教你如何选择二抗
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荧光双染实验一抗和二抗选择的基本要求荧光双染实验一抗和二抗选择的基本要求,听起来好像很高级的样子,但是其实咱们普通人也能轻松理解。
今天,我就来给大家讲讲这个话题,希望能够帮助大家更好地进行荧光双染实验。
咱们要明确一点,荧光双染实验是用来检测细胞中特定蛋白的表达情况的。
那么,为什么我们需要选择一抗和二抗呢?因为一抗和二抗可以特异性地识别我们想要检测的蛋白,从而帮助我们找到这些蛋白在细胞中的定位。
那么,如何选择合适的一抗和二抗呢?这里有几个基本的要求:
1. 一抗和二抗要能够特异性地识别我们想要检测的蛋白。
这就意味着,它们不能识别其他无关的蛋白。
否则,我们的实验结果就会被干扰。
2. 一抗和二抗的亲和力要足够强。
这是因为,如果它们的亲和力不够强,它们就不能很好地与我们想要检测的蛋白结合。
这样一来,我们的实验结果也会受到影响。
3. 一抗和二抗的价格要合理。
毕竟,我们做实验是为了得到有用的结果,而不是为了花很多钱买昂贵的试剂盒。
所以,我们在选择一抗和二抗的时候,也要考虑到它们的价格因素。
4. 一抗和二抗要容易保存和使用。
这是因为,有些试剂盒可能需要特殊的条件才能保存稳定,或者需要特殊的操作步骤才能使用。
如果一抗和二抗不能方便地保存和使用,那么我们在实验过程中也会遇到很多麻烦。
选择合适的一抗和二抗对于荧光双染实验来说是非常重要的。
希望大家在进行实验的时候,能够根据这些基本要求来选择合适的试剂盒,从而得到准确、可靠的实验结果。
荧光双染实验一抗和二抗选择的基本要求荧光双染实验,这名字听起来就很炫酷,对吧?其实它就是一个让我们能同时看到两种不同标记物的实验。
没错,就是让我们在显微镜下像变魔术一样,看到细胞中的不同成分。
为了能让这个实验顺利进行,我们得好好挑选一抗和二抗,别小看这两个“小家伙”,它们可是实验成功的关键哦。
接下来,我们就来聊聊挑选一抗和二抗的那些事儿。
1. 选择一抗的基本要求首先,一抗是我们的“主角”,它负责直接和目标抗原结合。
为了让实验更靠谱,我们在挑选一抗的时候有几个基本要求。
首先,得确保一抗的特异性。
简单来说,就是一抗要能够准确地识别目标抗原,不会跟其他东西搭上关系。
你可以把它想象成找一个能只看中你家猫的侦探,千万别让它误认成了邻居家的狗狗。
此外,一抗的亲和力也很重要。
亲和力高的话,一抗就能牢牢地抓住目标抗原,不容易掉链子。
就像是找一个有“强烈吸引力”的好朋友一样,这样才能在关键时刻依靠得住。
1.1 一抗的来源选择一抗时,来源也要考虑清楚。
市面上的一抗分为很多种,有的是从小鼠身上提取的,有的是从兔子身上提取的,甚至还有从山羊身上提取的。
每种来源的一抗都有自己的优点和缺点。
例如,小鼠单克隆抗体常常具有高度的特异性,但可能在某些实验条件下效果不如其他来源的抗体好。
像兔子或者山羊的抗体则可能在灵敏度上表现得更好。
了解这些,才能找到最适合你实验的一抗。
1.2 一抗的纯度一抗的纯度也不能忽视。
想象一下,如果你的试剂里混杂了很多其他东西,就像是在派对上有太多不认识的人一样,肯定会让实验结果变得扑朔迷离。
因此,选择纯度高的一抗非常重要,它能让你减少实验中的干扰,提高结果的准确性。
选择纯度高的一抗,就像在举办一个小型的、只有好友参与的派对,所有人都知道自己干嘛的,大家都玩得开心。
2. 选择二抗的基本要求说完了一抗,接下来咱们聊聊二抗。
二抗是我们的“帮手”,它负责和一抗结合,并且带上荧光标记。
二抗的选择也有讲究,首先是它的特异性。
