慢病毒包装、浓缩、纯化、滴度实验步骤

慢病毒包装、滴度测定方案流程一、背景：四质粒的包装体系1.含有目的基因的转染质粒2.VSV-G：pMD2.G（包膜质粒）3.Rev：pRSV-Rev4.Gag/Pol：pMDLg/pRRE二、包装细胞：293T293T细胞由293细胞通过基因技术派生出的细胞系，是经过腺病毒E1A基因的转染，能表达SV40大T抗原，含有SV40复制起始点与启动子区。

该细胞贴壁松散，操作时请尽量轻柔；换液时需预热培养基。

培养条件：DMEM ＋10% FBS＋1% P/S三、主要试剂1.93T培养基：高糖DMEM（含丙酮酸钠、谷氨酰胺）+ 10% FBS + GlutaMAX2.病毒收获培养基：取50 ml 293T培养基，加入0.5 g BSA（Sigma A9418）和终浓度为10-15 mM的HEPES，0.22 µm过滤。

3.无内毒素质粒抽提试剂盒4.Polybrene (10 mg/ml)：促转染试剂，提高转染效率。

四、包装步骤1.Day1:汇合度90%的10cm dishs HEK293T细胞（~ 6×107/dish）按1：1比例传代至15cm dishs，第二天细胞汇合度达到90%-95%（~1.5×108/dish），培养基为Gibico高糖DMEM培养基（含10%FBS）。

2.Day2:1)转染前2-3个小时更换培养基（含10%FBS)；2)按照以下比例配制转染试剂：Mix 1体积μlMix 2量DMEM（无FBS）1000μlDMEM（无FBS）1000μl目的基因质粒25μgVGF190μl（1μg/μl）PMD2G7.5μgPSPAX215μgMix 1和Mix 2分别混合后，室温5-10min, 后将Mix 1和Mix 2混合，室温30min，加入至15cm dish中。

（细胞达到汇合度90%，细胞过少会影响转染效率）。

3.Day36h-24h内更换新鲜培养基（含10%FBS），观察转染效率并拍照。

慢病毒生产及使用操作手册一、实验流程制备慢病毒穿梭质粒及其辅助包装原件载体质粒，三种质粒载体分别进行高纯度无内毒素抽提，共转染293T细胞，转染后6 h 更换为完全培养基，培养48和72h后，分别收集富含慢病毒颗粒的细胞上清液，病毒上清液通过超离心浓缩病毒。

以下内容由汉恒生物科技（上海）有限公司精心整理总结。

二、实验材料（一）慢病毒载体、包装细胞和菌株该病毒包装系统为三质粒系统，组成为pspax2, pMD2G,pHBLV TM系列质粒。

1、载体信息（见附录）2、细胞株 293T，慢病毒的包装细胞，为贴壁依赖型成上皮样细胞，生长培养基为DMEM(含10% FBS)。

贴壁细胞经培养生长增殖形成单层细胞。

3、菌株大肠杆菌菌株DH5α。

用于扩增慢病毒载体和辅助包装载体质粒。

三、包装细胞293T细胞的培养（一） 293T细胞的冻存随着传代的次数增加，293T细胞会出现生长状态下降、突变等。

为了防止此类现象的出现，我们需要在开始就对细胞进行大量冻存，以保证实验的稳定性和持续性。

在细胞对数生长期进行冻存，增加细胞复苏成活率。

1、去掉上清液，加入PBS洗去残留的培养基；2、加入0.25%的胰酶，消化1～2min后，镜下观察细胞变圆，细胞间间隙加大时，去除胰酶，加入新鲜培养基吹打混匀，移入离心管中。

3、细胞计数，将细胞全部晃下，加入 3mL 37 ℃预热的 10％ DMEM，用 10mL 移液管进行吹打，较大力吹打 6～8 次即可，不留死角，之后，将所有细胞吸出，置于15mL 离心管中，取 50ul 混匀后的细胞于 1.5mL eppendorf 管中，加入 450ul 10％ DMEM，即为 10 倍稀释，混匀，取 10ul 细胞于计数板中计数。

计数板上共 4 大格，每大格 16 小格。

计数时，4 大格均计数，总数除以 4（得每大格细胞数），再乘以 10（10 倍稀释），即为实际 n万/mL 细胞浓度。

4、细胞离心，1000rpm，5min。

慢病毒包装实验步骤及注意事项当下，基因编辑技术越来越火热，带动慢病毒包装实验越发普遍，但是大家通常在潜意识会觉得病毒载体包装过程太复杂而不敢尝试，确实，除去实验过程本身繁杂之外，做慢病毒包装实还经常容易出现各种状况，比如稳定性很差、滴度低，或者就是根本不出毒等等。

但是，热点可不等人，该来的迟早还是会来的，下面小编就为大家详细介绍一下慢病毒包装实验的基本步骤以及注意事项，希望大家能自己学会，掌握“核心”技术!慢病毒(Lentivirus)是一种逆转录病毒。

慢病毒在感染细胞时，首先会将宿主RNA逆转录为DNA，并将逆转录基因插入到宿主基因中表达。

慢病毒的基因表达系统是目前广泛使用的基因编辑操作工具。

以最常做的质粒共转染293T细胞为例，为了得到高滴度的慢病毒，慢病毒包装方法是利用表达载体与包装质粒共同转染细胞，在细胞中进行包装，包装好的假病毒颗粒分泌到细胞外的培养基中，离心取得上清液后，可以直接用于宿主细胞的感染。

