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微生物学实验报告大肠杆菌营养缺陷型菌株的诱变和筛选山东大学生命科学学院2010.6.10大肠杆菌营养缺陷型菌株的诱变和筛选摘要：营养缺陷型菌株或称异养型（auxotroph）菌株是许多微生物生理生化以及遗传研究的重要菌株材料。
此类菌株不仅在生物研究方面有着很重要的作用，而且在生物工程和生物技术上都有很重要的作用。
营养缺陷型菌株的筛选也成为了微生物科学工作者必备的基本实验技能之一。
本实验以大肠杆菌原养型菌株为材料，实验了营养缺陷型的诱变获得及筛选，从而了解细菌营养缺陷性的获得步骤，掌握氨基酸营养缺陷型的筛选方法和鉴别过程。
关键词：营养缺陷紫外诱变筛选生长谱测定大肠杆菌（E.coli）一、背景与原理营养缺陷型菌株指的是因自发突变或诱变丧失合成某些生活必需物质的能力的菌株。
营养缺陷型菌株不能在基本培养基上生长（增殖），必须补充一种或一种以上的营养物质才能生长。
此类突变体在理论研究和生产实践中都有重要意义，是作为研究代谢途径和遗传规律不可少的标记菌种，亦可直接用于生产氨基酸、核苷酸等代谢产物。
例如，顺反子概念的提出、基因工程转化结果的鉴定等，都是利用了营养缺陷型菌株。
.菌株自发突变为营养缺陷型的概率是很低的。
因此现代微生物遗传学实验中，为了有目的的获得营养缺陷型菌株，实验人员往往以人工诱变的方法来获得营养缺陷型。
实验中，以各种致突变因子（物理、化学等）处理待突变细胞，然后进行筛选和鉴定，获得营养缺陷型菌株。
能够用来进行诱变的物质很多，例如各种射线、紫外线、DNA染色剂、碱基类似物、强氧化剂等，但是一般实验室中最常见也最有效地史紫外线诱变法。
在紫外线照射下，DNA发生不同程度的损伤，而且会形成大量的嘧啶二聚体。
处理完细胞后，在防止光复活的前提下，细胞中DNA的损伤得不到有效修复或者只能得到SOS 修复，会形成大量的基因突变，在细胞总量较大的前提下，就有机会获得一定得目的菌株。
用于诱变处理的微生物一般处于对数生长期，那时的细菌对诱变剂的反应最灵敏。
实验三营养缺陷型的筛选一、教学目标及基本要求理解选育营养缺陷型突变株的选育原理，掌握营养缺陷型突变株的筛选方法。
二、实验原理营养缺陷型是野生型菌株由于基因突变，致使细胞合成途径出现某些缺陷，丧失合成某些物质的能力，必须在基本培养基中外源补加该营养物质，才能正常生长的一类突变株。
其本质是一种减低或消除末端产物浓度，以解除反馈控制的代谢调控方式，使代谢途径中间产物或分支合成途径中末端产物得以积累。
营养缺陷型菌株广泛应用于氨基酸，核苷酸，维生素的生产中，也广泛应用于基因定位，杂交及基因重组等研究中的遗传标记制作。
三、实验材料1. 菌种枯草杆菌（B.subtilis）。
2. 培养基(1) 细菌完全培养基（CM）葡萄糖0.5%，牛肉膏0.3%，酵母膏0.3%，蛋白胨1%，MgSO4·7H2O0.2%，琼脂2%，PH7.2。
(2) 细菌基本培养基（MM）葡萄糖0.5%，MgSO4·7H2O0.2%，柠檬酸钠0.1%，(NH4)2SO40.2%,K2HPO40.4%,琼脂2%(处理琼脂)。
配制基本培养基的药品均用分析纯；使用的器皿要洗净，用蒸馏水冲洗2~3次，必要时用重蒸馏水冲洗。
(3) 无氮基本培养基在基本培养基中不加(NH4)2SO4和琼脂。
(4) 二倍氮源基本培养基在基本培养基中加入2倍(NH4)2SO4，不加琼脂。
(5) 限制培养基（SM）向配好的液体基本培养基中加入0.1~0.5%的完全培养基，加入2%琼脂。
3. 溶液(1) 无维生素的酪素水解物或氨基酸混合液。
(2) 水溶性维生素混合液。
(3) 核酸水解液：取2g RNA，加入15ml 1mol/L NaOH；另取2g RNA，加入15ml1mol/L HCl，分别于100℃水浴加热水解20min后混合，调整pH值为6.0，过滤后调整体积为40ml。
