微生物分离培养和菌种保藏

微生物菌种保藏方法1、传代保存法：有些微生物当遇到冷冻或干燥等处理时，会很快死亡，因此在这种情况下，只能求助于传代培养保存法。

传代培养就是要定期地进行菌种转接、培养后再保存，它是最基本的微生物保存法，例如酸奶等常用生产菌种的保存。

传代保存时，培养基的浓度不宜过高，营养成分不宜过于丰富，尤其是碳水化合物的浓度应在可能的范围内尽量降低。

培养温度通常以稍低于最适生长温度为好。

若为产酸菌种，则应在培养基中添加少量碳酸钙。

一般地，大多数菌种的保藏温度以5℃为好，像厌氧菌、霍乱弧菌及部分病原真菌等微生物菌种则可以使用37℃进行保存，而蕈类等大型食用菌的菌种则可以室温直接保存。

传代培养保存法虽然简便，但其缺点也很明显，如：①菌种管棉塞经常容易发霉；②菌株的遗传性状容易发生变异；③反复传代时，菌株的病原性、形成生理活性物质的能力以及形成孢子的能力等均有降低；④需要定期转种，工作量大；⑤杂菌的污染机会较多。

2、液体石蜡覆盖保存法：该法较前一种方法保存菌种的时间更长，适用于霉菌、酵母菌、放线菌及需氧细菌等的保存。

此法可防止干燥，并通过限制氧的供给而达到削弱微生物代谢作用的目的。

其具有方法简便的优点，同时也适用于不宜冷冻干燥的微生物（如产孢能力低的丝状菌）的保存，而某些细菌如固氮菌、乳酸杆菌、明串珠菌、分枝杆菌、红螺菌及沙门氏菌等和一些真菌如卷霉菌、小克银汉霉、毛霉、根霉等不宜采用此法进行保存。

3、载体保存法：即将微生物吸附在适当载体上进行干燥保存的方法。

常用的有方法包括以下几种，如：①土壤保存法：主要用于能形成孢子或孢囊的微生物菌种的保藏。

方法是在灭菌的土壤中加入菌液，立即在室温下进行干燥或使菌体繁殖后再干燥，然后冷藏或在室温下密封保存。

保存用的土壤原则上以肥沃的耕土为宜，土壤需风干、粉碎、过筛和灭菌。

使微生物在土壤中繁殖后进行干燥保存的方法是：取适量土壤（5克）置于塞有棉塞的试管中，加水或加入充分稀释的液体培养基（以含水量为土壤最大持水量的60%为宜），然后高压灭菌。

生物安全实验室病原微生物菌（毒）种和生物样本的保存（保藏）实验室进行实验活动时，经常需要保存病原微生物菌（毒）种及样本。

无论是短期还是长期保存，都应遵循安全、存活、生物学特性不变以及避免差错等原则。

一、保藏管理《条例》规定：“国务院卫生主管部门或者兽医主管部门指定的病原微生物菌（毒）种保藏中心或者专业实验室（以下称保藏机构），承担集中储存病原微生物菌（毒）种和样本的任务。

”保藏机构应当依照国务院卫生主管部门或者兽医主管部门的规定，储存实验室送交的病原微生物菌（毒）种和样本，并向实验室提供病原微生物菌（毒）种和样本。

《传染病防治法实施办法》规定："一、二类病原微生物菌（毒）种的供应由国务院卫生行政部门指定的保藏管理单位供应。

三类菌（毒）种由设有专业实验室的单位或者国务院卫生行政部门指定的保藏管理单位供应。

”2009年7月16日，卫生部颁布了《人间传染的病原微生物菌（毒）种保藏机构管理办法》（原卫生部令第68号），《办法》规定保藏机构是指由原卫生部指定的，按照规定接收、检定、集中储存与管理病原微生物菌（毒）种或样本，并能向合法从事病原微生物实验活动的单位提供病原微生物菌（毒）种或样本的非营利性机构。

病原微生物菌（毒）种保藏机构应具有符合要求的生物安全实验室，包括既符合生物安全要求，又能够保证所保藏病原微生物菌（毒）种质量的设施、设备、技术操作人员和规章制度。

《浙江省病原微生物实验室生物安全管理办法（试行）》规定实验室设立单位应建立病原微生物菌（毒）种和样本保藏保管制度，落实安全责任部门和专人进行管理。

有关机构按照规定从事临床诊疗、疾病控制、检验检疫、教学和科研等工作，在确保安全的基础上，可以保管其工作中经常使用的病原微生物菌（毒）种或样本，其保管的病原微生物菌（毒）种或样本名单应当报当地卫生主管部门备案。