实验流程示意实验材料1)含有目的基因的病毒载体：一个包装质粒混合物(Mix=pMDL:VSVG:REV=5:3:2)和一个慢病毒载体质粒(LentiviralVector)组成;2)指数生长的293T细胞;(培养条件：DMEM+10%PBS，37℃，5%CO2)3) 试剂：胎牛血清、Opti-MEM、转染试剂实验步骤第一步：细胞分盘转染前一天,通过胰消化传代于35mm培养皿上,使细胞贴壁后所古面积达到培养皿总面积的80%以上)。

将细胞置于含5%CO2的37℃温箱中孵育8-24h,当细胞贴壁完全后即可开始转染。

第二步：病毒转染1) 转染前1h换液(用1.5mL完全培养基换掉旧的培养基)。

2) 制备包装质粒和目的质粒与转染试剂的混合物：取无菌1.5mL EP管，加入400µl 无血清Opti-MEM，加入1.5µg 核心质粒和1.5µg 病毒包装质粒，及6µl 转染试剂 (转染试剂：质粒=2:1)，充分混匀，静置15-20min。

慢病毒载体构建及包装操作手册目录慢病毒收到后的注意事项一、整体实验流程二、实验材料三、慢病毒包装和浓缩四、感染目的细胞附1. 汉恒生物慢病毒质粒列表附2. 慢病毒滴度测定方法简介附3. 慢病毒MOI感染参数附4. 汉恒生物各病毒载体感染目的细胞比较附5. 实验室病毒操作应急预案慢病毒安全使用和注意事项➢慢病毒安全使用注意事项（*非常重要！！！*）1)慢病毒相关实验请在生物安全柜（BL-2级别）内操作。

2)操作病毒时请穿实验服，佩戴口罩和手套，尽量不要裸露双手及手臂的皮肤。

3)操作病毒时特别小心病毒溅出。

如果操作时超净工作台有病毒污染，请立即用70%乙醇加1%的SDS溶液擦拭干净。

接触过病毒的枪头、离心管、培养板、培养液请于84消毒液浸泡后统一处理。

4)如需要离心，应使用密封性好的离心管，如有必要请用封口膜封口后离心。

5)病毒相关的废弃物需要特殊收集，统一经高温灭菌处理。

6)实验完毕用香皂清洗双手。

➢慢病毒收到后的注意事项1)慢病毒的储存用户收到病毒液后如在短期内使用慢病毒进行实验，可以将病毒暂时放置于4 ℃保存（尽量一周内用完）；如需长期保存请分装后放置于-80℃。

注：a．反复冻融会降低病毒滴度（每次冻融会降低病毒滴度10%-50%）；在病毒使用过程中应尽量避免反复冻融，所以我们前期对病毒进行了分装（200 l/tube），收到后直接放置-80℃保存即可。

b．如果病毒储存时间超过6个月，我们建议在使用前重新测定病毒滴度。

2)慢病毒的稀释用户需要稀释病毒时，请将病毒取出置于冰浴融解后，使用培养目的细胞用PBS或无血清培养基(含血清或含双抗不影响病毒感染)混匀分装后置于4℃保存(请尽量一周内用完)。