4. 其它：无菌小滤纸片，干净镊子，无菌移液管，培养皿，酒精灯等。
四、实验内容1. 菌体前培养取新活化的的枯草芽孢杆菌斜面菌种1环，接入装有20ml完全培养基的250ml三角瓶中，30℃振荡培养16~18h。
紫外突变技术及抗药性突变菌株的筛选简述后培养的目的及注意事项
紫外突变技术是利用紫外线辐射使细菌基因发生突变的一种方法,可以产生新的遗传变异体。
抗药性突变菌株的筛选则是指通过对细菌进行一定的选择压力（如加入抗生素）,筛选出能够产生抗药性的突变体。
经过紫外线诱导后得到的突变体需要进行培养,在培养中筛选出对目的选择压力具有抗性的突变体。
比如,如果目的是筛选出抗生素的突变体,则应将突变体接种到含有抗生素的培养基上进行筛选。
同时,也要注意对突变体进行鉴定,以保证所得到的新型细菌具有确定的生物学特性。
在突变体筛选及后续培养过程中还要注意以下事项：
1. 突变体要保存得当,以避免遗失或污染。
2. 筛选条件需要严格控制,确保所选出的突变体的稳定性和选择压力的可逆性。
3. 培养基的组成要根据不同的目标进行合理调配,以保证突变体的稳定性和生长情况。
4. 突变体的鉴定需要进行多种生化测试,以保证其具有目的性的变异和稳定的遗传特征。
工业微生物育种实验细菌营养缺陷型菌株的诱变和筛选鉴定关于菌株的几个概念：野生型菌株：从自然界分离到的微生物在其发生突变前的原始状态。
营养缺陷型：野生型菌株经过人工诱变或自然突变失去合成某种营养的能力，只有在基本培养基中补充所缺乏的营养因子才能生长。
原养型：营养缺陷型菌株经回复突变或重组后产生的菌株，其营养要求在表型上和野生型相同关于培养基：基本培养基（minimal medium，MM）：仅能满足微生物野生型菌株生长需要的培养基，用[－]来表示。
完全培养基（complete medium，CM）：凡可满足一切营养缺陷型菌株营养需要的天然或半组合培养基。
用[＋]来表示。
补充培养基（supplemental medium，SM）：凡只能满足相应的营养缺陷型生长需要的组全培养基，它是在基本培养基中加入该菌株不能合成的营养因子而组成。
摘要：本实验选用紫外线为诱变剂，来诱发大肠杆菌突变，并用青霉素法淘汰野生型，逐个测定法检出缺陷型，获得100#大肠杆菌菌株，最后经生长谱法鉴定出该菌株为脯氨酸缺陷型。
关键词：大肠杆菌紫外线营养缺陷型青霉素逐个测定法生长谱法一、实验目的1、了解营养缺陷型突变株选育的原理。
2、学习并掌握细菌氨基酸营养缺陷型的诱变、筛选与鉴定方法。
二、实验原理筛选营养缺陷型菌株一般具有四个环节：诱变处理、营养缺陷性的浓缩、检出、鉴定缺陷型。
本实验选用紫外线为诱变剂，来诱发突变，并用青霉素法淘汰野生型，逐个测定法检出缺陷型，最后经生长谱法鉴定细菌的营养缺陷型。
三、实验器材离心机，紫外线照射箱，冰箱，恒温箱，高压灭菌锅；三角烧瓶，试管，离心管，移液管，培养皿，接种针四、实验材料(一)菌种E.coli(二)培养基、1LB培养液：酵母膏，0.5g；蛋白胨，1g；NaCl，0.5g；水，100ml，pH7.2 121℃灭菌15min22×LB培养液：其它不变，水，50ml。
3基本培养基：葡萄糖0.5 g，(NH4)2SO4 0.1 g，柠檬酸钠0.1 g，MgSO4·7H2O0.02 g，K2HPO4 0.4 g，KH2PO4 0.6 g，重蒸水100 mL，pH 7.2，110℃灭菌20 min。
营养缺陷型菌株的筛选方法
营养缺陷型菌株的筛选是一种重要的技术，主要应用于基因组学研究、菌种鉴定、病
原学研究及微生物资源保护。
营养缺陷型菌株是有针对性的，可作为正常菌株的突变体，
以提高实验在病原性、耐受性等方面的准确性。
因此，有效的筛选营养缺陷型菌株不容忽视。
营养缺陷型菌株的筛选包括实验法和非实验法两种。
