秋水仙素诱导兰属‘素心黄’多倍体的方法研究

(19)中华人民共和国国家知识产权局(12)发明专利申请(10)申请公布号 (43)申请公布日 (21)申请号 202011259560.0(22)申请日 2020.11.12(71)申请人 中国农业科学院蔬菜花卉研究所地址 100081 北京市海淀区中关村南大街12号申请人 红河创森高原特色农业开发有限公司(72)发明人 葛红　吴婷　贾瑞冬　杨树华　朱剑非　赵鑫　李秋香　(74)专利代理机构 重庆市信立达专利代理事务所(普通合伙) 50230代理人 陈炳萍(51)Int.Cl.A01H 4/00(2006.01)(54)发明名称一种秋水仙素诱导蝴蝶兰原球茎产生多倍体的方法(57)摘要本发明属于多倍体育种技术领域，公开了一种秋水仙素诱导蝴蝶兰原球茎产生多倍体的方法，包括：将原球茎转接至含有0.05％的秋水仙素的1/2MS+1mg/l 6‑BA+0.2mg/l NAA+5g/l琼脂+20g/l蔗糖固体培养基中培养15天进行诱导处理；处理后用无菌水冲洗3‑4次，用滤纸吸干水分，转接在1/2MS+5g/l琼脂+20g/l蔗糖培养基中，继代培养2‑3次；多倍体鉴定：分别进行形态学观察、气孔鉴定和倍性鉴定；数据统计。

本发明用不同浓度秋水仙素及不同处理时间对蝴蝶兰原球茎进行共培法加倍处理，为多倍体诱导培育花大色艳、观赏价值高的蝴蝶兰新品种奠定基础。

权利要求书2页 说明书9页 附图6页CN 112293257 A 2021.02.02C N 112293257A1.一种秋水仙素诱导蝴蝶兰原球茎产生多倍体的方法，其特征在于，所述秋水仙素诱导蝴蝶兰原球茎产生多倍体的方法包括以下步骤：多倍体诱导：将原球茎转接至含秋水仙素的固体培养基中进行诱导处理；将经秋水仙素处理的原球茎转接在培养基中，继代培养；多倍体鉴定：对所得的原球茎分别进行形态学观察、气孔鉴定和倍性鉴定；对获得的数据进行统计和分析，所述分析包括进行方差分析和采用LSD多重比较方法，其中数据变动范围值均为所有处理数据值的标准差。

秋水仙素诱导黄花仙客来四倍体及其特性
马明新
【期刊名称】《园林科技》
【年(卷),期】1998(000)002
【摘要】研究使用秋水仙素,从"KageYellow"黄花仙客来二倍体获得四倍体,以及多倍性对黄花仙客来的影响。

将离体块茎节片浸泡在100mgl一’秋水仙素中4天,产生2个四倍体植株,四倍体同它的亲缘二倍体相比,花瓣大,而且积累查尔酮的能力也大。

因此,利用多倍性是商业上较深黄色仙客来育种的有效方法。

【总页数】6页(P36-41)
【作者】马明新
【作者单位】沈阳市园林科研院
【正文语种】中文
【中图分类】S682.262
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1历史与综述1.1多倍体的概念一般所讲的多倍体（ppolyploid）是指染色体的数目在3（3x）或3以上（>3x）的个体。

多倍体在生物界广泛存在,常见于高等植物中,由于染色体组来源不同,可分为同源多倍体和异源多倍体。

前者指增加的染色体来源于同一物种，在植物界中常见，如马铃薯、西瓜、长山药、葡萄等；后者则是不同的种杂交产生的杂种后代,经过染色体加倍形成的多倍体，常通过人工方法进行培育，如红花、苹果、梨、樱桃、菊、水仙、郁金香等等。

植物界中多倍体是极为常见的，藻类和真菌中都掌握了存在多倍体的例证。

在高等植物中，苔藓植物53%是多倍体，蕨类植物约97%是多倍体，裸子植物约5%是多倍体，被子植物约70%是多倍体。

自1937年Blakelee和Avery发现秋水仙素（colchicine）诱导染色体加倍的效果后，掀起了植物诱变多倍体的热潮，1937年也被称为“多倍体新时代的开始”。

