实验二 细菌的革兰氏染色

细菌的革兰氏染色法实验二细菌的革兰氏染色法学习细菌的革兰氏染色原理和方法。

单染色法：就可以观测微生物的大小、形状、和细胞排序状况，但无法辨别微生物以及它的特定结构等。

复染色法：用两种或两种以上染色液进行染色，有协助鉴别微生物的作用，故也称鉴别染色法。

常用的有：革兰氏染色法、抗酸染色法、芽孢染色法、鞭毛染色法等。

革兰氏染色机制：由于g－肽聚糖层较厚，交联度高，不含较多脂质，故用乙醇等有机溶剂脱色时融化了类脂质，减少了细胞的通透性，并使初染的结晶青色和碘的复合物不易喷出，经沙黄复染呈圆形红色。

而g＋细胞壁结构球状，用脱色剂处置后，肽聚糖层孔径增大，通透性减少，故细菌仍留存初染时的紫色。

大肠杆菌、金黄色葡萄球菌（24h培养物）、革兰氏染色液一套3.初染：在搞好的涂面上碱液草酸铵结晶紫染液，染1分钟，倾去染液，流水冲洗至并无紫色。

4.媒染：先用新配的路哥氏碘液冲去残水，而后用其覆盖涂面1分钟，后水洗。

5.脱色：除去残水后，碱液95%酒精展开脱色约15-20秒，后立即用流水冲洗。

6.复染：滴加番红染色液，染3－5分钟，水洗后用吸水纸吸干。

7.镜检：观测染色结果并绘图。

记录所观察到的两种菌革兰氏染色颜色的差别，并绘图。

如图所示，被染为紫色的部分即为为金黄色葡萄球菌，红色部分即为为大肠杆菌。

六、问题与讨论必须获得恰当的革兰氏染色结果必须特别注意哪些操作方式？哪一步就是关键？why?按照操作顺序来看1、首先，必须特别强调的就是实验过程中全程的无菌操作：玻片的消毒、注射环路的杀菌以及实验所用材料试管的无菌采用；2、其次，是金黄色葡萄球菌以及大肠杆菌的刮取过程中，它们的量一定要适中，以免过多影响后期观察结果；3、再者，涂片操作方式完结后，通过酒精灯的蒸煮将细菌紧固，必须特别注意掌控研磨的程度，避免细菌全系列被打死；4、接下来的染色过程中，注意各染色剂染色的时间长度，尤其是95%乙醇脱色的时长，18秒为适宜时长；5、最后，就是化成水分，特别注意油镜的采用，先在低倍镜下打听视野，再转换成高倍镜、油镜。

实验二细菌的革兰氏染色法一、目的要求1.掌握革兰氏染色的方法及原理。

2.进一步熟悉显微镜的使用二、基本原理1. 革兰氏染色的意义：革兰氏染色的反应是细菌分类和鉴定的重要性状。

它是1884年由丹麦医生Gram 创立的。

革兰氏染色法（Gram stain）不仅能观察到细菌的形态特征而且还可将所有细菌区分为两大类：染色反应呈蓝紫色的称为革兰氏阳性细菌，用G+表示；染色反应呈红色（复染颜色）的称为革兰氏染色阴性细菌，用G-表示。

2. 革兰氏染色的原理：细菌对于革兰氏染色的不同反应，是由于它们细胞壁的成分和结构不同造成的。

革兰氏阳性细菌的细胞壁主要是肽聚糖形成的网状结构组成的，在染色过程中，当用乙醇处理时，由于脱水而引起网状结构中的孔径变小，通透性降低，使结晶紫－碘复合物被保留在细胞内而不易着色，因此，呈现蓝紫色；革兰氏阴性细菌的细胞壁中肽聚糖含量低，而脂类物质含量高，当用乙醇处理时，脂类物质溶解，细胞壁的通透性增加，使结晶紫－碘复合物易被乙醇抽出而脱色，然后又被染上了复染液（番红）的颜色，因此呈现红色。

三、器材大肠杆菌，金黄色葡萄球菌12～20h斜面培养物；革兰氏染液，载玻片，显微镜等。

四、操作步骤1. 涂片取两块载玻片，各滴一小滴蒸馏水于玻片中央，用接种环以无菌操作分别从培养14～16h的枯草芽孢杆菌和培养24h的大肠杆菌的斜面上挑取少量菌苔于水滴中，混匀并涂成薄膜。