实验法是采用固定条件，通过控
制外源营养物质完全缺乏或有限，使某一肽或多肽水平落到特定值，从而引起营养缺损型
菌株的筛选；非实验法则是依据基因数据库中发现的营养物质代谢路径分析，筛选出能够
诱导营养缺陷菌株的基因。
具体步骤如下：
1、构建营养培养基：根据需要，选择对营养缺陷型菌株的实验特异性的培养基，将
培养基进行稀释，以减少营养物质的含量。
2、处理营养缺陷型菌株：分离菌株，以营养缺陷型菌株为【测试菌】，无营养缺陷
的正常菌株为【对照菌株】。
3、培养对照菌株
将对照菌株接种于稀释的培养基中，摇匀，加热37℃翻转培养，室温培养12—18小时，待菌落出现，观察是否有正常菌落形成。
若有正常菌落出现，在16小时后再次观察，确定营养缺陷型菌株存在可能性。
5、数据分析：根据营养缺陷型菌株的表型分析结果，确定可能存在营养缺陷型菌株
的培养基形式，进行深入分析，以便更好地了解营养缺陷的突变机理。
营养缺陷型菌株的筛选是一项复杂的工作，仅依靠一种筛选方法是不够的，为了使筛
选更有效率和准确，应该综合使用上述多种筛选方法，全面分析各种可能的内因、外因对
营养缺陷型菌株发生的影响，以实现科学准确的筛选结果。
微生物大实验细菌营养缺陷型菌株的诱变和筛选细菌营养缺陷型菌株的诱变和筛选摘要用某些物理因素或是化学因素，使基因发生突变，丧失合成某一物质的能力，因而它们在基本培养基上不能生长，必须补充某些物质才能生长，这样从野生菌经诱变筛选到的菌株，称为营养缺陷型。
紫外线可以诱导细菌发生突变，产生营养缺陷型菌株。
筛选营养缺陷型菌株必须经过如下几个步骤：诱变处理、营养缺陷型的检出、划线复证、生长谱鉴定、缺陷型菌株纯化。
又因处理的细菌所得到的突变菌仍然是很少的部分，因此必须采用有效的筛选方法，才能分离到突变型。
关键词紫外诱变营养缺陷型营养缺陷型的检出划线复证生长谱鉴定引言营养缺陷型：需要在基本培养基中补加某种营养成分（如氨基酸、维生素、核苷酸等）才能生长的微生物突变体，通过基因突变产生。
微生物细胞本身能吸收周围环境中的简单营养物，经过自身代谢合成生长所需的各类营养物质。
如果发生基因突变，则细胞失去合成与这些基因有关营养物质的能力，只有在培养基中补加这类营养物质后，突变细胞才能生长，故又名营养缺陷型突变体。
此类突变体在理论研究和生产实践中都有重要意义，是研究代谢途径和遗传规律必不可少的标记菌种，亦可直接用于生产氨基酸、核苷酸等代谢产物。
为了获得营养缺陷型菌株，需从诱变处理后的菌液中认真筛选，以便检出突变体，常用的方法有：影印接种法、夹层培养法和青霉素浓缩法等。
影印接种法：将待测的浓缩菌悬液涂在完全培养基平板上，待其长好后作为母平板。
用一小块灭菌的丝绒固定在直径较平板略小的圆柱形木块上，作为接种工具。
用它在母平板上轻轻印一下，再在基本培养基平板上印一下，经培养后，影印平板上长出的菌落与母平板上的菌落位置对应，比较二个平板上菌落的生长状况，即可从相应位置的母平板上选出待测的营养缺陷型菌株。
夹层培养法：先在培养皿中倒一层不含菌的基本培养基，待冷凝后，加一层含菌的基本培养基，冷凝后，再加一层不含菌的基本培养基，经培养出现菌落后，在培养皿底的相应位置做上标记，然后再加一层完全培养基。
实验五、营养缺陷型菌株筛选及鉴定1、实验名称营养缺陷型菌株筛选及鉴定2、实验操作人3、实验过程简述3.1 营养缺陷型菌株诱变3.1.1培养基的配制配置两种类型的培养基，营养丰富培养基（YPD）和基本培养基（SC），其中营养丰富的培养基在诱变的过程中用来培养菌株，在基本培养基中选择性的加入氨基酸来进行筛选，分别标记为：SC5 (SC+His+Trp+Leu+Lys+Ura)；SC5-Lys (SC+His+Trp+Leu+Ura) SC5-Leu (SC+His+Trp+Lys+Ura)；SC5-Trp (SC+His+Leu+Lys+Ura)；SC5-His (SC+Trp+Leu+Lys+Ura)；SC5-Ura(SC+His+Trp+Leu+Lys)。