杂交和多倍化是高等植物物种形成和进化的最重要途径之一，约70%的被子植物在其进化过程中曾经经历过一次或多次多倍化事件，而多倍化育种是植物育种的新途径。

1.2多倍体诱导方法多倍体诱导就是利用人工的方法使植物的染色体加倍的方法。

因为多倍体植株的一些特性对生产有利，而自然界产生多倍体的过程相当漫长，因此人们经常需要通过人工诱导的方法来获得多倍体植株。

人工诱导方法目前大致可分为以下三种:(1)物理诱变：最早是通过打顶来实现的，后来让人们相继采用高温、低温、γ—射线、β—射线、中子、激光等辐射获得了多倍体。

(2)化学诱变：它是以化学药剂如秋水仙素、萘骈乙烷、异生花素、氧化亚氮(N20)、甲基黄酸乙酯等处理植物组织最活跃、最旺盛的部分。

这种方法具有经济方便、诱导作用专一性强等优点，成为目前应用最普遍的方法。

化学诱变处理方法有浸渍、涂抹、滴液和注射等。

其中，以秋水仙素诱导效果最好。

因其在浓度适宜时具有诱导频率高、所得性状稳定、对植物材料及染色体损伤相对较小，对染色体结构无显著影响等优点。

2021近十年秋水仙素离体诱导植物多倍体的研究进展范文 多倍体植物在自然界中普遍存在，目前在农业生产中，主要农作物都是多倍体，如小麦为异源六倍体、棉花和油菜为异源四倍体、甘薯为同源六倍体，而水稻和玉米为二倍体化的古多倍体。

多倍化研究已经成为当前进化生物学、遗传学和基因组学领域的研究热点[1]. 多倍体通过自然加倍获得，但数量稀少，频率低，甚至在自然条件下不能正常生长而死亡，难以应用于生产实践中[2],因此，20世纪初育种家们开始对人工诱导多倍体进行探索。

起初，人工加倍的方法是通过物理的手段获得多倍体，如高温、辐射，但诱变率低下，常发生嵌合体[3].1937 年，Blakeslee 等[4]用秋水仙碱加倍曼陀罗等植物的染色体数获得了成功。

秋水仙素被广泛应用于培育植物新品种。

秋水仙素，即秋水仙碱，纯秋水仙碱呈黄色针状结晶，熔点157℃，易溶于水、乙醇和氯仿，味苦，有毒。

秋水仙素通过作用于有丝分裂中期使染色体加倍。

其原理是秋水仙素可以与α - 微管蛋白和β - 微管蛋白形成的二聚体特异性结合，减少了微管二聚体装配在微管上的数量，结果使微管拆卸的速度大于装配的速度，最终使形成的微管解聚，染色体加倍但细胞质不分裂，因此染色体数目加倍。

最初秋水仙素诱导多倍体是活体进行。

通过适当的操作，如点滴、注射、涂抹等诱导植株的顶芽、腋芽等位置，但活体操作时细胞的分裂不能同步，活体诱导较难得到纯合四倍体植株，大多为嵌合体，诱导率低。

随着生物技术的发展，离体诱导多倍体的条件已经十分成熟。

离体诱变育种有诸多优势：诱导率高；试验易于重复进行；嵌合体发生率低，方便纯化；时效快、操作方便；节省空间、人力物力；便于控制室温、光照等条件等。

张蜀宁等[5]利用秋水仙素离体诱导青花菜，得到变异植株 20 株，其中纯合植株有 19 株。

秋水仙素离体诱导同源多倍体在种质创新和新品种选育上发挥了重要作用，诱导产生的同源多倍体常伴随植物形态、解剖、生理、栽培特性等方面而改变，如叶片变厚变大、叶色加深、叶绿素含量增加；花器官、果实变大；维管束变大、抗逆性增强、生物量或生物有效成分增加等[6]. 同源多倍化引起的表型变化及其机理研究亦成为研究热点[7-8]. 本文总结了近十年秋水仙素离体诱导植物多倍体的研究进展，对影响诱导效率的因素如外植体类型、处理方法及其他因素进行了综述，并探讨了倍性嵌合体的分离方法、同源多倍化效应及其分子机理研究，旨在为从事植物多倍体研究的育种工作者提供参考。