一、整体实验流程二、实验材料（一）慢病毒载体、包装细胞和菌株该病毒包装系统为三质粒系统，组成为psPAX2, pMD2.G, pHBLV TM系列质粒。

1、载体信息（见附表1）2、细胞株：我们采用293T作为慢病毒的包装细胞。

一、包装细胞293T细胞的培养一、293T细胞的冻存1. 随着传代的次数增加，293T细胞会出现生长状态下降，出现突变等。

所以要在细胞购进时就进行冻存。

2. 在细胞对数生长期进行冻存，增加细胞复苏成活率。

3. 倒去细胞上清液，加入D-Hank's液洗去残留的培养基。

4. 加入0.25%的胰酶，消化10-20s后倒去。

5. 镜下观察细胞变圆，细胞间间隙加大时，加入新鲜培养基吹打混匀。

6. 细胞计数。

7.将细胞离心，1000rpm，2min。

8. 根据计数结果加入细胞冻存液（70%完全培养基+20%FBS+10% DMSO）重悬细胞，密度为3×106个/ml。

10. 第二天将细胞放入液氮灌，并记录。

二、293T细胞的传代1. 当细胞生长至汇合率达到80~90%需要对细胞进行传代操作，以扩大细胞数量，维持细胞良好的生长状态。

2. 消化细胞，方法同上。

3. 细胞离心结束后，加入完全培养基重悬。

密度为3×105个/ml。

4. 分到10cm培养皿中，10ml/皿。

三、293T细胞的复苏1. 当细胞传代次数过多（超过50代），细胞状态变差时或细胞出现污染事故时，需要丢弃并对开始冻存的细胞进行复苏。

2. 打开水浴锅，设置温度为40℃。

3. 查看细胞库记录，根据记录从液氮灌中取出冻存的细胞（需戴上棉手套，防止被冻伤），迅速丢入水浴锅中并快速晃动，在1~2 min内使细胞溶液完全溶解。

4. 将1ml细胞溶液加入9 ml完全培养基中并混匀后转入10cm培养皿。

5. 放回37℃、3%CO2和95%相对湿度的培养箱中培养。

6. 第二天观察细胞存活率。

倒掉旧的培养基，加入10ml新鲜培养基。

二、慢病毒的包装、浓缩和滴度测定1. 所用病毒检测引物为WPRE特异引物，序列如下5'-CCTTTCCGGGACTTTCGCTTT-3' (forward primer),5'-GCAGAATCCAGGTGGCAACA-3' (reverse primer) and5'-FAM-ACTCATCGCCGCCTGCCTTGCC-TAMRA-3' (probe)2. TaqMan Universal PCR Master Mix (Applied Biosystems， cat. no. 4304437)3. TaqMan DNA Template Reagent Kit (Applied Biosystems， cat. no. 401970)4. TaqMan RNaseP control reagent (Applied Biosystems， cat. no. 4316844)用于包装的293T细胞的培养用于包装的293T细胞(ATCC No. CRL-11268)必需选择处于生长旺盛期，细胞状态较佳，存活率90%以上，细胞边缘清晰，传代次数较低。

慢病毒载体构建及包装流程
（一）实验流程（1和2为并列步骤）
1.慢病毒过表达质粒载体的构建
设计上下游特异性扩增引物，同时引入酶切位点，PCR(采用高保真KOD酶，3K内突变率为0%)从模板中（CDNA质粒或者文库）调取目的基因CDS区（coding sequence）连入T载体。

将CDS区从T载体上切下，装入慢病毒过表达质粒载体。

2.慢病毒干扰质粒载体的构建
合成siRNA对应的DNA颈环结构，退火后连入慢病毒干扰质粒载体
3. 慢病毒载体的包装与浓缩纯化
制备慢病毒穿梭质粒及其辅助包装原件载体质粒，三种质粒载体分别进行高纯度无内毒素抽提，共转染293T细胞，转染后6 h 更换为完全培养基，培养24和48h后，分别收集富含慢病毒颗粒的细胞上清液，病毒上清液通过超离心浓缩病毒。

(二) 实验材料
2.1慢病毒载体、包装细胞和菌株
该病毒包装系统为三质粒系统，组成为pspax2, pMD2G, pLVX-IRES-ZsGreen1/pLVX-shRNA2。

其中质粒上的ZsGreen1表达框能表达绿色荧光蛋白（GFP）。

载体信息
1) 慢病毒克隆载体图谱如下：
2） 包装质粒信息如下：
PMD2G 载体图谱和序列信息
PSPAX2载体图谱和序列信息：
细胞株293T，慢病毒的包装细胞，为贴壁依赖型成上皮样细胞，生长培养基为DMEM(含10% FBS)。

贴壁细胞经培养生长增殖形成单层细胞。

菌株大肠杆菌菌株DH5α。

用于扩增慢病毒载体和辅助包装载体质粒。

(三)流程图。

慢病毒包装实验流程、原理与步骤慢病毒（Lentivirus）是逆转录病毒的一种，它需要相对较长的孵育时间，所以称之为“慢”病毒，Lenti在拉丁文中就是慢的意思。

它包括人免疫缺陷病毒（HIV）、猫免疫缺陷病毒（FIV）、猿免疫缺陷病毒（SIV）、牛免疫缺陷病毒等。

其中研究最多的是HIV-1慢病毒。

慢病毒载体（Lentivirus vector）是以慢病毒基因组为基础，由所需的目的基因取代部分基因构建而成。

目前使用的慢病毒载体多采用HIV-1基因组改造而来。

与一般的逆转录病毒载体相比，慢病毒载体对分裂细胞和非分裂细胞均具有感染能力而具有更广的宿主范围。

慢病毒载体还可以将外源基因有效地整合到宿主染色体上，从而实现持久表达。

在感染能力方面可以有效感染神经元细胞、肝细胞、心肌细胞、肿瘤细胞、内皮细胞、干细胞等多种类型的细胞，又很少引发机体免疫反应，能达到良好的基因治疗效果，具有广阔的应用前景。

慢病毒包装实验流程如下：1.根据目的基因相关信息（序列，基因序列号等）获取目的基因；2.根据客户要求选择对应载体；3. 将目的基因构建到慢病毒载体获得含有目的基因的重组载体；4. 测序鉴定重组质粒，高纯化（不含内毒素）提取的重组质粒；5. 使用高纯提重组载体和慢病毒包装质粒共转染 293FT 细胞，进行病毒包装并收集上清液；6. 通过超滤和超速离心浓缩和纯化病毒；7. 使用病毒液感染 293T 细胞，药物筛选细胞，构建稳定表达细胞系。

