社提供
摘要：本发明提供了一种花生组培苗根诱导培养基及其制备方法和应用，属于农作物生产技术领域。

本发明所述花生组培苗根诱导培养基包括混合溶液和凝固剂，每1L混合溶液包括2～2.5g的MS Medium培养基，12～18g蔗糖，0.8～1.2mL的4～6mmol/L的NAA溶液，200～300μL的8～12mmol/L的IBA溶液和水；所述凝固剂包括Phytagel植物凝胶和/或琼脂。

本发明提供的花生组培苗根诱导培养基具有良好的花生组培苗生根诱导作用，生根率高。

利用本发明提供的根诱导培养基，得到的组培苗经炼苗，移栽成活率在95％以上，饱果率在90％以上。

申请人：山东省花生研究所
地址：266100 山东省青岛市李沧区浮山路126号
国籍：CN
代理机构：北京高沃律师事务所
代理人：董大媛
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一种诱导三分三毛状根的方法[发明专利]

专利名称：一种诱导三分三毛状根的方法专利类型：发明专利
发明人：张明生,吕享,杨小蕊,曹然,吴彦秋申请号：CN201510498710.6
申请日：20150814
公开号：CN105087635A
公开日：
20151125
专利内容由知识产权出版社提供
摘要：本发明公开了一种诱导三分三毛状根的方法，主要提供了通过发根农杆菌介导的三分三毛状根诱导技术。