秋水仙素诱导杂交兰四倍体及倍性鉴定兰属(Cymbidium)花卉花型优美,花色艳丽,是一类具有重要观赏价值和经济价值的花卉,在世界各地具有广阔的市场前景。

国内外关于兰属花卉种间杂交培育新品种的报道较多,而多倍体育种方面研究相对较少。

本研究以兰属杂交兰(大花蕙兰×墨兰)与蕙兰进一步杂交所获得的F1代杂交兰根状茎为材料,以秋水仙素为诱变剂,对杂交兰多倍体诱导和鉴定技术进行了系统的研究,旨在建立杂交兰多倍体诱导和鉴定技术体系。

主要研究结果如下：1.以杂交兰根状茎为材料,分别采用浓度为0.02%、0.05%、0.10%、0.20%的秋水仙素对其无菌苗的根状茎浸泡处理24h、48h和72h诱导杂交兰四倍体,试验结果表明,以0.10%的秋水仙素处理48h诱导效果最佳,变异率为36%。

变异的根状茎较未处理的根状茎膨大明显,茎段粗壮,变圆分节,着生有绒毛,生长势变缓。

2.对秋水仙素诱导获得杂交兰变异材料进行倍性鉴定,成功获得了染色体加倍植株。

染色体观察表明,四倍体植株染色体数为2n=4x=80,二倍体对照为2n=2x=40。

加倍后的四倍体植株较二倍体植株粗壮,叶片变厚,颜色变深,茎基部粗壮,颜色深,生长势变缓,根系变粗,根状茎增粗,保卫细胞增大,叶绿体数目增多,气孔密度减小等特点,可作为新材料加以利用。

3.由于杂交兰生长周期较长,生根需要较长时间,而根状茎较易获得,因此本文以杂交兰根状茎茎尖为材料,比较茎尖的不同采集时间、预处理方法、解离时间和染色方法对杂交兰根状茎茎尖染色体制片的影响。

结果表明,取材时间为上午10：00-11：00,预处理方式为8-羟基喹啉处理6-7h,解离采用5mol/L HCl在25℃下30min,染色液以卡宝品红染色液染色15-20min染色体制片效果最佳。

秋水仙素诱导观赏植物多倍体研究进展
宋平;王学凤;蔡明;任翔翔;潘会堂;张启翔
【期刊名称】《湖北农业科学》
【年(卷),期】2009(48)6
【摘要】综述了秋水仙素在观赏植物多倍体育种上的应用概况,探讨了多倍体诱导效果的影响因素,总结了多倍体的鉴定方法.
【总页数】4页(P1510-1513)
【作者】宋平;王学凤;蔡明;任翔翔;潘会堂;张启翔
【作者单位】北京林业大学园林学院/国家花卉工程技术研究中心,北京,100083;北京林业大学园林学院/国家花卉工程技术研究中心,北京,100083;北京林业大学园林学院/国家花卉工程技术研究中心,北京,100083;北京林业大学园林学院/国家花卉工程技术研究中心,北京,100083;北京林业大学园林学院/国家花卉工程技术研究中心,北京,100083;北京林业大学园林学院/国家花卉工程技术研究中心,北京,100083【正文语种】中文
【中图分类】S68;S349+.51
【相关文献】
1.观赏植物多倍体诱导研究进展 [J], 雷家军;王冲
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植物多倍体的诱导及其鉴定一、实验目的1、通过实验，掌握化学诱导植物多倍体的原理以及方法，学习利用秋水仙素诱导植物多倍体的一般方法及多倍体诱导在植物育种上的意义。

2.学习利用细胞学方法观察鉴定多倍体的特点以及诱导染色体加倍后的细胞学表现，利用染色体分析的方法对多倍体的细胞做出准确判断。

二、实验原理生物体的细胞核中都有相对稳定的染色体数目，这是物种的基本特征之一。

多倍体是细胞中具有3个或3个以上的染色体组的生物体。

在植物育种上，利用多倍体可以改良作物的经济性状，同时还可以利用多倍体克服远缘杂交过程中的障碍。

利用一些化学因素诱导植物产生多倍体，秋水仙素是诱导多倍体形成最有效和常用的药品之一，利用秋水仙素处理正在进行有丝分裂的细胞，可以抑制纺锤丝的形成，使细胞有丝分裂中期纺锤丝断裂或纺锤体形成受抑制，有丝分裂后期，复制的染色体无法移向两级，细胞内的染色体加倍，形成多倍体。