慢病毒使用安全及注意事项1.慢病毒相关实验请在生物安全柜内操作。

如果使用超净台请不要打开风机。

2.慢病毒感染实验时，请穿实验服，佩戴口罩和手套，尽量不用将身体的任何部位裸露在安全柜内。

3.操作病毒时尽量避免气雾或者飞溅。

如果溅出，请立即用70%乙醇加1%的SDS溶液擦拭干净。

4.如果需要离心，应使用密封性好的离心管，或者用Parafilm膜封口后离心。

5.废弃的含有病毒的培养基或者病毒接触过的枪头、离心管、培养板及培养瓶请用84消毒液（1:20），浸泡一天后丢弃。

慢病毒纯化
慢病毒纯化是指从慢病毒病毒培养物中分离和纯化出慢病毒颗粒的过程。

这个过程通常包括以下步骤：
1.细胞培养：首先，需要将慢病毒所感染的细胞系培养到适
当的细胞密度和病毒扩增时间，以确保足够的病毒产量。

2.细胞裂解：将培养的细胞收集并经过离心等方法分离，然
后使用裂解缓冲液裂解细胞，释放出细胞内的慢病毒。

3.离心和过滤：经过细胞裂解后，样品需要进行离心，以去
除细胞碎片和核酸残余物。

然后，可以使用过滤器对澄清
的上清液进行过滤以去除大颗粒物质。

4.病毒浓缩：慢病毒通常是低浓度的，因此需要进行浓缩。

可以使用超滤、离心和沉淀等方法，将病毒颗粒从大量液
体中浓缩到较小的容量中。

5.梯度离心：为了进一步纯化病毒，可以使用梯度离心技术，
如葡聚糖梯度离心或离心浓缩。

这个过程可将纯化的病毒
与细胞碎片、蛋白质和其他污染物分离开来。

6.病毒沉淀：经过梯度离心后，可以进行病毒的最终沉淀。

使用离心来将病毒沉淀到盘底或在离心管底端形成浓缩的
沉淀。

7.再悬浮：将病毒沉淀用缓冲液再悬浮，以便进行后续实验
应用。

在整个慢病毒纯化的过程中，必须遵守基本的生物安全措施，
并使用无菌操作、合适的缓冲液和处理设备。

每一步之间的温度、离心速度和离心时间等参数也需要根据具体的实验条件和病毒类型进行优化和调整。

慢病毒包装操作流程一、材料1 细胞培养试剂试剂名称终浓度试剂品牌DMEM/High glucose基础培养基90%Invitrogen胎牛血清10%Invitrogen/Gibco丙酮酸钠1mM Invitrogen2 慢病毒包装试剂试剂名称浓度试剂品牌Lipofectamine 2000InvitrogenPEG6000溶液50%WakoHBSS溶液Invitrogen3 耗材50 mL离心管15 mL离心管10 cm细胞培养皿μm过滤器2 mL EP管二、操作流程1细胞培养1.1293T/293FT细胞的复苏1)将完全培养液从4°C中取出放置到室温预热30 min左右。

在超净台内，用吸管吸取6~7mL完全培养液至15 mL离心管中；2)快速将冻存的细胞从液氮中取出，并迅速用镊子夹住盖子放入37°C 水浴中快速晃动（水不要没到盖子），使其在1~2分钟内完全融化；3)在超净台内，用酒精棉球擦拭冻存管外壁消毒，用吸管吸取所有融化的细胞悬液至装准备好的完全培养液中，轻轻吹打混匀，使冻存液分散开（目的是让DMSO分散，降低恢复室温的DMSO对细胞造成的毒性作用）。

4)在室温条件下，250 g离心4分钟。

5)离心后，在超净台内小心倒去上清，用吸管吸取2 mL新鲜完全培养液重悬细胞至单细胞悬液，再转移已经加好培养基的培养瓶/培养皿中，写上细胞名称、日期，放置37°C、5% CO2饱和湿度培养箱内培养。

（首次复苏细胞时，离心重悬后需取样计数，根据细胞数选择面积合适的培养容器。

）6)复苏翌日，给复苏的293T细胞更换新鲜的完全培养基。

1.2293T/293FT细胞传代1)待细胞长至60%-70%融合度即可传代。

将培养瓶里的所有培养液全部移去，用1×PBS洗涤细胞两次（洗涤速度要快，避免细胞干涸时间过长），以去除残余的培养液和血清（血清含有胰酶的抑制因子）；2)加入适当的胰酶溶液，能使其完全浸过细胞即可，室温孵育1-2分钟。

慢病毒包装、浓缩纯化及滴度测定一、试剂、耗材及仪器1.1试剂1.1.1 商品化试剂及试剂盒名称厂家货号Lenti-X 293T Cell Line clontech632180 DMEM Gibco C11995500BTFetal Bovine Serum, Qualified, Australia Origin LifeTechnologies10099-141Lipofectamine™LTX & Plus Reagent invitrogen15338 QIAGEN Plasmid Midi Kit (25)QIAGEN121431.1.2 试剂配制a. 氨苄青霉素储液称取氨苄青霉素10g，加8ml 超纯水，溶解，定容至10 ml，过滤除菌，分装，-20℃保存。

b. LB液体培养基实用文档称取蛋白胨（tryptone）10g、酵母提取物（yeast extract）5g、NaCl 10 g，加800 ml 超纯水，用10M NaOH调节pH至7.0，定容至1, 000 ml，分装，高压灭菌(121℃/20min)，4℃保存。

c. 完全培养基把DEME培养基与血清按照9:1(V/V)进行混合。

d. 50%PEG6000溶液称取125gPEG6000用超纯水溶解，定容到250ml，分装，高压灭菌(121℃/20min)，4℃保存。

e. 4M NaCl溶液称取46.752gNaCl，加超纯水溶解，定容到200ml，分装，高压灭菌(121℃/20min)，4℃保存。

f. PBS缓冲液称取8gNaCl，0.2gKCl，3.58gNa2HPO4.12H2O，0.27gKH2PO4，加800 ml 超纯水，调节pH至7.4，定容至1, 000 ml，分装，高压灭菌(121℃/20min)，4℃保存。