载玻片要洁净无油迹；滴蒸馏水和取菌不宜过多；涂片要均匀，不宜过厚。

2. 干燥室温自然干燥。

3. 固定固定时通过火焰2～3次即可。

此过程称热固定，其目的是使细胞质凝固，以固定细胞形态，并使之牢固附着在载玻片上。

热固定温度不易过高，以载玻片背面不烫手为宜，否则会改变甚至破坏细胞形态。

4. 初染加草酸铵结晶紫一滴，约1～2min，水洗。

5. 媒染滴加碘液冲去残水，并覆盖约1min，水洗。

6. 脱色将载玻片上面的水甩净，并衬以白背景，用95％酒精滴洗至流出酒精刚刚不出现蓝色时为止，约20～30s，立即用水冲净酒精。

实验二细菌的形态观察（简单染色法和革兰氏染色法）实验二细菌的形态观察（简单染色法和革兰氏染色法）一目的要求1．了解简单染色法和革兰氏染色法的基本原理，熟练掌握细菌的涂片与革兰氏染色技术。

2．初步学习细菌细胞特殊结构的染色方法，并观察细菌的特殊结构。

3．观察细菌的菌落平板，学会识别大肠杆菌、枯草杆菌和金黄色葡萄球菌的菌落特征，学会初步鉴别微生物的种类的方法。

二实验内容与原理1．简单染色法原理简单染色法是利用单一染料对细菌进行染色的一种方法，一般用于观察个体形态与细菌排列。

由于细菌在中性、碱性或弱酸性环境中带负电荷，所以通常采用一种碱性染料如美蓝、碱性复红、结晶紫对细菌进行染色。

美蓝是美蓝的盐酸盐，可解离为带正电荷的美蓝，很容易与细菌结合使菌体着色。

染色后的细菌细胞与背景形成鲜明的对比，在显微镜下更易于识别。

简单染色过程：涂片→固定→染色→水洗→干燥→镜检涂片→ 固定→ 干燥→ 水洗、吸干→镜检→染色 1mim2．革兰氏染色法原理革兰氏染色法是由丹麦医生 Hans Christian Gram于 1884 年创立。

它是细菌学中很重要的鉴别染色法，因为通过此法染色，可将细菌鉴别为革兰氏阳性菌（G + ）和革兰氏阴性菌（G －）两大类。

革兰氏染色过程：涂片→固定→结晶紫初染（1min）→碘液媒染（1min）→乙醇脱色（95% 酒精,30s）→番红复染（30 秒）→干燥→镜检阳性菌：紫色阴性菌：红色革兰氏染色要点：（1）初染：用结晶紫，染色 1 分钟，水洗。

（2）媒染：加碘液覆盖 1 分钟后水洗。

（3）脱色：连续滴加 95％乙醇，约 30 秒，直到滴下的乙醇无色为止，水洗。

（4）复染：加番红染色 1 分钟，水洗。

（5）干燥。

（6）镜检：先低倍镜，后油镜观察。

注意：涂片要薄而均匀，脱色程度要控制得当。

学生做大肠杆菌，金黄色葡萄球菌，枯草杆菌的革兰氏染色。

观察细菌个体形态与排列，绘图。

3．芽孢染色原理细菌的芽孢壁比营养细胞壁厚，致密，透性差，着色和脱色都比营养细胞困难，故一般采用一种碱性染料并在微火上加热，或延长染色时间，使菌体和芽孢都染上颜色以后水洗或稀酸冲去菌体的染料，芽孢仍保留颜色，再用另一种对比鲜明的染料使菌体着色，如此可明显区分芽孢和营养体结构。

实验二革兰氏染色法【实验目的】1.学习并初步掌握革兰氏染色法。

2.了解革兰氏染色法的原理及其在细菌分类鉴定中的重要性。

3.巩固显微镜油镜的使用方法。

【实验仪器、材料】1.菌种：大肠杆菌，金黄色葡萄球菌菌液。

2.染色剂：革兰氏染色试剂盒（结晶紫染色液、碘液、脱色液（95%乙醇）、复红染液）。

3.仪器及其他物品：显微镜、香柏油、无水乙醇、载玻片、擦镜纸、滤纸、酒精灯、试管架、废液缸、记号笔、接种环、镊子、打火机等。

【实验内容】革兰氏染色法一、染色标本制备1.涂片取一张洁净的载玻片，滴加少许生理盐水，用无菌操作方法从试管中沾取菌液一环，与生理盐水研磨均匀，做一薄而均匀、直径约1cm的菌膜。