因此在适宜浓度的秋水仙素作用下，它既可以有效的阻止纺锤体的形成，又不至于对细胞发生较大的毒害，因此，细胞经一定时期后仍可恢复正常，继续分裂，只是染色体数目加倍成为多倍性细胞，并在此基础上进一步发育成为多倍体植物。

将秋水仙素处理的植物根尖，制成临时装片，利用显微镜观察根尖分生区细胞中的染色体数目而确定是否形成染色体。

三、实验材料、器具及试剂1、实验材料：发芽的蚕豆，蚕豆幼苗2、实验器具：显微镜、解剖针、小试管、刀片、镊子、载玻片、盖玻片、吸水纸、试管、培养皿、烧杯。

3、实验试剂：秋水仙素： 0.1%浓度。

卡诺固定液：3份95％酒精与1份冰醋酸配制而成。

1mol/l盐酸，45%醋酸，改良苯酚品红，70%酒精。

四、实验步骤1、取材：将种子消毒，并于无菌水中浸泡24小时后，将蚕豆种子（2n=16）培养在培养皿内的湿滤纸上，室温或28℃发芽，待胚根长达1~2cm时，取出萌发的种子，用自来水洗2~3次，备用。

2、预处理：将胚根长到1~2cm的蚕豆种子移到盛有0.1%秋水仙素的润湿的的吸水纸的培养皿内，室温下处理48h,待观察到根部有膨大时取出固定，与在水中进行培养的蚕豆种子（一般植物生长周期为17~18h）做对照。

秋水仙素诱导多倍体膨大率总结
对于秋水仙素诱导多倍体膨大率的总结，我可以提供如下信息：
秋水仙素是一种植物源化合物，广泛应用于植物生物技术领域中的多倍体诱导研究。

多倍体是指具有两个或更多完全一样的染色体组的有机体。

通过秋水仙素的处理，可以诱导植物细胞或组织发生多倍化现象，即增加染色体数量，进而改变植物的某些性状。

然而，具体的多倍体膨大率受到很多因素的影响，比如不同植物品种的反应性、秋水仙素浓度和处理时间的选择、培养基成分等。

因此，不同研究所得的多倍体膨大率可能会有差异。

总体而言，秋水仙素诱导多倍体膨大率的提高可以通过优化培养条件、选用适宜的植物种类、调整秋水仙素浓度和处理时间等方式进行。

但具体的操作方案需要根据实际情况进行研究和调整。

需要注意的是，任何植物生物技术研究都需要符合相关的法律和政策规定，保证安全性和合法性。

专利名称：一种诱导穿心莲多倍体的方法专利类型：发明专利
发明人：杜勤,林玉凤,王振华,姬璇,窦晓蓉申请号：CN201610494636.5
申请日：20160627
公开号：CN106106142A
公开日：
20161116
专利内容由知识产权出版社提供
摘要：本发明公开了秋水仙素在穿心莲育种以及诱导穿心莲多倍体方面的应用。

同时公开了一种诱导心莲多倍体的方法，是当穿心莲幼苗长至高0.8～1.2cm时，利用10～30μL的500～2000mg/L 的秋水仙素对幼苗生长点处理2～6次，化学诱导产生多倍体植株。

本发明方法可以改良穿心莲的品种，提高穿心莲的产量和质量，根、茎、叶等营养器官巨型性、药用有效成分含量增高、生态适应性及抗逆性增强，有效解决了解决穿心莲的品种退化、产量和质量下降等多种问题，为穿心莲种质资源的可持续利用及穿心莲规范化种植的产业化推广提供理论依据和技术基础。

而且方法设计合理，结果可信，具有较强的实用性和推广性。

申请人：广州中医药大学
地址：510405 广东省广州市番禺区大学城外环东路232号
国籍：CN
代理机构：广州粤高专利商标代理有限公司
代理人：任重
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