实用文档1.2 耗材名称厂家货号25cm2 Growth Area Flasks corning430639 75cm2细胞培养瓶corning430641 TC表面细胞培养皿，规格：35mm corning430165 TC表面细胞培养皿，规格：60mm corning430196 TC表面细胞培养皿，规格：100mm corning430293 6孔细胞培养板corning3516外旋盖冻存管corning430659 15ml尖底离心管corning430790 50ml尖底离心管corning4558 3毫升吸管Biologix30-0138A1 1.3 仪器名称仪器厂家仪器型号二氧化碳培养箱Thermo371生物安全柜Thermo Forma Class II，B2倒置荧光显微镜OLYMPUS IX71实用文档台式高速冷冻离心机Thermo LEGND MACH 1.6R小型高速离心机Thermo LEGEND MICRO 17小型冷冻高速离心机Thermo LEGEND MICRO 17R超低温冰箱SANYO MDF-U73V冰箱Haier BCD-290W二、方法2.1．包装细胞准备2.1.1.细胞复苏a. 把完全培养基预热至37℃；用清洗洁净的500ml烧杯盛300ml超纯水，然后放入37℃水浴锅中，预热至37℃（至少需30min）；准备好生物安全柜及所需培养耗材（灭菌处理）；b. 快速从液氮罐中取出装有冻存细胞的冻存管并放置于装有液氮的保温杯中，用洁净镊子取出冻存管，并立即放入上述准备好的水浴中（放入之前快速检查盖子是否拧紧，盖子切勿没入水中），用镊子镊好冻存管，快速沿着烧杯内壁转圈，细胞未冻融时切勿取出观察，细胞冻融时间一般为1-2 min，如果超过2 min仍未冻融，应掉弃该管细胞，细胞冻融后把冻存管放入70%酒精中3s，然后立即放入生物安全柜中；实用文档c. 把冻融的细胞立即转移至装有1ml预热完全培养基的15ml离心管中，混匀，立即加入4ml预热完全培养基，混匀；d. 加入5ml预热完全培养基，混匀，离心（100 g，5 min），小心移除上清；e. 加入6 ml预热完全培养基，吹打重悬细胞，然后把细胞悬液转移至T25培养瓶中，并放入二氧化碳培养箱（5% CO2, 37℃）中培养；f. 24小时观察细胞的贴壁情况，并根据细胞的密度进行换液或细胞传代；2.1.2细胞培养a. 当细胞达到80%融合时，移培养液，用PBS洗涤两次，加入1ml胰酶消化液，把培养皿置于倒置显微镜下观察，如大部分细胞变圆，立即移除胰酶消化液（如大部分细胞飘起，可不移除胰酶消化液），加入6ml 预热DMEM完全完全培养基，用吸管取培养液吹打瓶壁细胞，使其脱离瓶壁形成单细胞悬液，离心（100 g，5 min），小心移除上清，加入10ml预热完全培养基，吹打重悬细胞用细胞计数板在显微镜下计算细胞数，取1*106细胞分装入新T75培养瓶，添加基至总体积为20ml，置于37 ℃、5 %CO2 培养箱中培养；每隔2～3天传代1次，实验用第2～3代细胞。

慢病毒包装、浓缩纯化及滴度测定一、试剂、耗材及仪器1.1试剂1.1.1 商品化试剂及试剂盒名称厂家货号Lenti-X 293T Cell Line clontech 632180 DMEM Gibco C11995500BT Fetal Bovine Serum, Qualified, Australia Origin Life Technologies 10099-141 Lipofectamine™LTX & Plus Reagent invitrogen 15338 QIAGEN Plasmid Midi Kit (25) QIAGEN 121431.1.2 试剂配制a. 氨苄青霉素储液称取氨苄青霉素10g，加8ml 超纯水，溶解，定容至10 ml，过滤除菌，分装，-20℃保存。

b. LB液体培养基称取蛋白胨（tryptone）10g、酵母提取物（yeast extract）5g、NaCl 10 g，加800 ml 超纯水，用10M NaOH调节pH至7.0，定容至1, 000 ml，分装，高压灭菌(121℃/20min)，4℃保存。

c. 完全培养基把DEME培养基与血清按照9:1(V/V)进行混合。

d. 50%PEG6000溶液称取125gPEG6000用超纯水溶解，定容到250ml，分装，高压灭菌(121℃/20min)，4℃保存。

e. 4M NaCl溶液称取46.752gNaCl，加超纯水溶解，定容到200ml，分装，高压灭菌(121℃/20min)，4℃保存。

f. PBS缓冲液称取8gNaCl，0.2gKCl，3.58gNa2HPO4.12H2O，0.27gKH2PO4，加800 ml 超纯水，调节pH至7.4，定容至1, 000 ml，分装，高压灭菌(121℃/20min)，4℃保存。