具体涉及发根农杆菌的活化、转化菌液的制备、外植体的转化、毛状根的继代培养及毛状根的PCR检测等方法。

本发明通过三分三毛状根的高效诱导和规模化培养，可实现托品烷类生物碱的工厂化生产，对三分三这一珍稀药用植物资源的可持续利用具有重要意义。

申请人：贵州大学
地址：550025 贵州省贵阳市花溪区贵州大学北校区科学技术处
国籍：CN
代理机构：贵阳中新专利商标事务所
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3230
安徽农业科学
2012 年
MS 固体培养上，25 ℃ 避光共培养 1 ～ 4 d 后，将外植体转移 至含有 400 mg / L Cef 的无激素 MS 固体培养基上除菌。3 周 后，外植体的伤口处开始有白色毛状根产生，切下毛状根转 移至含抗生素的培养基上继续除菌，每隔 7 d 转移至新的培 养基上除菌，直至无菌。毛状根诱导率 = （ 诱导产生毛状根 外植体数 / 农杆菌侵染外植体数） × 100% 。 1． 2． 5 毛状根冠瘿碱鉴定。参考李雅丽等［12］采用硅胶薄层 层析法对毛状根冠瘿碱进行鉴定。分别称取适量鲁花 11 号 和花育 27 号的毛状根及未转化花生根，液氮研磨呈粉，加入 75% 乙醇，过夜，12 000 r / min 离心 10 min，分别点样于 HSG 型硅胶板的不同上样点，以丙酮∶ 乙酸∶ 水 = 6∶2∶2 为展开剂。 层析结束后，分别用丙酮配制的硝酸银溶液和乙醇配制的 0. 5 mol / L 氢氧化钠溶液进行显色，出现斑点的为阳性，表示 有冠瘿碱，无斑点则无冠瘿碱。 1． 2． 6 毛状根培养。选择生长良好的 10 条长约 1 ～ 2 cm 的 花育 11 毛状根（ 鲜重约 0． 040 g） 分别继代于无激素的 MS、 B5 固 体 和 液 体 培 养 基 中，液 体 培 养 基 于 （ 25 ± 1 ） ℃ 、 120 r / min条件下暗培养，固体培养于（ 25 ± 1） ℃ 暗培养。20 d 后取出培养物，用蒸馏水洗去表面残留培养基后滤纸吸干 水分称重，再将培养物于 45 ℃ 烘箱干燥至恒重，取出于干燥 器内冷至室温，万分之一天平称重。毛状根生长曲线测定： 配制最佳培养基，于 150 ml 三角瓶中装入 30 ml 无激素 MS 液体培养基，共 25 瓶，每隔 4 d 取出 3 瓶，进行鲜重和干重测 量，3 次重复取平均值，以培养时间（ d） 为横坐标，培养物鲜 重和干重（ g / 瓶） 为纵坐标，绘制生长曲线。 1． 2． 7 次级代谢物质的提取及检测方法。提取方法： 分别 精确称取未转化花生根粉末、花生毛状根粉末适量于 10 ml 容量瓶中，加适量甲醇，于 25 ℃ 、功率 300 W 超声波清洗器 中提取 20 min，离心收集上清液，沉淀悬浮后重复提取 2 次， 合并上清液并定容至刻度。检测方法： 白藜芦醇及白藜芦醇 苷高效液相色谱检测（ HPLC） ，采用刘宏胜等［13］方法，条件 为色谱柱 C18 ，流动相为乙腈∶ 水 = 40∶60（ V / V，% ） ，柱温为室 温，流速为 1． 0 ml / min，检测波长 306 nm，进样量为 20 μl。 2 结果与分析 2． 1 发根农杆菌对 Cef 敏感性 外植体在发根农杆菌侵染 共培养后需进行除菌，防止农杆菌过度繁殖，使外植体褐化 死亡。文中采用不同浓度 Cef 进行抑菌试验，在接种后第 7 天，2 种农杆菌在对照平板（ 无 Cef） 中大量繁殖，而在含 Cef 平板上未能生长。14 d 后，在含 200 mg / L Cef 平板中 2 种农 杆菌菌落均开始出现，而在抗生素浓度 400 mg / L 以上的平 板中无农杆菌生长，由此可以确定最佳的 Cef 抑菌浓度为 400 mg / L（ 表 1） 。 2． 2 不同理化因素对毛状根诱导影响 2． 2． 1 不同发根农杆菌对外植体侵染能力比较。由表 2 可 知，2 种农杆菌对花生幼叶都能诱导出毛状根，鲁花 11 号的 幼叶毛状根（ 图 1A） 诱导率明显高于花育 27 号； 在不同菌株 间比 较，ACCC10060 诱 导 幼 叶 毛 状 根 的 比 率 略 高 于 ATCC11325； 在 子 叶 与 胚 轴 的 毛 状 根 诱 导 试 验 中，菌 株
白藜芦醇（ Resveratrol，简称 Res） ，学名为 3，5，4' － 三羟 基-二苯乙烯，也称芪三酚，是植物在受到外界刺激情况下产 生具有保 护 作 用 的 一 种 多 酚 物 质，因 具 有 抗 氧 化［1 －2］、抗 癌［3］、抗菌［4］、保护心血管［5］ 等保健药用功能，成为研究热 点。1940 年，首次从毛叶黎芦分离得到白藜芦醇［6］，至今已 确定至少有 21 科 31 属 72 种植物中存在白藜芦醇，有葡萄科 的葡萄属、蛇葡萄属，豆科的花生属、决明属等。现在的研究 主要集中在虎杖［7 －8］、葡萄和花生等植物上，其中花生在我 国的研究起步最晚，特别是采用生物技术方法提高花生白藜 芦醇代谢能力的研究。Anne［9］等于 1983 年研究了花生愈伤 组织在紫外诱导下能合成白藜芦醇，Fabricio 等［10］采用发根 农杆菌诱导花生产生毛状根，经过乙酸钠诱导 24 h 后可显著 提高白藜芦醇合成量。国内姚庆收［11］ 等采用发根农杆菌 R1601 诱导花生产生毛状根，但未对毛状根培养进行研究。 笔者在国内首次研究不同理化因素对花生毛状根诱导的影 响，并对花生毛状根培养条件进行初步研究。 1 材料与方法 1． 1 材料 1． 1． 1 主要试剂及仪器。试剂： 植物组织及农杆菌培养用