3.1.2稀释涂布在超净台，取0.1 ml菌悬液转接到0.9 ml无菌水中，混匀后，取0.1 ml 稀释液转接到0. 9 ml无菌水中，混匀后，继续进行10倍的梯度稀释，稀释到10-6；取0.1 ml稀释度分别为10-4、10-5、10-6的菌悬液，加入到YPD固体平板上，用涂布棒涂布均匀，每个稀释度涂5块平板；3.1.3紫外诱变每个稀释度各取一块平板，培养皿底部标记好组号-稀释度-紫外处理时间，将平板适当垫高，防止诱变不充分，用紫外照射分别诱变处理0、30、45、60、120秒，黑布包好，置于30℃培养箱培养48h；记录各平板上的菌落数，计算不同处理的细胞致死率。
致死率（%）=1-（特定时间点平板上菌落数X稀释倍数）/（0时平板上菌落数X 稀释倍数）X100%3.2 营养缺陷型菌株初筛3.2.1选取单菌落小组内部四人分别标号为A/B/C/D（本人标号为A）,本次实验选用了两种敏感性不同的菌株，选取两种菌株内生长较好的平板，每个平板每人取3个单菌落（每人2菌×3个单菌落），用记号笔圈出标记为A1/A2/…A6防止重复挑取；取1.5ml离心管装入1ml无菌水，用接种环从YPD平板上挑取单菌落，转接到无菌水中，摇匀，室温静置2h；3.2.2点板在准备好的YPD、SC培养基平板底部做标记（培养基名称-组号）,将小组成员点菌位置画好格子；分别取一接种环菌悬液对应点于SC和YPD培养基平板上（每人1行，做好标记）；将培养皿倒置于30℃培养箱中，培养48h，注意无论涂板、还是点板，一定等菌液被培养基吸收后，再挪动或倒置；记录各单菌落在不同培养基上生长情况（生长记“+”，不生长记“-”），并拍照；根据生长情况，判断本实验各菌株是否为营养缺陷型菌株。
大肠杆菌营养缺陷型菌株的筛选一、实验原理在以微生物为材料的遗传学研究中，用某些物理因素或化学因素处理细菌，使基因发生突变，丧失合成某一物质(如氨基酸、维生素、核苷酸等)的能力，因而它们不能在基本培养基上生长，必须补充某些物质才能生长。
这样从野生型经诱变筛选得到的菌株，称为营养缺陷型。
筛选营养缺陷型菌株必须经过以下几个步骤:诱变处理、淘汰野生型、检出缺陷型、鉴定缺陷型。
由于本实验是以大肠杆菌为材料，所以根据细菌的特性分别说明筛选的步骤。
诱变剂的作用主要是提高突变频率，它分为物理和化学的二类。
物理诱变剂常用的有X射线、紫外线、快中子、γ射线等诱变处理首先是选择诱变剂，微生物诱变中最常用的物理诱变剂是紫外线。
诱变剂所处理的微生物，一般要求呈单核的单细胞或单孢子的悬浮液，分布均匀，这样可以避免出现不纯的菌落。
用于诱变处理的微生物一般处于对数生长期，那时的细菌对诱变剂的反应最灵敏。
2诱变处理必须选择合适的剂量，剂量的表示有二种，绝对剂量和相对剂量。
绝对剂量的单位以尔格/cm表示，一般用相对剂量。
相对剂量与三个因素有关，这三个因素是:诱变源和处理微生物的距离，诱变源(紫外灯)的功率，以及处理的时间。
前二个因素是固定的，所以通过处理时间控制诱变剂量。
各种微生物的处理最适剂量是不同的，须经预备实验确定。
经处理以后的细菌，缺陷型还是相当少的，必须设法淘汰野生型细胞，提高营养缺陷型细胞所占比例，以达到浓缩缺陷型的目的。
细菌中常用的浓缩法是青霉素法。
青霉素是杀菌剂，它只杀死生长的细胞，对不生长的细胞没有致死作用。
所以在含有青霉素的基本培养基中野生型能长而被杀死，缺陷型不能长被保存得以浓缩。
检出缺陷型的方法有逐个测定法、夹层培养法、限量补给法、影印培养法。
这里主要以逐个测定法为例进行说明。
把经过浓缩的缺陷型菌液接种在完全培养基上，待长出菌落后将每一菌落分别接种在基本培养基和完全培养基上。
凡是在基本培养基上不能生长而在完全培养基上能长的菌落就是营养缺陷型。
