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实验03 低温诱导植物细胞染色体数目的变化目的要求通过观察低温诱导植物染色体数目的变化，了解自然界出现多倍体的原因实验原理用低温处理植物分生组织细胞，能够抑制纺锤体的形成，以致影响染色体被拉向两极，使细胞也不能正常分裂。
结果，植物细胞染色体数目发生变化。
材料用具洋葱或大葱、蒜均为二倍体，卡诺氏液，改良苯酚品红染液，盐酸溶液，体积分数为95%的酒精溶液载玻片、盖玻片培养皿、滤纸、纱布、烧杯、镊子、剪刀实验步骤1）培养根尖：将洋葱放在装满清水的广口瓶，让洋葱的根尖接触水面。
（2）低温诱导：待洋葱长出1cm左右的不定根时，将整个装置放入冰箱的低温室（4℃），诱导培养36小时。
（3）固定细胞形态：剪去诱导处理的根尖约0.51cm，放入卡诺氏液中浸泡0.51小时，以固定细胞形态，然后用体积分数约95％的酒精冲洗2次。
（4）制作装片：取固定好的根尖，进行解离、漂洗、染色和制片4个步骤，具体操作方法与“观察根尖有丝分裂”实验相同。
（5）观察装片：先用低倍镜寻找染色体形态较好的分裂相。
视野中既有正常的二倍体细胞，也有染色体数目发生改变的细胞，发生染色体数目变化的细胞中染色体数目可能为正常细胞的二倍。
确认某个细胞发生染色体数目变化后、再用高倍镜观察。
(1)低温和秋水仙素诱导染色体数目加倍的原理：有丝分裂前期，低温和秋水仙素都能抑制纺锤体的形成；后期，着丝粒分裂后染色体数目加倍；末期，由于没有纺锤体，染色体不能被牵拉到细胞两极，细胞无法实现一分为二，从而使得细胞内的染色体数目加倍。
当温度恢复正常或秋水仙素被细胞代谢消耗完全之后，染色体数目加倍的细胞又通过正常的有丝分裂产生更多的染色体数目加倍的子代细胞。
(2)两次漂洗的对比：①时间不同：第一次漂洗在固定之后解离之前，第二次漂洗在解离之后染色之前；②试剂不同：第一次用95%酒精漂洗，第二次用清水漂洗；③目的不同：第一次是为了洗去多余的卡诺氏液，第二次是为了洗去多余的解离液。
实验二十一多倍体的人工诱发和鉴定【实验目的】1、通过实验掌握诱导植物多倍体的方法和技术，观察多倍体的特点及染色体加倍后的细胞学表现；2、学习植物材料的固定方法和常规压片技术；3、利用染色体分析的方法对多倍体的细胞做出准确判断。
【实验原理】各种生物细胞中的染色体数目一般是恒定的，在自然因素和人工诱变因素（物理的、化学的）作用下，生物体细胞中的染色体数目也会发生变异，从而导致生物性状、育性、生活力等一系列改变。
多倍体是指具有了三套或三套以上完整染色体组的个体，分为三类。
同源多倍体（autoploid）：是指增加的染色体组来自同一物种（如水稻的同源三倍体、同源四倍体等）。
异源多倍体：是指增加的染色体组来自不同的物种（如普通栽培小麦）。
同源异源多倍体；是指使异源多倍体的染色体数再加倍所得个体，如人工合成的八倍体小粒野生稻。
自然发生多倍体的概率很低，如水稻中发生同源三倍体的频率为1/50000~1/30000。
利用一些诱发因素可以人工诱变植物产生多倍体，这些因素包括物理的温度剧变、机械损伤、各种射线处理等，还有化学因素，如植物碱、麻醉剂、植物生长激素等处理方法。
其中，秋水仙素（colchicine）是诱导多倍体形成最为有效和常用的药品之一。
它是从百合科植物秋水仙属秋水仙（Colchicum autumnale）的种子和鳞茎中提炼出来的一种植物碱，对植物种子、幼芽、花蕾、花粉、嫩枝等都可产生诱变作用，其分子式C22H25NO6。
商品秋水仙素为淡黄色粉末，易溶于冷水、酒精、氯仿和甲醛，但在热水中溶解度较低，不易溶于苯和乙醚。
毒性极强，可导致眼睛暂时失明及使中枢神经系统麻痹而导致呼吸困难。
使用时要注意安全并需做好药品管理工作。