1.2 耗材名称厂家货号25cm2 Growth Area Flasks corning 430639 75cm2细胞培养瓶corning 430641 TC表面细胞培养皿，规格：35mm corning 430165 TC表面细胞培养皿，规格：60mm corning 430196 TC表面细胞培养皿，规格：100mm corning 430293 6孔细胞培养板corning 3516 外旋盖冻存管corning 430659 15ml尖底离心管corning 430790 50ml尖底离心管corning 4558 3毫升吸管Biologix 30-0138A11.3 仪器名称仪器厂家仪器型号二氧化碳培养箱Thermo 371生物安全柜Thermo Forma Class II，B2倒置荧光显微镜OLYMPUS IX71台式高速冷冻离心机Thermo LEGND MACH 1.6R小型高速离心机Thermo LEGEND MICRO 17小型冷冻高速离心机Thermo LEGEND MICRO 17R超低温冰箱SANYO MDF-U73V冰箱Haier BCD-290W二、方法2.1．包装细胞准备2.1.1.细胞复苏a. 把完全培养基预热至37℃；用清洗洁净的500ml烧杯盛300ml超纯水，然后放入37℃水浴锅中，预热至37℃（至少需30min）；准备好生物安全柜及所需培养耗材（灭菌处理）；b. 快速从液氮罐中取出装有冻存细胞的冻存管并放置于装有液氮的保温杯中，用洁净镊子取出冻存管，并立即放入上述准备好的水浴中（放入之前快速检查盖子是否拧紧，盖子切勿没入水中），用镊子镊好冻存管，快速沿着烧杯内壁转圈，细胞未冻融时切勿取出观察，细胞冻融时间一般为1-2 min，如果超过2 min仍未冻融，应掉弃该管细胞，细胞冻融后把冻存管放入70%酒精中3s，然后立即放入生物安全柜中；c. 把冻融的细胞立即转移至装有1ml预热完全培养基的15ml离心管中，混匀，立即加入4ml预热完全培养基，混匀；d. 加入5ml预热完全培养基，混匀，离心（100 g，5 min），小心移除上清；e. 加入6 ml预热完全培养基，吹打重悬细胞，然后把细胞悬液转移至T25培养瓶中，并放入二氧化碳培养箱（5% CO2, 37℃）中培养；f. 24小时观察细胞的贴壁情况，并根据细胞的密度进行换液或细胞传代；2.1.2细胞培养a. 当细胞达到80%融合时，移培养液，用PBS洗涤两次，加入1ml胰酶消化液，把培养皿置于倒置显微镜下观察，如大部分细胞变圆，立即移除胰酶消化液（如大部分细胞飘起，可不移除胰酶消化液），加入6ml 预热DMEM完全完全培养基，用吸管取培养液吹打瓶壁细胞，使其脱离瓶壁形成单细胞悬液，离心（100 g，5 min），小心移除上清，加入10ml预热完全培养基，吹打重悬细胞用细胞计数板在显微镜下计算细胞数，取1*106细胞分装入新T75培养瓶，添加基至总体积为20ml，置于37 ℃、5 %CO2 培养箱中培养；每隔2～3天传代1次，实验用第2～3代细胞。

慢病毒生产及使用操作手册一、实验流程制备慢病毒穿梭质粒及其辅助包装原件载体质粒，三种质粒载体分别进行高纯度无内毒素抽提，共转染293T细胞，转染后6 h 更换为完全培养基，培养48和72h后，分别收集富含慢病毒颗粒的细胞上清液，病毒上清液通过超离心浓缩病毒。

以下内容由汉恒生物科技（上海）有限公司精心整理总结。

二、实验材料（一）慢病毒载体、包装细胞和菌株该病毒包装系统为三质粒系统，组成为pspax2, pMD2G,pHBLV TM系列质粒。

1、载体信息（见附录）2、细胞株 293T，慢病毒的包装细胞，为贴壁依赖型成上皮样细胞，生长培养基为DMEM(含10% FBS)。

贴壁细胞经培养生长增殖形成单层细胞。

3、菌株大肠杆菌菌株DH5α。

用于扩增慢病毒载体和辅助包装载体质粒。

三、包装细胞293T细胞的培养（一） 293T细胞的冻存随着传代的次数增加，293T细胞会出现生长状态下降、突变等。

为了防止此类现象的出现，我们需要在开始就对细胞进行大量冻存，以保证实验的稳定性和持续性。

在细胞对数生长期进行冻存，增加细胞复苏成活率。

1、去掉上清液，加入PBS洗去残留的培养基；2、加入0.25%的胰酶，消化1～2min后，镜下观察细胞变圆，细胞间间隙加大时，去除胰酶，加入新鲜培养基吹打混匀，移入离心管中。

3、细胞计数，将细胞全部晃下，加入 3mL 37 ℃预热的 10％ DMEM，用 10mL 移液管进行吹打，较大力吹打 6～8 次即可，不留死角，之后，将所有细胞吸出，置于15mL 离心管中，取 50ul 混匀后的细胞于 1.5mL eppendorf 管中，加入 450ul 10％ DMEM，即为 10 倍稀释，混匀，取 10ul 细胞于计数板中计数。

计数板上共 4 大格，每大格 16 小格。

计数时，4 大格均计数，总数除以 4（得每大格细胞数），再乘以 10（10 倍稀释），即为实际 n万/mL 细胞浓度。

4、细胞离心，1000rpm，5min。

慢病毒的浓缩与纯化P E G浓缩法
公司标准化编码 [QQX96QT-XQQB89Q8-NQQJ6Q8-MQM9N]
慢病毒的浓缩与纯化——PEG-8000浓缩法
实验试剂
1. NaCl
2. PEG8000
实验设备
1. 高压灭菌锅
2. μm滤头
3. 高速离心机
4. 低温冰箱
实验步骤
1. 5X PEG8000 NaCl配制称取NaCl g; PEG8000 50g溶解在200ml Milli-Q 纯水中；121摄氏度 30min 湿热灭绝 30min；保存在4℃。