重点落实对高致病性病原微生物菌（毒）种和样本的安全保卫措施，加强安全管理与控制，设立专库专柜，单独储存，做好病原微生物菌（毒）种和样本进出和储存的记录，建立档案制度。

菌种保藏的几种方法
1. 冷冻保藏：把微生物悬浮在特定培养基中，置于-80℃或以下的低温条件下，使其失去酵母菌能够进行分裂和繁殖的能力。

2. 干燥保藏：将微生物分散悬浮在一定浓度的特定培养基中，然后用离子交换树脂吸附、电泳或超声波处理，使其失去水分而形成干燥有机物，再用热风烘干或真空烘干，将其存放在4-10℃的干燥室中进行保存。

3. 液氮保藏：采用特定的培养基将菌种分散悬浮，用离子交换树脂吸附、电泳或超声波处理，形成无水有机物，再将其放入液氮容器中，放入液氮中冷冻保存，液氮温度为-196℃，此温度可有效杀灭菌种中的生物活性，以达到保藏目的。

生产中常用菌种的分离、选育和保藏在生产中，分离、选育和保藏常用菌种是非常重要的步骤，这些菌种可以用于各种不同的应用，如发酵过程中的生物转化、抗生素的生产以及食品工业中的乳酸发酵等。

以下是常用菌种的分离、选育和保藏的基本步骤：1. 分离：分离菌种是指从自然环境中分离出纯种菌株的过程。

首先，需要选择合适的样品来源，如土壤、水样或食品样品等。

然后，将样品进行稀释、接种到固体培养基上，培养出菌落。

最后，从菌落中挑选单一菌株，并进行纯化培养，得到纯种菌株。

2. 选育：选育是指对已有菌种进行进一步培养和筛选，选出优良品系。

在选育过程中，可以根据所需特性进行筛选，如产量高、抗性强或代谢产物优良等。

通过连续传代培养和筛选，可以逐步培育出符合要求的优良品系。

3. 保藏：保藏是为了长期储存和保存已经分离和选育得到的菌种。

常用的保藏方法包括冷冻保存和冷冻干燥等。

冷冻保存是将菌种保存在低温 (-80℃或液氮温度下)，可以长期保存并保持菌株的生物学性状。

而冷冻干燥则是在低温下将菌种先冷冻，然后通过真空蒸发使其脱水，最后用密封容器保存。

冷冻干燥具有长期保存时间和较小的储存体积的优点。

在菌种的分离、选育和保藏过程中，需要注意的是严格遵守无菌操作规范，以防止杂菌污染。

另外，应该建立相应的菌种信息管理系统，记录并标注每个菌株的来源、特性以及保藏条件等重要信息，以便日后使用和查询。

菌种的分离、选育和保藏在生产中扮演着极其重要的角色。

下面将进一步探讨这些过程，并介绍一些常用的菌种及其应用领域。

在分离菌种的过程中，重要的是选择适当的样品来源。

不同的环境中存在着各种微生物，如土壤、水体、植物、动物及其制品等。

通过采集不同来源的样品，可以获得不同类型和特性的微生物，从而得到多样性的菌株资源。

在接种前，样品经过稀释，使微生物适当分散。

然后将稀释液均匀接种于固体培养基上，并进行孵育。

在培养过程中，微生物通过分裂繁殖形成菌落，而每个菌落代表一个菌株。

微生物菌种保藏方法菌种是一种重要的生物资源，菌种保藏是重要的微生物基础工作。

菌种保藏就是利用一切条件使菌种不死、不衰、不变，以便于研究与应用。

(一)常规保藏方法1 目的1.1 了解菌种保藏的基本原理1.2 掌握几种常用的菌种保藏方法。

2 原理菌种保藏的方法很多。

其原理却大同小异，不外乎为优良菌株创造一个适合长期休眠的环境,即干燥、低温、缺乏氧气和养料等。

使微生物的代谢活动处于最低的状态，但又不至于死亡，从而达到保藏的目的。

依据不同的菌种或不同的需求，应该选用不同的保藏方法。

一般情况下，斜面保藏、半固体穿刺,石蜡油封存和砂土管保藏法较为常用，也比较容易制作。

3 材料3.1菌株待保藏的适龄菌株斜面3.2培养基肉汤蛋白胨斜面，半固体及液体培养基。

3.3 试剂10%HCl无水氯化钙、石蜡油、五氧化二磷。

3.4 器具用于菌种保藏的小试管(10*100毫米)数支、5毫升无菌吸管、l 毫升无菌吸管等、灭菌锅、真空泵、干燥器、冰箱无菌水、筛子(40目、120目)、标签、接种针、接种环、棉花、牛角匙等等。