一般认为，秋水仙素的主要作用是抑制细胞分裂时纺锤体的形成，使染色体不能向两极移动而被阻止在中期，染色体数目加倍，当秋水仙素处理停止后，细胞继续分裂，就形成多倍体的组织。
若多倍体组织分化产生的是性细胞，则所产生的配子也是多倍性的，因而可以通过有性生殖途径把多倍体特性遗传下去。
化生学院生物科学教研室一、实验目的1、了解多倍体植物及其在植物遗传与进化中的重要作用。
2、了解人工诱导植物多倍体的原理、方法及其在植物育种中的应用。
3、应用植物染色体制片技术，鉴别诱导后染色体数目的变化。
二、实验原理●自然界各种生物的染色体数目一般是相当稳定的，这是物种的重要遗传学特征。
●n ：配子中的染色体数目，也指一个配子带有的全部基因，所以在不同的场合也称作基因组。
●x ：单倍体染色体数目，即染色体基数。
（单倍体：细胞核内含有一套完整染色体组）同源多倍体生物体内染色体异源多倍体数目变化的途径●对于二倍体生物来说，x ＝n ，对于多倍体生物来说，x≠n 。
染色体组(X)整倍的增减染色体组内个别染色体的增减—非整倍体多倍化是形成物种的一种重要方式，二倍体在自然界中较普遍，几乎全部的动物和过半数的高等植物均是二倍体，多倍体在植物中广泛存在，在动物中较少见。
多倍体植物在形态上比二倍体植物个体大，叶片上的气孔也很大，容易辨认。
多倍体的研究在育种中非常重要，可以改良作物的某些经济性状，还可利用多倍体克服远缘杂交过程中的障碍。
利用一些诱发因素可以人工诱导植物产生多倍体，包括物理因素，如温度的剧变，射线处理，嫁接和切断等，还有化学因素，如植物碱，植物生长激素，秋水仙素、茶嵌戊烷、异生长素、富民农等等。
秋水仙素的作用是抑制纺锤丝的形成，使细胞有丝分裂中期纺锤丝断裂或纺锤体的形成受到抑制，在有丝分裂后期染色体不能移向两极，细胞加大而不分裂，着丝粒分裂后的染色体仍在一个细胞中，故细胞中的染色体数目加倍。
如果用秋水仙素处理根尖，则在根尖分生区内可以检测到大量染色体加倍的细胞，如处理植物幼苗的芽，则可以得到染色体加倍的植株。
三、实验材料洋葱（2n=2x=16）、大蒜（2n=2x=16）四、实验仪器设备显微镜、恒温培养箱、恒温水浴锅、镊子、载玻片和盖玻片五、实验步骤1、大蒜幼根的培养：提前3~5天进行培养，将大蒜瓣剥去外边膜质枯皮，下端可见许多微微凸起的根原体，将蒜瓣架在烧杯（大小与蒜瓣适宜）口上，杯中盛满清水，使蒜瓣的下部浸入水中，置温暖处，注意每天换水，经3~5天后，即可长出嫩根。
秋水仙素的诱导机理文／吴举宏秋水仙素是1937年发现的，从百合科植物秋水仙种子、球茎中提取出来的一种植物碱，分子式为C22H25O6N。
秋水仙素呈白色或黄色粉末或针状结晶，有剧毒，易溶于冷水、酒精和氯仿，难溶于热水、乙醚等，有效诱导浓度为0．0006%～1．6%，一般以0．2%浓度效果最好。
常被用作多倍体诱导剂，经处理的萌发种子或幼苗细胞染色体数会发生加倍。
其诱导加倍的机理与微管、着丝粒的结构和特性有关。
微管是广泛存在于各种真核细胞中的一种重要细胞结构，细胞分裂中纺锤体就是由微管组成的。
微管管壁由13条原丝纵向平行排列构成，主要成分为微管蛋白，而微管蛋白分α微管蛋白和β微管蛋白两种。
α微管蛋白和β微管蛋白组成的异二聚体构成微管亚单位，若干个异二聚体相接连成原丝。
α微管蛋白与β微管蛋白在化学结构上极为相似，两者相对分子质量均为50000，氨基酸数目分别为450和445个，两者42%序列相同。
其中β微管蛋白肽链中第201位为半胱氨酸，为秋水仙素结合部位。
α微管蛋白和β微管蛋白彼此间具有很强的亲和力，常呈二聚体形式存在。
每一微管蛋白异二聚体上尚有秋水仙素与之结合的部位，如果结合的部位被其结合，微管不仅不能继续聚合，而且会引起原有微管解聚。
故秋水仙素具有干扰微管装配，破坏纺锤体形成和终止细胞分裂的作用。
细胞分裂间期染色体经过复制形成了两条姐妹染色单体，但在进入后期之前，姐妹染色单体在着丝粒区连结在一起。