涂菌后将接种环火焰灭菌。

（事先在载玻片的反面滴加菌液的相应位置做好标记）2.干燥于空气中自然干燥。

亦可把玻片置于火焰上部略加温加速干燥。

(温度不宜过高)3.固定目的是杀死细菌并使细菌粘附在玻片上，便于染料着色，常用加热法，即将细菌涂片膜向上，通过火焰3次，以热而不烫为宜，防止菌体烧焦、变形。

此制片可用于染色。

二、染色l.初染滴加结晶紫覆盖菌膜，染lmin，自来水缓缓冲洗，甩去积水。

2.媒染滴加卢氏碘液，染lmin，水洗，甩去积水。

3.脱色滴加95%乙醇数滴，20s~30s，见紫色脱下立即用水冲洗，甩去积水。

4.复染滴加石炭酸复红液，染lmin，水洗，甩去积水，标本片用滤纸吸干。

三、镜检待染色片充分干燥后，用油镜观察。

【实验结果】葡萄球菌呈葡萄状排列，呈紫色，为革兰氏阳性菌；大肠杆菌为散在的短小杆菌，呈红色，为革兰氏阴性菌。

注：绘图展示染色结果【结果分析、讨论（结论与评价）】注：分析你的染色结果是否正确？如果不正确，请分析原因。

实验三细菌革兰氏染色法一、目的要求1. 掌握油镜的原理和使用方法；2. 了解革兰氏染色原理；3. 学习并掌握革兰氏染色的方法。

二、基本原理1. Gram与革兰氏染色革兰氏染色（Gram stain）是以丹麦医生Hans Christain Joachim（1853-1938）的名字命名的。

Gram在对死于肺炎的患者肺部组织进行检查时发现某些细菌对特定染料有很高的亲和力。

革兰氏染色法的基本步骤是：a．初染：结晶紫染色；b．媒染：碘液媒染；c．脱色：乙醇脱色；d．复染：番红复染。

经过这样的染色后，发现肺炎球菌保持蓝紫色，肺部组织背景为浅黄色，达到了将细菌与被感染的肺部组织区分开的目的。

几年以后，德国病理学家Carl Weigert （1845-1904）在Gram染色方法基础上加上番红复染，使其成为微生物学研究领域最常用的染色方法之一。

2. 基本原理革兰氏染色法可将细菌分成革兰氏阳性（G+）和革兰氏阴性（G-）两种类型，细菌对革兰氏染色的不同反应是由于它们细胞壁的成分和结构不同而造成的。

首先利用草酸铵结晶紫初染，所有细菌都会着上结晶紫的蓝紫色。

然后利用卢戈氏碘液作为媒染剂处理，由于碘与结晶紫形成碘-结晶紫复合物，增强了染料在菌体中的滞留能力。

之后用95%乙醇作为脱色剂进行处理时，两种细菌的脱色效果不同。

革兰氏阳性细菌细胞壁肽聚糖含量高，壁厚且脂质含量低，肽聚糖本身并不结合染料，但其所具有的网孔结构可以滞留碘-结晶紫复合物，现在一般认为乙醇处理可以使肽聚糖网孔收缩而使碘-结晶紫复合物滞留在细胞壁，菌体保持原有的蓝紫色。

而革兰氏阴性细菌细胞壁肽聚糖含量低，交联度低，壁薄且脂质含量高，乙醇处理时脂质溶解，细胞壁通透性增加，原先滞留在细胞壁中的碘-结晶紫复合物容易被洗脱下来，菌体变为无色，用复染剂（如番红）染色后又变为复染剂颜色（红）。

三、实验用品准备：灭菌玻片、10-100ul移液器、10-100ul灭菌移液吸头、100ul-1000ul移液器、100ul-1000ul移液吸头、接种环、酒精灯、打火机、革兰氏染色液、吸水纸、显微镜、香柏油、擦镜纸、计时器四、操作：1 涂片：取灭过菌的载玻片于实验台上，用移液枪吸取10ul待检样品滴在载玻片的中央，用烧红冷却后的接种环将液滴涂布成一均匀的薄层，涂布面不宜过大。