革兰氏染色教案资料

实验二细菌的革兰氏染色法一、目的要求1.掌握革兰氏染色的方法及原理。

2.进一步熟悉显微镜的使用二、基本原理1. 革兰氏染色的意义：革兰氏染色的反应是细菌分类和鉴定的重要性状。

它是1884年由丹麦医生Gram 创立的。

革兰氏染色法（Gram stain）不仅能观察到细菌的形态特征而且还可将所有细菌区分为两大类：染色反应呈蓝紫色的称为革兰氏阳性细菌，用G+表示；染色反应呈红色（复染颜色）的称为革兰氏染色阴性细菌，用G-表示。

2. 革兰氏染色的原理：细菌对于革兰氏染色的不同反应，是由于它们细胞壁的成分和结构不同造成的。

革兰氏阳性细菌的细胞壁主要是肽聚糖形成的网状结构组成的，在染色过程中，当用乙醇处理时，由于脱水而引起网状结构中的孔径变小，通透性降低，使结晶紫－碘复合物被保留在细胞内而不易着色，因此，呈现蓝紫色；革兰氏阴性细菌的细胞壁中肽聚糖含量低，而脂类物质含量高，当用乙醇处理时，脂类物质溶解，细胞壁的通透性增加，使结晶紫－碘复合物易被乙醇抽出而脱色，然后又被染上了复染液（番红）的颜色，因此呈现红色。

三、器材大肠杆菌，金黄色葡萄球菌12～20h斜面培养物；革兰氏染液，载玻片，显微镜等。

四、操作步骤1. 涂片取两块载玻片，各滴一小滴蒸馏水于玻片中央，用接种环以无菌操作分别从培养14～16h的枯草芽孢杆菌和培养24h的大肠杆菌的斜面上挑取少量菌苔于水滴中，混匀并涂成薄膜。

载玻片要洁净无油迹；滴蒸馏水和取菌不宜过多；涂片要均匀，不宜过厚。

2. 干燥室温自然干燥。

3. 固定固定时通过火焰2～3次即可。

此过程称热固定，其目的是使细胞质凝固，以固定细胞形态，并使之牢固附着在载玻片上。

热固定温度不易过高，以载玻片背面不烫手为宜，否则会改变甚至破坏细胞形态。

4. 初染加草酸铵结晶紫一滴，约1～2min，水洗。

5. 媒染滴加碘液冲去残水，并覆盖约1min，水洗。

6. 脱色将载玻片上面的水甩净，并衬以白背景，用95％酒精滴洗至流出酒精刚刚不出现蓝色时为止，约20～30s，立即用水冲净酒精。

实验三细菌革兰氏染色法一、目的要求1. 掌握油镜的原理和使用方法；2. 了解革兰氏染色原理；3. 学习并掌握革兰氏染色的方法。

二、基本原理1. Gram与革兰氏染色革兰氏染色（Gram stain）是以丹麦医生Hans Christain Joachim（1853-1938）的名字命名的。

Gram在对死于肺炎的患者肺部组织进行检查时发现某些细菌对特定染料有很高的亲和力。

革兰氏染色法的基本步骤是：a．初染：结晶紫染色；b．媒染：碘液媒染；c．脱色：乙醇脱色；d．复染：番红复染。

经过这样的染色后，发现肺炎球菌保持蓝紫色，肺部组织背景为浅黄色，达到了将细菌与被感染的肺部组织区分开的目的。

几年以后，德国病理学家Carl Weigert （1845-1904）在Gram染色方法基础上加上番红复染，使其成为微生物学研究领域最常用的染色方法之一。

2. 基本原理革兰氏染色法可将细菌分成革兰氏阳性（G+）和革兰氏阴性（G-）两种类型，细菌对革兰氏染色的不同反应是由于它们细胞壁的成分和结构不同而造成的。

首先利用草酸铵结晶紫初染，所有细菌都会着上结晶紫的蓝紫色。

然后利用卢戈氏碘液作为媒染剂处理，由于碘与结晶紫形成碘-结晶紫复合物，增强了染料在菌体中的滞留能力。

之后用95%乙醇作为脱色剂进行处理时，两种细菌的脱色效果不同。

革兰氏阳性细菌细胞壁肽聚糖含量高，壁厚且脂质含量低，肽聚糖本身并不结合染料，但其所具有的网孔结构可以滞留碘-结晶紫复合物，现在一般认为乙醇处理可以使肽聚糖网孔收缩而使碘-结晶紫复合物滞留在细胞壁，菌体保持原有的蓝紫色。