4 流程斜面保藏→半固体穿刺保藏→石蜡油封存→砂土管保藏5 步骤5.1斜面保藏5.1.1流程标记试管→接种→培养→保藏5.1.2步骤5.1.2.1贴标签取无菌的肉汤蛋白胨斜面数支。

在斜面的正上方距离试管口2-3厘米处贴上标签。

在标签纸上写明接种的细菌菌名、培养基名称和接种日期。

5.1.2.2斜面接种将待保藏的细菌用接种环以无菌操作在斜面上作划线接种。

5.1.2.3培养置37恒温箱中培养48小时。

5.1.2.4保藏斜面长好后，直接放入4℃的冰箱中保藏。

这种方法一船可保藏三个月至半年。

5.2半固体穿刺保藏5.2.1流程标记试管→穿刺接种→培养→保藏5.2.2 步骤5.2.2.1贴标签取无菌的半固体肉汤蛋白等直立柱数支，贴上标签，注明细菌菌名、培养基名称和接种日期。

5.2.2.2穿刺接种用接种针以无菌方式从待保藏的细菌斜面上挑取菌种，朝直立柱中央直刺至试管底部，然后又沿原线拉出。

中国医学微生物菌种保藏管理办法根据中国微生物菌种保藏委员会管理和组织条例的规定，为了加强医学微生物菌种(以下简称菌种)的保藏管理，特制定本管理办法。

第一条组织及任务在卫生部领导下，在中国微生物菌种保藏委员会指导下，设下列医学微生物菌种保藏管理中心:中国医学真菌菌种保藏管理中心:由中国医学科学院皮肤病防治研究所负责。

中国医学细菌菌种保藏管理中心:由卫生部药品生物制品检定所负责。

中国医学病毒菌种保藏管理中心:由中国预防医学中心病毒学研究所负责。

保藏管理中心的任务是:(一)负责本门类微生物菌种的选择、收集、鉴定、保藏、交换和供应;(二)开展菌种分类、鉴定及保藏管理的研究;(三)组织学术交流和经验交流;(四)办理国内外菌种交换;(五)编制保管的菌种目录。

保藏管理中心下设专业实验室，承担全国性的业务工作。

专业实验室对其直接领导机构和保藏管理中心负责，并定期向管理中心汇报工作情况。

其具体任务是:(一)负责本专业有关微生物菌种的选择、收集、鉴定、保藏、交换和供应;(二)承担本专业有关疑难菌种鉴定;(三)开展有关菌种分类、鉴定、保藏的研究，包括新技术、新方法的研究和应用;(四)办理对外交流和交换菌种。

各专业实验室科研技术人员的编制和经费由所属主管部门负责。

生物制品生产、检定用的菌种按"生物制品生产、检定用菌种、毒种管理规程"执行，统一由卫生部药品生物制品检定所办理。

第二条菌种的分类菌种的分类根据其危险性决定(包括实验室感染的可能性，感染后发病的可能性，症状轻重及愈后情况，有无致命危险及有效的防止实验室感染方法，用一般的微生物操作方法能否防止实验室感染、我国有否此种菌种及曾否引起流行、人群免疫力等情况)。

依其危险程度的大小，我国的菌种分为四类。

一类:实验室感染的机会多，感染后发病的可能性大，症状重并能危及生命，缺乏有效的预防方法，以及传染性强，对人群危害性大的烈性传染病，包括国内未发现或虽已发现，但无有效防治方法的烈性传染病菌种。

实验六微生物培养基的制备和灭菌实验项目性质：综合实验所属课程名称：《微生物学实验》实验计划学时：5学时一、实验目的1.了解并掌握培养基的配制、分装方法；2.掌握各种实验室灭菌方法及技术。

二、实验原理培养基是供微生物生长、繁殖、代谢的混合养料。

由于微生物具有不同的营养类型，对营养物质的要求也各不相同，加之实验和研究的目的不同，所以培养基的种类很多，使用的原料也各有差异，但从营养角度分析，培养基中一般含有微生物所必需的碳源、氮源、无机盐、生长素以及水分等。