着丝粒位于染色体上的主缢痕部位，为染色单体的连接结构，而动粒才是动粒纤维附着在染色体的结构。
着丝粒是由一段特殊DNA序列构成，着丝粒DNA具有高度重复序列，如小鼠染色体着丝粒约有300个碱基对重复几千次组成，含量占染色体DNA的5%～10%，而在果蝇细胞中可达40%。
Clarke等学者认为，着丝粒区域DNA可能编码一种特殊信号，使其复制在S期受阻遏，一直到后期这一区域DNA 复制才完成。
着丝粒DNA复制完成也就启动了后期染色单体的分离，故姐妹染色单体分离动力不是来自与两极相连的动粒微管张力。
秋水仙素使染色体数目加倍的原理
秋水仙素是一种可以影响有丝分裂过程的物质。
在正常的有丝分裂过程中，微管将染色体拉向两极，随后分裂成两个细胞。
而秋水仙素会导致微管出现异常，无法将染色体完全拉向两极，或者染色体在中央无法分离。
这些异常会导致染色体数目增加，从而形成多倍体细胞。
除了秋水仙素外，还有其他物质也可以诱导多倍体，例如科学家们经常使用的染色体植物素(colchicine)和利福平(oryzalin)。
这些物质同样可以影响有丝分裂过程，从而诱导多倍体。
第2节染色体变异基础巩固1．基因突变和染色体变异的一个重要的区别是()A．基因突变在光学显微镜下看不见B．染色体变异是定向的，而基因突变是不定向的C．基因突变是可以遗传的D．染色体变异是不能遗传的答案A解析基因突变是DNA分子中发生碱基对的替换、增添和缺失，而引起的基因结构的改变，属于分子水平的变化，光学显微镜下观察不到。
染色体的变异可在光学显微镜下直接观察到。
生物的变异是不定向的，基因突变和染色体变异其遗传物质均发生改变，都是可遗传的变异。
2．普通小麦是六倍体，有42条染色体，科学家们用花药离体培养培育出的小麦幼苗是() A．三倍体、21条染色体B．单倍体、21条染色体C．三倍体、三个染色体组D．单倍体、一个染色体组答案B解析花药中的花粉是经过减数分裂发育而成的，由其培育出的幼苗比普通小麦的染色体数减少了一半，含有三个染色体组，而体细胞中含有本物种配子染色体数目的个体叫单倍体。
3．双子叶植物大麻(2n＝20)为雌雄异株，性别决定为XY型，若将其花药离体培养，再将幼苗用秋水仙素处理，所得植株的染色体组成应是()A．18＋XY B．18＋YYC．9＋X或9＋Y D．18＋XX或18＋YY答案D解析2n＝20，性别决定为XY型的双子叶植物大麻产生的花药的染色体组成为9＋X或9＋Y，将其培育成单倍体后再利用秋水仙素处理，诱导染色体加倍后，植株的染色体组成是18＋XX或18＋YY。
4．下列关于植物染色体变异的叙述，正确的是()A．染色体组整倍性变化必然导致基因种类的增加B．染色体组非整倍性变化必然导致新基因的产生C．染色体片段的缺失和重复必然导致基因种类的变化D．染色体片段的倒位和易位必然导致基因排列顺序的变化答案D解析染色体变异不会产生新基因，基因种类不会改变，但会改变基因的数量或排列顺序。
5．如图表示某种生物的部分染色体发生了两种变异的示意图，图中①和②、③和④互为同源染色体，图a和图b中的部分染色体转移造成的生物变异分别属于()A．图a和图b均为染色体结构变异B．图a为基因重组，图b为染色体结构变异C．图a为染色体结构变异，图b为基因重组D．图a和图b均为基因重组答案B解析图a显示同源染色体的非姐妹染色单体间交叉互换，应属于基因重组，而图b所示为③号染色体的某片段移到②号一非同源染色体上，应属于染色体结构变异。
2020届高考生物实验突破专题09 低温诱导植物染色体数目的变化1．实验原理用低温处理植物分生组织细胞，能够抑制细胞分裂时纺锤体的形成，使染色体不能被拉向两极，以致细胞不能分裂成两个子细胞，染色体的数目发生变化。
提示着丝点分裂与纺锤体无关，没有纺锤体的牵引，着丝点也能正常分裂。
2．实验步骤与现象（1）(2)现象：视野中既有正常的二倍体细胞，也有染色体数目发生改变的细胞。