而革兰氏阴性细菌细胞壁肽聚糖含量低，交联度低，壁薄且脂质含量高，乙醇处理时脂质溶解，细胞壁通透性增加，原先滞留在细胞壁中的碘-结晶紫复合物容易被洗脱下来，菌体变为无色，用复染剂（如番红）染色后又变为复染剂颜色（红）。

三、实验用品准备：灭菌玻片、10-100ul移液器、10-100ul灭菌移液吸头、100ul-1000ul移液器、100ul-1000ul移液吸头、接种环、酒精灯、打火机、革兰氏染色液、吸水纸、显微镜、香柏油、擦镜纸、计时器四、操作：1 涂片：取灭过菌的载玻片于实验台上，用移液枪吸取10ul待检样品滴在载玻片的中央，用烧红冷却后的接种环将液滴涂布成一均匀的薄层，涂布面不宜过大。

说课教案革兰氏染色实验原理介绍：革兰氏染色的差异主要是由于阴性与阳性细菌细胞壁的差异所应起的。

革兰氏阳性菌：细胞壁厚，肽聚糖网状分子层次较多且结构致密，当乙醇脱色时，肽聚糖脱水而孔径缩小，在结晶紫-碘液染色后保留了结晶紫-碘复合物。

呈紫色。

番红复染后任呈现紫色。

革兰氏阴性菌：肽聚糖层薄，交联松散，乙醇脱色不能使其结构收缩，其脂含量高,乙醇将脂溶解，缝隙加大，结晶紫-碘复合物溶出细胞壁，番红复染后呈红色。

一、教学目标1、知识目标：学习并初步掌握革兰氏染色法；了解革兰氏染色法的原理及其在细菌分类鉴定中的重要性。

2、能力目标：引导学生体验“实践—理论—实践”的一般认知规律；通过实验现象思考客观事实本质；培养学生实验探索的能力,提高学生发现问题、分析问题、解决问题的能力。

3、情感目标：体现学生的主体地位；展示生物学的魅力，激发学生物学的兴趣；培养理论联系实际的科学态度、实验探究能力与创新意识；培养学生的集体荣誉感。

二、教学对象1、学生具备生物学、化学的基本知识，有一定生物学实验、化学实验的基础。

2、前面学习了细菌的简单染色法。

3、学生学习积极性相对较差。

三、教学策略1、思想方法：以建构主义理论为指导，知识呈现、自主协作、知识建构2、过程方法：体现学生主体意识和教师的引导作用课题引入、学生阅读、给出过程、学生探究、实验分析3、认知方法：体现认知规律感性认识到理性认识，从现象看本质。

设计思想：以建构主义理论为指导，通过课题引入，学生对教材进行阅读，在老师的帮助下明确实验步骤，按步骤实施实验，汇报实验结果，提出问题、分析讨论问题。

探究性实验能激发学生的求知欲，进而引发学生对问题的自主协作式的探究学习；对实验现象的记录、分析探讨等活动，达到对知识的掌握，思维的扩展；学生在整个学活动中实现知识的感性认识到理性认识的升华，体现了学生的主体地位。