另外，培养基还应具有适宜的pH值、一定的缓冲能力、一定的氧化还原电位及合适的渗透压。

琼脂是从石花菜等海藻中提取的胶体物质，是应用最广的凝固剂。

加琼脂制成的培养基在98～100℃下融化，于45℃以下凝固。

但多次反复融化，其凝固性降低。

任何一种培养基一经制成就应及时彻底灭菌，以备纯培养用。

一般培养基的灭菌采用高压蒸汽灭菌。

三、实验材料1、器皿及材料天平、称量纸、牛角匙、精密pH试纸、量筒、刻度搪瓷杯、试管、三角瓶、漏斗、分装架、移液管及移液管筒、培养皿及培养皿盒、玻璃棒、烧杯、试管架、铁丝筐、剪刀、酒精灯、棉花、线绳、牛皮纸或报纸、纱布、乳胶管、电炉、灭菌锅、干燥箱。

2、药品试剂蛋白胨、牛肉膏、NaCl、K2HPO4、琼脂、NaNO3、KCl、MgSO4、FeSO4、蔗糖、麦芽糖、木糖、葡萄糖、半乳糖、乳糖、土豆汁、豆芽计、磷酸铵、5%NaOH溶液、5%HCl溶液。

3、流程称药品→溶解→调pH值→融化琼脂→过滤分装→包扎标记→灭菌→摆斜面或倒平板。

四、实验步骤1 培养基的制备1.1 称量药品根据培养基配方依次准确称取各种药品，放入适当大小的烧杯中，琼脂不要加入。

蛋白胨极易吸潮，故称量时要迅速。

1.2 溶解用量筒取一定量(约占总量的1/2)蒸馏水倒入烧杯中，在放有石棉网的电炉上小火加热，并用玻棒搅拌，以防液体溢出。

待各种药品完全溶解后，停止加热，补足水分。

微生物菌种保藏方法介绍一、传代保存法有些微生物当遇到冷冻或干燥等处理时，会很快死亡，因此在这种情况下，只能求助于传代培养保存法。

传代培养就是要定期地进行菌种转接、培养后再保存，它是最基本的微生物保存法，例如酸奶等常用生产菌种的保存。

传代保存时，培养基的浓度不宜过高，营养成分不宜过于丰富，尤其是碳水化合物的浓度应在可能的范围内尽量降低。

培养温度通常以稍低于最适生长温度为好。

若为产酸菌种，则应在培养基中添加少量碳酸钙。

一般地，大多数菌种的保藏温度以5℃为好，像厌氧菌、霍乱弧菌及部分病原真菌等微生物菌种则可以使用37℃进行保存，而蕈类等大型食用菌的菌种则可以室温直接保存。

传代培养保存法虽然简便，但其缺点也很明显，缺点总结如下：①菌种管棉塞经常容易发霉;②菌株的遗传性状容易发生变异;③反复传代时，菌株的病原性、形成生理活性物质的能力以及形成孢子的能力等均有降低;④需要定期转种，工作量大;⑤杂菌的污染机会较多。

二、液体石蜡覆盖保存法该法较前一种方法保存菌种的时间更长，适用于霉菌、酵母菌、放线菌及需氧细菌等的保存。

此法可防止干燥，并通过限制氧的供给而达到削弱微生物代谢作用的目的。

其具有方法简便的优点，同时也适用于不宜冷冻干燥的微生物(如产孢能力低的丝状菌)的保存，而某些细菌如固氮菌、乳酸杆菌、明串珠菌、分枝杆菌、红螺菌及沙门氏菌等和一些真菌如卷霉菌、小克银汉霉、毛霉、根霉等不宜采用此法进行保存。

三、载体保存法即将微生物吸附在适当载体上进行干燥保存的方法。

常用的有方法包括以下几种，如：①土壤保存法：主要用于能形成孢子或孢囊的微生物菌种的保藏。

方法是在灭菌的土壤中加入菌液，立即在室温下进行干燥或使菌体繁殖后再干燥，然后冷藏或在室温下密封保存。

保存用的土壤原则上以肥沃的耕土为宜，土壤需风干、粉碎、过筛和灭菌。

使微生物在土壤中繁殖后进行干燥保存的方法是：取适量土壤(5克)，置于塞有棉塞的试管中，加水或加入充分稀释的液体培养基(以含水量为土壤最大持水量的60%为宜)，然后高压灭菌。