2. 使用μm滤头过滤慢病毒上清液；
3. 每30ml过滤后的病毒初始液，加入5X PEG-8000 NaCl母液 ml；
4. 每20～30min混合一次，共进行3-5次；
5. 4度放置过夜；
6. 4度，4000 g，离心 20min；
7. 吸弃上清，静置管子1～2分钟，吸走残余液体；
8. 加入适量的慢病毒溶解液溶解慢病毒沉淀；
9. 集中后的病毒悬液分装成50 μl每份，保存在成品管中。

用碎干冰速冻后储存在-80 ℃。

慢病毒生产及使用操作手册一、实验流程制备慢病毒穿梭质粒及其辅助包装原件载体质粒,三种质粒载体分别进行高纯度无内毒素抽提，共转染293T细胞，转染后6 h 更换为完全培养基,培养48和72h后，分别收集富含慢病毒颗粒的细胞上清液,病毒上清液通过超离心浓缩病毒。

以下内容由汉恒生物科技(上海）有限公司精心整理总结。

二、实验材料(一）慢病毒载体、包装细胞和菌株该病毒包装系统为三质粒系统，组成为pspax2, pMD2G,pHBLV TM系列质粒.1、载体信息（见附录）2、细胞株 293T，慢病毒的包装细胞,为贴壁依赖型成上皮样细胞，生长培养基为DMEM （含10% FBS).贴壁细胞经培养生长增殖形成单层细胞。

3、菌株大肠杆菌菌株DH5α。

用于扩增慢病毒载体和辅助包装载体质粒。

三、包装细胞293T细胞的培养（一） 293T细胞的冻存随着传代的次数增加，293T细胞会出现生长状态下降、突变等。

为了防止此类现象的出现，我们需要在开始就对细胞进行大量冻存，以保证实验的稳定性和持续性。

在细胞对数生长期进行冻存，增加细胞复苏成活率。

1、去掉上清液，加入PBS洗去残留的培养基；2、加入0。

25％的胰酶，消化1~2min后，镜下观察细胞变圆，细胞间间隙加大时,去除胰酶，加入新鲜培养基吹打混匀，移入离心管中.3、细胞计数，将细胞全部晃下,加入 3mL 37 ℃预热的 10％ DMEM，用 10mL 移液管进行吹打，较大力吹打 6～8 次即可，不留死角，之后，将所有细胞吸出,置于15mL 离心管中，取 50ul 混匀后的细胞于 1.5mL eppendorf 管中，加入 450ul 10% DMEM，即为 10 倍稀释，混匀，取 10ul 细胞于计数板中计数。

计数板上共 4 大格,每大格 16 小格。

计数时，4 大格均计数，总数除以 4（得每大格细胞数），再乘以 10（10 倍稀释）,即为实际 n万/mL 细胞浓度.4、细胞离心,1000rpm，5min。

YRGene慢病毒包装试剂盒（精简版）说明书产品编号：产品规格： 个 皿产品简介：赢润生物的慢病毒包装试剂盒包括如下成分：（ ）优化配比的慢病毒包装辅助质粒混合物，可兼容大多数慢病毒表达载体。

（ ）高效率的慢病毒浓缩液，无需超速离心，也不需要价格昂贵的过滤柱，快速富集病毒粒子，其优势在于操作安全简单，对设备要求低，产毒效率高，能够快速、高效地收获高滴度病毒。

产品组成：慢病毒包装步骤：转染前，传代 细胞于 培养皿中（例如，接种 × 细胞于 培养皿中，使用完全培养基 培养），当细胞密度能够达到 即可进行转染。

：培养基里面不要添加抗生素。

转染前 小时，更换培养基，加入 新鲜的完全培养基（ ），注意不要添加抗生素。

准备转染。

在 离心管中，分别配制 管与 管试剂（ ）配好后，放置 ，然后将 管缓慢加入 管，混合均匀。

室温放置 ，使得脂质体 混合物形成。

：混合后可能会出现淡淡的乳白状，不会影响转染。

然后将混合液逐滴均匀加入 培养皿，轻微混匀。

置于 ， 培养箱中培养过夜。

第三天，更换培养基，加入 的完全培养基，同样注意不要加抗生素。

转染后 后收取上清，转移至 离心管。

：上清里面含有病毒，请小心操作。

在 ℃离心 ，去除沉淀。

上清液用 μ 滤器过滤后转移到新的离心管中。

慢病毒浓缩：每 过滤后的病毒初始液，加入 ，每 混合一次，共进行 次。

℃放置过夜。

℃， ，离心 。

去掉上清，静置管子 ，吸走残余液体。

加入无血清 充分溶解慢病毒沉淀。

病毒悬液分装成 μ 每份 保存在离心管中，速冻后储存在 ℃。

慢病毒滴度测定：进行慢病毒感染实验之前，我们强烈建议您进行慢病毒滴度检测。

在滴定测定的前一天取 孔板，每孔接种 × 细胞。

加 到新鲜的完全培养基中，使其终浓度为 μ 。

加含有 的完全培养基 倍稀释病毒。

具体操作如下：取一个 离心管（或 孔板），加入 μ 培养基和 μ 待测病毒原液，混合均与后吸取 μ 病毒混合液至第二个离心管（或 孔板第二个孔），混合时尽量不要产生气泡，如此稀释至第八个孔（即稀释 倍）。