教师的引导、实验结果及问题的分析讨论，体现了在整个学习过程中的主导作用。

实验八、细菌革兰氏染色实验一、实验目的和内容目的：1.熟悉油镜的使用与保养。

2.掌握细菌革兰氏染色法的原理及实验操作。

3.了解革兰氏染色实验在细菌分类鉴定上的重要性。

内容：1.学习显微镜（油镜）的使用和保养。

2.学习细菌革兰氏染色实验。

3.用油镜观察枯草芽孢杆菌和金黄色葡萄球菌染色装片并判断其结果。

二、实验原理革兰氏染色法是1884年由丹麦病理学家C．Gram所创立的。

革兰氏染色法可将所有的细菌区分为革兰氏阳性菌(G+)和革兰氏阴性菌(G-)两大类，是细菌学上最常用的鉴别性染色法。

染色前必须先固定细菌，其目的有二：一是杀死细菌，使细胞质凝固，菌体粘附于玻片上；二是增加其对染料的亲和力。

常用的有加热和化学固定两种方法。

固定时应尽量维持细胞原有形态，防止细胞膨胀或收缩。

三、实验材料和用具（1）菌种：培养12-16h的苏云金杆菌（Bacillus thuringiensis）或者枯草杆菌（Bacillus subtilis），培养24小时的青枯假单胞杆菌。

（2）染色液和试剂：吕氏碱性美蓝染液(或草酸铵结晶紫染液)，石炭酸复红染液、结晶紫、鲁哥尔碘液、95 %酒精、复染剂（蕃红）、二甲苯、香柏油。

（3）器材：废液缸、洗瓶、载玻片、接种杯、酒精灯、打火机、记号笔、擦镜纸、显微镜。

四、实验步骤：①涂片：取干净载玻片一块，在载玻片的加一滴蒸馏水，按无菌操作法取菌涂片，做成菌液。

干燥（可过火3—4次）制成薄的涂面，注意取菌不要太多，过火速度要快。

②初染：在做好的涂面上滴加草酸铵结晶紫染液，染1 min，倾去染液，流水冲洗至无色。

③媒染：先用新配的碘液冲去残水，而后用其覆盖涂面1 min，后水洗。

④脱色：除去残水后，滴加95 %酒精进行脱色约15－20 sec，后立即用流水冲洗。

⑤复染：滴加复染剂——番红染色液，染3－5 min，水洗后用吸水纸吸干。

⑥镜检：先低倍观察，再高倍观察，并找出适当的视野后，将高倍镜转出，在涂片上加香柏油一滴，将油镜头浸入油滴中仔细调焦观察染色结果并绘图。

革兰氏染色一、实验目的1.练习微生物制片操作过程；2.练习染色技术；3.能正确使用显微镜。

二、实验原理G﹢菌：细胞壁厚，肽聚糖网状分子形成一种透性屏障，当乙醇脱色时，肽聚糖脱水而孔隙缩小，故保留结晶紫-碘复合物在细胞膜上。

呈紫色。

Gˉ菌：肽聚糖层薄，交联松散，乙醇脱色不能使其结构收缩，其脂含量高,乙醇将脂溶解，缝隙加大，结晶紫-碘复合物溶出细胞壁，番红染液复染后呈红色。

三、实验仪器、试剂显微镜、酒精灯、接种环、玻片、结晶紫、草酸铵、碘、碘化钾、乙醇、番红四、思考题革兰氏染色中所观察微生物没有生命活性，在操作过程中接种环可否不经过灼烧灭菌？双手是否可以不经过酒精棉消毒？五、实验步骤1.载玻片的清洁点燃酒精灯、将酒精浸泡的载玻片取出、烧去多余的酒精灭菌。

2.涂片①在酒精灯火焰旁、按无菌操作法图片：首先在载玻片上滴一小滴蒸馏水，用灼烧过的接种针挑取少量菌种，置载玻片的水滴中与水混合并涂抹开，注意涂抹要均匀平坦，涂抹后直径约为1 cm的薄层。

②可先做浓菌液、再做染色涂面，便于观察。

③涂片完灼烧接种环。

3.干燥、固定将载玻片在火焰上方快速来回通过一两次，以载玻片的加热面接触手背皮肤，不觉过烫为佳，待冷却后再在火焰上方来回通过一两次，再冷却，这样重复操作直到薄层干了为止。