微生物菌种保存过程中常见的问题一、菌种保藏的认识1.刚买回来的阳性菌株是第0代吗？菌株买回来时上面都会写明第几代，常规来说都是第0代。

像购买的ATCC或CICC的冻干粉都是标记为0代的。

2.菌种保藏时为什么要进行分离纯化？分离纯化后才能获得单一菌株，单一菌株进行菌种保藏才有意义，防止菌种交叉污染和变异，这也是菌种保存的基本原则。

3.怎样纯化菌株？纯化就是从TSA上或别的非选择性平板上转接一次，这就相当于纯化了。

二、菌种可以保存的种类1.所有的菌都能保存吗？如果不是的话，什么样的菌可以保存？什么样的菌不可以保存？菌种保存的原理是预防或减缓DNA复制时自发突变导致菌种退化，因此要创造代谢不活泼的状态，而菌种保存时使菌种进入休眠态（孢子、芽孢)，并创造干燥、低温、缺氧、缺营养的环境，创造的环境越接近此状态，所保存的菌种的时间就越长，所以从原理上讲，所有菌种都可用这种方法保存，但需要注意的是，苛刻菌（如流感嗜血杆菌、脑膜炎萘瑟氏菌）等特殊细菌保存时，需-80℃或更低温度保存，才可以做到更长期的保存。

2.菌种保存管能保存霉菌及酵母菌吗？可以。

对于霉菌等真菌需培养7天进行保存，而酵母菌需培养三天将孢子洗脱下来进行保存，保存管中的小瓷珠可以作为介质来吸附孢子和菌丝，相当于砂土保存法中砂土作为载体起到的作用。

三、菌种的保存时间和保存条件1.怎样延长菌株的保存时间呢？大量的实验证明菌株在低温、干燥、缺氧、缺营养的条件下保存效果是最好的，越接近这种保存条件，菌株的保存时间越长。

2.能用菌种保存管永久保存菌株吗？温度越低，保藏效果越好。

从目前的试验数据及实际保存效果来看，-20℃可保存1~5年，-80℃或液氮中可保存5~10年，不同菌种及不同的保存温度保存时间会有所不同（例如：大肠、沙门等常规细菌-20℃目前可以保存到6年）。

但需要注意的是所保存的菌种需每年抽检进行生化特征的鉴定，确定菌株无变异。

3.为什么说，如果有条件的话，菌种保存管最好置于-80℃冰箱或液氮中？因为，贮存在-70℃以下低温中能减少冰晶形成，可极大降低冰晶形成对细菌的伤害，同时可为被保存的菌种创造更低的代谢环境，从而延长细菌保存的时间。

实验微生物菌种的分离纯化、培养、鉴定及保藏一、实验目的和要求1.了解微生物的分离纯化方法。

2.学习检测水中大肠菌群的方法。

3.学习微生物的保藏及鉴定方法。

4.熟悉革兰氏染二、实验原理多管发酵法多管发酵法包括初发酵试验、平板分离和复发酵试验三个部分。

发酵管内装有乳糖蛋白胨液体培养基，并倒置一德汉氏小套管。

乳糖能起选择作用，因为很多细菌不能发酵乳糖，而大肠菌群能发酵乳糖而产酸产气。

1.初发酵试验水样接种于发酵管内，37℃下培养，24小时内小套管中有气体形成，并且培养基混浊，颜色改变，说明水中存在大肠菌群，为阳性结果。

48小时后仍不产气的为阴性结果。

2.平板分离初发酵管24至48小时内产酸产气的均需在复红亚硫酸钠琼脂（远藤氏培养基）或伊红美蓝琼脂，平板上划线分离菌落。

3.复发酵试验以上大肠菌群阳性菌落，经涂片染色为革兰氏阴性无芽孢杆菌者，通过此试验再进一步证实。

原理与初发酵试验相同，经24小时培养产酸产气的，最后确定为大肠菌群阳性结果。

三、实验器材及试剂1.水样污水样本2、培养基及试剂：二甲苯、苯酚、琼脂粉、香柏油、乳糖胆盐液体培养基、伊红美蓝琼脂（EMB）、营养琼脂培养基、革兰氏一液、革兰氏二液、革兰氏三液、革兰氏四液。

3、器材及耗材:双目显微镜、恒温培养箱、恒温干燥箱、洁净工作台、紫外线灯管、紫外线灭菌手推车、接种环、试管、酒精灯、滤纸、擦镜纸、载玻片、打火机、棉花、滴瓶、长塑料篓、纱布、吸耳球、产气管、培养皿、移液管等四、实验方法及步骤1.第一天实验前的准备1）配制3支乳糖胆盐液体培养基，每支10mL，并加入产气管。

配置营养琼脂培养基，灌装进2支试管中，配置200mL伊红美兰培养基150mL,于121℃高温高压灭菌20分钟，后放进恒温干燥箱。

2）包扎5套培养皿，包扎6根1mL、1根10mL移液管和3支滴管。

于121℃高压灭菌锅中灭菌20分钟。

3）称取一定量的液体石蜡，约为锥形瓶的三分之一。

于121℃高温高压灭菌20分钟。