试剂均为国产分析纯； 无水乙醇、DMSO、头孢霉素（ Cef） 为国 产分析纯； 乙酰丁香酮（ AS） 、白藜芦醇及白藜芦醇苷标准品 为 sigma 公司生产。仪器： 紫外分光光度计、超净台、摇床、烘 箱、超声波清洗器、高速冷冻离心机、恒温培养箱等。 1． 1． 2 供试材料。鲁花 11 号、花育 27 号花生品种由山东省 花生研究所提供。侵染菌种采用发根农杆菌 ATCC11325 购 于广东省微生物菌种保藏中心； 发根农杆菌 ACCC10060 由 大连工业大学生物工程学院张宗申教授提供。 1． 2 方法 1． 2． 1 无 菌 外 植 体 制 备。花 生 种 子 先 经 75% 乙 醇 消 毒 1 min后，用无菌水洗涤 1 次，再用 0． 1% HgCl2 消毒 15 min， 无菌水洗涤 4 ～ 5 次，剥去种皮后种植在无激素的 MS 固体培 养基上，置于温度（ 25 ± 1） ℃ 、光照 16 h / d 的培养室内培养。 1． 2． 2 菌种活化培养。将 － 70 ℃ 保存农杆菌甘油菌划线于 YEB 固体培养基上，28 ℃ 活化 3 次，挑取单菌落接种于 YEB 液体培养基中，28 ℃ 、160 r / min 振荡培养 16 h 即可用于外植 体侵染诱导毛状根。 1． 2． 3 发根农杆菌对头孢霉素敏感性研究。将过夜培养的 发根农杆菌用 YEB 液体培养基稀释至 OD600 = 0． 2，分别吸取 100 μl 发根农杆菌涂布于含有不同浓度 Cef 的 YEB 固体培 养基上，14 d 后观察记录发根农杆菌的生长情况。 1． 2． 4 毛状根诱导。采用浸泡的方法进行转化，将萌发 8 ～ 10 d 的幼叶、子叶、下胚轴浸泡于活化的菌液中侵染 5 ～ 25 min，取出并在 灭 菌 滤 纸 上 吸 去 多 余 的 菌 液，置 于 无 激 素 的
基金项目 作者简介
收稿日期
科技部作物种业科技工程（ 2011BAD35B04） 。 刘杰（ 1985 － ） ，男，江苏连云港人，硕士研究生，研究方向： 微生物生物制药技术。* 通讯作者，研究员，硕士生导师， 从事花生生物技术育种研究，E-mail： yuanbeauty@ 126． com。 2011-11-09
Induction and in vitro Culture of Hairy Roots in Peanut （ Arachis hypogaea L． ） LIU Jie et al （ School of Biological Engineering，Dalian Polytechnic University，Dalian，Liaoning 116034） Abstract ［Objective］To optimize the induction conditions of hairy roots in peanut，so as to lay foundation for producing resveratrol and the propagation of root-knot nematode．［Method］Effects of different Agrobacterium rhizogenes strains，explants type，bacteria concentration，co-culture time，infection time and AS concertration on the induction of hairy roots in peanuts were studied．［Result］Agrobacterium rhizogenes ACCC10060 had higher induction rate of hairy roots than strains ATCC11325． Leaflet had higher induction rate of hairy roots than cotyledon，the optimal bacteria concentration was 0． 2 － 0． 4 ，the optimal co-culture time was 2 d，the best infection time was 10 － 15 min，the dose of 75 μmol / L acetosyringone（ AS） could improve induction rate of hairy roots． Hairy roots could grow independently on MS medium without hormone，and presence of opines from hairy roots of peanut confirmed that Ri plasmid of Agrobacterium rhizogenes was integrated into the genome of peanut． Hairy roots grew faster in liquid culture than in solid culture，and the optimal medium was MS liquid medium without hormone． ［Conclusion］ Establishment of hairy roots culture system of peanut provided a foundation for the improvement of peanut transgenic technique，industrial production of resveratrol and propagation of sterile root-knot nematodes． Key words Arachis hypogaea L． ； Agrobacterium rhizogenes； Hairy roots； in vitro culture