3．注意事项(1)在显微镜下观察到的细胞已经死亡，不能持续观察到细胞中染色体的数目变化。
(2)选材只能是分生区细胞，不能进行细胞分裂的细胞不会出现染色体数目的变化。
4．低温诱导植物染色体数目变化的实验中的试剂及其作用5．低温诱导染色体数目变化的实验与观察细胞有丝分裂实验的比较考点一：实验的基本原理和操作步骤例1．用质量分数为2%的秋水仙素处理植物分生组织5～6 h，能够诱导细胞内染色体加倍。
某生物小组为了探究用一定时间的低温(如 4 ℃)处理水培的洋葱根尖是否也能诱导细胞内染色体加倍进行了相关实验设计。
下列关于该实验的叙述中，错误的是()A．本实验的假设是用一定时间的低温处理水培的洋葱根尖能够诱导细胞内染色体加倍B．本实验可以在显微镜下观察和比较经过不同处理后根尖细胞内的染色体数目C．本实验需要制作根尖细胞的临时装片，制作步骤是解离→漂洗→染色→制片D．本实验可以看到一个细胞完整的染色体数目加倍的过程【答案】D【解析】由于在装片制作过程中已经将细胞杀死，所以用显微镜观察时看不到一个细胞完整的染色体数目加倍的过程，故D项错误。
例2．将洋葱(2n＝16)放在装满清水的广口瓶上，让洋葱底部接触水面。
待洋葱长出约1 cm 左右的不定根时，再将整个装置放入4 ℃环境下继续培养36 h，然后取根尖制作成临时装片在显微镜下观察。
下列与此相关的叙述中，正确的是()A．卡诺氏液的作用是使洋葱根尖的组织细胞相互分离开来B．显微镜视野中可以观察到16、32或64条染色体的细胞C．显微镜视野中可以观察到四分体和同源染色体分离现象D．4 ℃的低温通过抑制着丝点的分裂而使细胞染色体数目加倍【答案】B【解析】卡诺氏液的作用是固定细胞形态，解离液的作用是使组织细胞相互分离开来，A 错误；由于低温诱导，有的细胞中染色体数目加倍，有的仍为正常二倍体，加倍后染色体数目为32条，或没有加倍的细胞中染色体数目在有丝分裂后期为32条，加倍后的染色体在有丝分裂后期为64条，而正常细胞染色体数目为16条，B正确；同源染色体联会形成四分体及分离是减数第一次分裂的特征，有丝分裂没有此现象，C错误；低温抑制细胞分裂过程中纺锤体的形成，而不是抑制着丝点的分裂，无纺锤体的牵引，染色体无法向两极移动而保留在一个细胞中，从而使染色体数目加倍，D错误。
秋水仙素诱导大蒜多倍体 Garlic polyploid induction by colchicine 摘要：[ 目的] 了解人工诱导多倍体的原理，学习用秋水仙素诱发多倍体大蒜的方法，学习识别多倍体植物的形态特征及其细胞学特点。[ 方法] 以秋水仙素为诱变剂, 比较不同浓度对大蒜的多倍体诱导效应。[ 结果] 经秋水仙素处理过的植株,在相同的处理时间内, 随着秋水仙素浓度的升高, 染色体加倍率升高。）当处理时间相同，秋水仙素浓度分别为0、0 .05 % 、0 .1% 、0.15%、0.2%时，加倍率分别为0、57%、19%、20%和24% 。当秋仙素浓度为0 .05% , 染色体加倍率达到最高, 为57% 。多倍体在形态、细胞组织学上与二倍体差异明显,细胞核变大,染色体数目加倍。 关键词：大蒜 多倍体 秋水仙素 Abstract：[objective] To understand the principle of artificially induced polyploidy and the way to learn with colchicine inducing polyploid garlic, Learn to identify the morphological and cytological characteristics of polyploid plants. [method] With colchicine as mutagen, compare different concentrations of garlic of polyploid induction effect. [results] With the same induced time, with the increase of concentration of colchicine, chromosome doubling rate rises. When inducing with the same time, the colchicine concentration were respectively 0, 0. 