4.初染在制好的片上滴一滴草酸铵结晶紫，染色1 min后用水洗，注意水流不要直接对准薄层。

5.媒染。

加卢戈碘液大概一滴，作用1 min后6.水洗注意流水不要直接往薄层上冲，用过滤纸吸干。

7.脱色。

用95%乙醇脱色，一般脱色时间大概为30 s。

这一步是革兰氏染色的关键，必须严格掌握好，如果脱色时间过长则会把阳性菌误认为阴性菌；如果脱色不够则容易被误认为是阳性菌。

（做对比实验、一个脱色30s、另一个脱色2min、观察实验结果是否一样）8.水洗、干燥9.复染滴加0.5%的番红染色一滴，液染色10～30 s后，用自来水冲洗。

10.镜检干燥后，用油镜镜检观察，并做好记录。

实验四革兰氏染色法实验教学课题：实验四革兰氏染色法实验教学目的：1学习微生物涂片、染色的基本技术，掌握细菌的革兰氏染色。

2了解革兰氏染色法的原理及其在细菌分类鉴定中的重要性。

实验教学重点：细菌革兰氏染色原理和步骤。

实验教学难点：酒精洗脱时间。

实验用品：1大肠杆菌24h的斜面培养物。

2 乳酸菌24h的斜面培养物。

3 简单染色液（美蓝染色液、黑色素液或炭素墨水）4 革兰氏染色液（结晶紫染液、卢戈氏碘液、95%乙醇、石碳酸复红）5 载玻片、盖玻片、接种环、镊子、酒精灯、火柴、玻璃铅笔、蒸馏水等。

6 显微镜、香柏油、二甲苯、擦镜纸、吸水纸等。

实验教学方法与手段：板书讲解+演示实验＋学生动手实验教学课时：4课时教学过程：一、实验原理1 简单染色的原理大多数微生物细胞质是带负电荷，简单染色时采用已知的、带正电荷的碱性染料。

染料适用于热固定的涂片，染料与菌体细胞质黏附使菌体着色。

经染色后的细菌细胞与背景形成鲜明对比。

2 革兰氏染色的原理革兰氏阳性菌的细胞壁主要有肽聚糖形成的网状结构组成，在染色过程中，当用95%乙醇处理时，由于脱水而引起网状结构中的孔径变小，细胞壁的通透性降低，使结晶紫-碘复合物被保留在细胞壁内而不易脱色，因此呈蓝紫色。

革兰氏阴性菌的细胞壁中肽聚糖含量低，脂类物质含量高，当用乙醇处理时，脂类物质溶解，细胞壁的通透性增加，使结晶紫-碘复合物容易被乙醇抽提出来而脱色，然后又被染上了复染剂的颜色，因此呈现红色。

二、实验方法和步骤1、简单染色(1) 涂片:取两块干净的载玻片，各滴一小滴生理盐水于载玻片中央，用无菌操作分别挑取金黄色葡萄球菌和大肠杆菌于二载玻片的水滴中（每一种菌制一片），调匀并涂成薄膜。