一、简介慢病毒（Lentivirus）载体是以HIV-1（人类免疫缺陷I型病毒）为基础发展起来的基因治疗载体。

区别一般的逆转录病毒载体，它对分裂细胞和非分裂细胞均具有感染能力。

慢病毒载体的研究发展得很快,研究的也非常深入。

该载体可以将外源基因有效地整合到宿主染色体上,从而达到持久性表达.二、实验流程（大致的简单过程）慢病毒表达载体包含了包装、转染、稳定整合所需要的遗传信息。

慢病毒包装质粒可提供所有的转录并包装RNA 到重组的假病毒载体所需要的所有辅助蛋白。

为产生高滴度的病毒颗粒，需要利用表达载体（自己构建）和包装质粒（购入）同时共转染细胞，在293T 细胞(购入)中进行病毒的包装，包装好的假病毒颗粒分泌到细胞外的培养基中，离心取得上清液后，可以直接用于宿主细胞的感染，目的基因进入到宿主细胞之后，经过反转录，整合到基因组,从而高水平的表达效应分子.大致的实验流程：1. 根据目的基因相关信息（序列,序列号等），构建含有外源基因或siRNA的重组载体；（即质粒构建，已构建好，质粒可以永久保存）2. 对于测序正确的重组质粒，提取和纯化高质量的不含内毒素的重组质粒；3. 使用高效重组载体和病毒包装质粒（购入）共转染293T 细胞[1]，进行病毒包装和生产，收集病毒液；4. 浓缩、纯化病毒液；5. 用高质量的病毒液感染细胞(293T细胞)；6。

通过定量PCR精确测定病毒滴度（高精确滴定方法）和Western 分析实验结果；7。

用高质量的病毒液感染宿主细胞；检测基因功能或者siRNA的沉默效率以及使用药物进行稳定转染细胞株的筛选，通常状况下，筛选的细胞克隆株具有长期的表达稳定性.病毒液足够用于一般的动物活体实验。

三、重组质粒构建流程1.基因的获得：shRNA寡核苷酸序列的设计和合成（将正确序列克隆入载体中,退火形成双链，PCR扩增）2。

回收A．酶切产物的胶回收：一般做50-100ul 体系,然后跑电泳回收，回收量一般为30ul. B．PCR扩增产物的胶回收原理：首先利用低熔点琼脂糖凝胶电泳DNA片段，分离目的条带DNA，然后紫外光下切割含目的DNA条带的胶块，利用胶回收试剂盒回收纯化DNA片段。

慢病毒包装实验的要点：1：良好的293FT细胞状态是转染成功的首要因素，细胞代数不宜超过30代；2：细胞铺板需均匀，避免细胞成团，影响转染效率；尽量多的细胞转入质粒，产生的病毒就越多；3：细胞换液和共转染时，动作要轻柔避免细胞漂浮。

尽量少的细胞死亡，产生的病毒就越多；实验前要准备的试剂、耗材和仪器；试剂准备：10%灭活胎牛血清+90%DMEM配好的完全培养基,0.25%胰酶，PBS,TRL 转染试剂，包装质粒，目的质粒，无血清培养基。

耗材准备：10cm细胞培养皿，6孔细胞培养板，吸头规格1ml、200ul、10ul，10ml移液管，离心管规格15ml、5ml、1.5ml，0.22um PVDF滤膜和10ml无菌注射器，试管架。

仪器准备：倒置荧光显微镜，普通光学倒置显微镜，电动移液器，吸引器，移液枪，二级生物安全柜，二氧化碳细胞培养箱。

第一天：上午（病毒包装质粒共转染前，293FT细胞复苏后至少让其传代两次以上，293FT 细胞能成倍的增长，确定细胞状态好）；实验前准备：安全柜开紫外灯照30分钟；把培养基和试剂放置常温；消化细胞：从37 5%的co2细胞培养箱拿出细胞状态良好的293FT细胞，吸出原培养基，加入PBS 1ml略洗之后吸出，加入1ml胰酶消化1-2min，轻轻拍打培养皿，再加入3ml新鲜培养基终止消化，将培养皿中的细胞转移至15ml离心管内离心1000r /5min,吸出上清液，加入10ml PBS吹打混匀后，离心1000r /5min, 吸出上清液。

细胞铺板：在10cm细胞培养皿上标记细胞名称、细胞代数、时间和操作人，将计数好大约2.5×106个293FT细胞吸入15ml离心管，再加入完全培养基至10ml充分混匀，然后把混匀的293FT细胞移入10cm培养皿）。

放置培养箱中培养48h。

插入铺板后图片刚铺板后铺板1天后第三天：上午细胞转染：细胞铺板48h后，从培养箱取出293FT细胞，倒置显微镜观察，细胞密度达90%左右；吸出原有培养基，沿皿壁缓慢加入8ml完全培养基，放置于培养箱中，待转染。