05%, 0. 1%, 0.15%, 0.2%, and the double rate was 0, 57%, 19%, 57% and 24%. When autumn fairy element concentration is 0. 05%， the chromosome doubling rate is highest, at 57%. Polyploid and diploid differences in morphology, cell histology, cell nucleus, chromosome number. Key words：garlic polyploidy colchicine 多倍体育种是植物育种的重要途径之一, 它不仅可对性状进行改良, 还可提高植物体内相关成分的含量。植物多倍体往往表现出部分器官增大, 营养成分丰富, 产量高, 次生代谢成分增加以及抗逆性强等优点。多倍体育种对改良无性繁殖作物的营养器官具有明显的优越性。大蒜( AlliumsativumL.) 为百合科葱属蔬菜, 有抗癌, 防癌, 杀菌作用, 具有很高的营养和药用价值。基于大蒜属于无性繁殖作物,染色体数较少( 2 n =16) , 因此十分适合进行多倍体育种。近年来, 利用化学诱变剂进行多倍体诱导研究和实践越来越多, 其中秋水仙素是较理想的诱变剂之一 , 但目前利用秋水仙素对大蒜进行多倍体诱导研究较少。因此, 我们通过用不同浓度的秋水仙素对大蒜鳞茎生长点进行相同时间的处理, 探讨大蒜多倍体的诱导，旨在探索一般条件下诱导大蒜染色体加倍的有效方法。
1 材料与方法 1 .1 材料 供试材料: 在市场购买的普通大蒜。 1 .2 试验方法 1 .2 .1 材料预培养。 将饱满大蒜蒜瓣去皮后, 插在干净湿润细沙中,室温下培养 ，待根尖长至2 mm 左右时将蒜瓣取出, 洗去沙子, 挑生长良好的蒜瓣作为多倍体诱导的材料和对照材料。 1 .2 .2 秋水仙素处理。 用饱含浓度分别为0 .05 % 、0 .1% 、0.15%、0.2%秋水仙素溶液和作为对照含有等量蒸馏水的培养皿培养36h，每一组合处理4到5个蒜瓣。 1 .3 倍性鉴定 在8 :00 ～9 :00 切取幼嫩根尖, 用自来水洗净, 放在固定液（无水乙醇—冰醋酸 3∶1) 中固定24 h, 蒸馏水漂洗3 次, 每次10 min,60 ℃ 水浴中用1 mol/ L 盐酸解离5 min, 蒸馏水漂洗2 ～3 次, 漂去盐酸,小心切取根尖, 置载玻片中央, 加石炭酸品红1 滴, 染色15min 后, 压片, 镜检并拍照。
2 结果与分析 2 .1 变异植株的细胞学鉴定 秋水仙素处理后的大蒜, 用根尖压片法鉴定其细胞染色体数。显微镜下观察发现, 经秋水仙素处理过的植株, 含有染色体数目为2 n = 4x = 32 的细胞, 均形成了嵌合体, 而对照组均为染色体数目为2n = 2x = 16 条的二倍体( 图1 、2) 。
图1 图2 2.2 细胞学鉴定结果 浓度图1图2图3平均百分比水视野中的总细胞数485638470%视野中加倍染色体的细胞数0000
0.05%视野中的总细胞数38384038.757%视野中加倍染色体的细胞数20271922
0.10%视野中的总细胞数9575376919%视野中加倍染色体的细胞数1717412.7
0.15%视野中的总细胞数3025192520%视野中加倍染色体的细胞数6365