注意滴生理盐水时不宜过多，涂片必须均匀。

(2) 干燥：自然气干或酒精灯高处微微加热。

(3) 固定:于火焰上通过2—3次。

(4) 染色：在整个涂面上滴加齐氏石炭酸复红，染色１分钟。

（5）水洗：倾去染液，用自来水细流冲洗至流下的水中无染料颜色为止。

项目3：革兰染色法【目的要求】掌握细菌涂片标本的制作及革兰染色法。

【实验内容】细菌微小、无色半透明、未经染色而单用显微镜放大，仅能粗略地看到其大小和形态；欲观察清楚，必须进行染色。

染色后还能认识细菌的各种不同结构，并可协助鉴别细菌。

染色方法有单染法和复染法。

前者应用一种染料使细菌着色，用以观察细菌的大小、形态和排列；后者用两种或两种以上的染料，有助于鉴别细菌，故又称鉴别细菌染色法。

革兰染色法为最常用的染色法。

一、细菌涂片的制作要进行细菌染色，首先需制作细菌涂片，制片的一般过程分涂片、干燥和固定三个步骤。

【材料】普通琼脂平板菌落或斜面培养物，生理盐水，载玻片，接种环、酒精灯等。

【方法】1．涂片：在玻片上加少量生理盐水，用接种环取细菌培养物少许，在生理盐水中混匀，并涂布一层薄膜，取材勿过多，以免涂片太厚。

如用液体培养物，不需加生理盐水，有菌的接种环应立即在酒精灯火焰上烧灼灭菌。

2．干燥：涂片置室温自然干燥，也可在酒精灯弱火处略烘使干，切勿用高温烘烤。

3．固定：将干燥的涂片面向上在酒精灯火焰上来回通过三次，直至手背试触涂片反面略有烫感为限。

固定的目的是杀死细菌并使菌体与玻片粘附较牢，以免染色时被染料和水冲掉。

二、革兰（Gram）染色法革兰氏染色法(Gram’s stain)是最常用的细菌染色法，本实验要求同学能正确掌握此染色方法的操作技术，理解其在鉴别细菌上的重要意义。

【原理】细菌经结晶紫初染染成蓝色。

革兰氏染色阳性菌（G+）细胞壁肽聚糖层数多，且肽聚糖为空间网状结构，再经乙醇脱水，网状结构更为致密，染料复合物不易从细胞内漏出，仍为蓝色。

而革兰氏染色阴性菌（G—）细胞壁脂类含量多，肽聚糖层数少，且肽聚糖为平面片层结构，易被乙醇溶解，使细胞壁通透性增高，结合的染料复合物容易泄漏，细菌被脱色为无色，再经石炭酸复红稀释液复染成红色。

【材料】①金黄色葡萄球菌24h斜面培养物②大肠埃希菌24h肉汤培养物③革兰氏染色液：结晶紫染液、碘液、95％酒精、稀释石炭酸复红液④生理盐水⑤载物玻片、接种环、显微镜、镜油、擦镜纸等。

“革兰氏染色法”实验教学案例分析黄建忠制片与染色是微生物实验最基本、最基本的技术之一。

学生在此实验之前学生刚上完微生物理论课程，但还没有真正自己动手做过实验，没有实际的感受。

为了巩固学生的理论知识并培养学生扎实的实验基本功，本实验特别注重演示、示范。

采取老师演示结合学生动手的方法，边讲解边示范以便学生能够更好地掌握革兰氏染色法的技术。

一、目的要求1. 学习并掌握革兰氏染色法。

2. 了解革兰氏染色法的原理及其在细菌分类鉴定中的重要性。

二、基本原理革兰氏染色法是 1884 年由丹麦病理学家 Chrstain Gram 创立的，而后一些学者在此基础上作了某些改进。

革兰氏染色法是细菌学中最重要的鉴别染色法。

革兰氏染色程序和结果革兰氏染色法将细菌分为革兰氏阳性和革兰氏阴性，当用结晶紫初染后，像简单染色法一样，所有细菌都被染成初染剂的蓝紫色。

碘作为媒染剂，它能与结晶紫结合成结晶紫－碘的复合物，从而增强了染料与细菌的结合力。

当用脱色剂处理时，两类细菌的脱色效果是不同的。

革兰氏阳性细菌的细胞壁主要由肽聚糖形成的网状结构组成、壁厚、类脂质含量低，用乙醇(或丙酮)脱色时细胞壁脱水、使肽聚糖层的网状结构孔径缩小，透性降低，从而使结晶紫－碘的复合物不易被洗脱而保留在细胞内，经脱色和复染后仍保留初染剂的蓝紫色。

革兰氏阴性菌则不同，由于其细胞壁肽聚糖层较薄、类脂含量高，所以当脱色处理时，类脂质被乙醇(或丙酮 )溶解，细胞壁透性增大，使结晶紫－碘的复合物比较容易被洗脱出来，用复染剂复染后，细胞被染上复染剂的红色。

有芽胞的杆菌和绝大多数球菌，以及所有的放线菌和真菌都呈革兰氏正反应；弧菌，螺旋体和大多数致病性的无芽胞杆菌都呈现负反应。

革兰氏染色的主要原理是由于革兰氏阳性菌和革兰氏阴性菌在化学组成和生理性质上有很多差别，染色反应不一样。

现在一般认为革兰氏阳性菌体内含有特殊的核蛋白质镁盐与多糖的复合物，它与碘和结晶紫的复合物结合很牢，不易脱色，阴性菌复合物结合程度底，吸附染料差，易脱色，这是染色反应的主要依据。