0.20%视野中的总细胞数13016213814324%视野中加倍染色体的细胞数37382634
表1不同浓度处理的大蒜细胞染色体数目加倍的比例
2 .3 秋水仙素对大蒜的诱导效应 由表1 可知, 秋水仙素对大蒜具有明显的诱导效应。不同的秋水仙素浓度的植株根尖压片进行染色体数目鉴定后, 发现它们的体细胞中既有二倍体细胞又有四倍体细胞, 大部分植株形成了嵌合体, 而对照组全部是二倍体细胞。这说明秋水仙素对大蒜多倍体的诱导起到了一定的作用。秋水仙素对中期细胞的纺锤丝起作用, 防止其形成, 影响染色体移向两极而导致染色体数目加倍。该试验没有诱导出纯合的四倍体大蒜, 经秋水仙素处理只形成了四倍体细胞和二倍体细胞共存的嵌合体植株, 因此对经秋水仙素处理过的大蒜的细胞加倍率进行了统计分析。由表一 可以看出, 在相同的处理时间下, 随秋水仙素浓度的升高, 细胞加倍率基本呈升高趋势；但也有例外现象，当秋水仙素浓度为0 .05 % 时, 加倍率达到最高, 为57 %，差异极显著 。导致这个反常现象的原因将在稍后分析。在一个生长周期中, 处于分裂中期的细胞比较少, 而秋水仙素只对正在分裂的细胞起作用, 因而导致加倍的细胞数较少。 2.4 实验结果分析
（1）当处理时间相同，秋水仙素浓度分别为0、0 .05 % 、0 .1% 、0.15%、0.2%时，加倍率分别为0、57%、19%、20%和24% 。从数据可以看出，染色体的加倍率与秋水仙素溶液的浓度有关。通过查阅有关资料（张数鑫, 谢芝馨, 于元杰, 等. 秋水仙素结合组织培养技术诱导大葱多倍体的研究）,得知理论上，当处理时间相同时，随着秋水仙素溶液浓度的增大，加倍率应该呈上升趋势。在本实验中，当秋水仙素溶液的浓度分别为0 .1% 、0.15%、0.2%时，加倍率随着增大。但当秋水仙素溶液的浓度为0 .05 %时，加倍率出现了显著差异，达到了57% 。出现这个结果的可能原因有：在配制浓度为0 .05 %的秋水仙素溶液时，出现了人为失误；大蒜根部浸入溶液的程度不一样，装有浓度为0 .05 %的秋水仙素溶液的培养皿里面的大蒜根部浸入地较完全，而其他的大蒜根部浸入溶液不够完全，秋水仙素无法完全发挥作用；计数时因视野中细胞数较多而产生了较大的误差等。所以，为了使实验结果真实可信，最好做重复实验。 （2）在该试验的诱导处理中, 处理的是大蒜鳞茎的生长点, 因为叶芽是由多细胞构成的, 因细胞分裂不同步, 因而诱导产生了大量的嵌合体。在一个生长周期中, 处于分裂中期的细胞比较少, 所以尽管秋水仙素对细胞有一定的毒害作用, 但低浓度处理较短的时间后去掉秋水仙素, 细胞能恢复正常的分裂功能, 由于二倍体细胞的数目多于多倍体细胞,所以二倍体细胞数目的增长指数快, 相比较而言低浓度短时间处理时产生细胞加倍率很低的嵌合体。当处理浓度增加时, 间歇的二倍体细胞到了中期, 由于秋水仙素的作用而变成多倍体细胞, 致使植株中四倍体细胞的数量继续增多, 二倍体细胞相对数量不断减少, 因此植株中出现了加倍率稍高的嵌合体植株, 这种现象在不对细胞造成功能性损伤的前提下存在剂量效应和时间效应 。研究表明, 经过离体组织的培养技术, 可将嵌合体组织离体培养诱导不定芽或芽丛, 在此基础上进行逐步分离与纯化, 进而获得稳定的多倍体种质资源, 有关这方面的工作尚在进一步研究中。 （3）本实验的优缺点 ①优点：选材为普通大蒜，容易培养，方法简单，易于操作；基于大蒜属于无性繁殖作物,染色体数较少( 2 n =16) , 因此十分适合进行多倍体育种；选取的诱变剂为秋水仙素，诱变效果较好；实验流程较简单，所需时间较短。②缺点：因时间较紧，未进行重复试验，实验结果的可信度不够；计数时容易出现误差，易把未加倍的细胞当成加倍的细胞。
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