荧光双染实验一抗和二抗选择的基本要求荧光双染实验一抗和二抗选择的基本要求,听起来好像很专业的样子,但是其实很简单,就是让我们的实验数据更加清晰明了。
那么,我们该如何选择合适的一抗和二抗呢?接下来,就让我来给大家普及一下吧!我们要明确什么是一抗和二抗。
一抗,就是第一抗体,也就是我们要检测的目标物质;二抗,就是第二抗体,它可以与一抗结合,形成一种复合物,从而使我们能够看到目标物质的存在。
那么,如何选择合适的一抗和二抗呢?1.1 选择一抗选择一抗的时候,我们要考虑到以下几个方面:(1)特异性:一抗要能够准确地识别目标物质,不能误识别其他物质。
这就好比是我们要找一个人,但是他长得像很多人,我们不能因为他长得像别人就把他当成那个人。
(2)灵敏度:一抗要有足够的敏感性,能够在低浓度下检测到目标物质。
这就好比是我们要在人海中找到一个特定的人,但是他的出现频率很低,我们不能因为他出现的次数少就忽略了他。
(3)稳定性:一抗要具有一定的稳定性,不会因为外界因素的影响而失去活性。
这就好比是我们要找一个人,但是他总是在关键时刻消失不见。
选择合适的一抗就是要找到一个既能准确识别目标物质,又有足够敏感性和稳定性的人。
1.2 选择二抗选择二抗的时候,我们要考虑到以下几个方面:(1)特异性:二抗要能够准确地识别一抗,不能误识别其他一抗或者背景分子。
这就好比是我们要找一个人,但是他长得像很多人,我们不能因为他长得像某个特定的人就把他当成那个人。
(2)灵敏度:二抗要有足够的敏感性,能够在低浓度下检测到与一抗结合的复合物。
这就好比是我们要在人海中找到一个特定的人,但是他出现的频率很低,我们不能因为他出现的次数少就忽略了他。
(3)稳定性:二抗要具有一定的稳定性,不会因为外界因素的影响而失去活性。
这就好比是我们要找一个人,但是他总是在关键时刻消失不见。
选择合适的二抗就是要找到一个既能准确识别一抗,又有足够敏感性和稳定性的人。
2.1 一抗和二抗的选择时机在进行荧光双染实验时,我们需要根据实际情况来选择合适的一抗和二抗。
如何选择人源血清学检测二抗?血清学检测是许多健康问题诊断过程中的关键检测方法,包括交叉匹配,疾病诊断,监测等。
这些检测在临床决策中起着至关重要的作用,免疫分析是目前可用的强大,灵敏的血清学检测方法之一,它基于抗原抗体之间的高度特异性结合,即使在低浓度下也能进行定性和定量检测。
有多种免疫测定方法,以下是其中常见两种检测方法示意图,分别是夹心法(图1A)和直接法(图1B),当选择用于夹心法检测的抗人二抗时(图1A),需要考虑一抗的种属,并使用与该物种有最小交叉反应的二抗。
图1:测定方式:A.夹心法,B.直接法免疫分析在多种疾病诊断起重要作用各类免疫测定技术各有优缺点,例如,快速测定法(如胶体金侧向流动法)可在数min 内提供定性结果,可进行即时检测,而ELISA可能需要花费数小时才能完成,但可提供定量数据。
而当前严重急性呼吸系统综合症冠状病毒2(SARS-CoV-2)大流行更加凸显了侧向流动分析的优势,由于该疾病具有快速传播和较高的死亡率等特征,美国FDA已采取相关措施,允许各州未经FDA批准就可开展新的SARS-CoV-2检测。
该修订允许使用快速检测试剂盒,该试剂盒定性检测患者针对SARS-CoV-2产生的IgG和IgM抗体,从而显著加大了SARS-CoV-2的检测能力,尽可能地减少病毒的传播。
尽管侧向流动检测具有明显的优势,但这种分析方法无法提供定量的数据。
表1.几种类型的免疫测定法的优缺点,检测过程,检测的Ig类型抗人二抗是各类免疫分析中的关键试剂尽管免疫测定的功能和目的有所不同,但为了在临床上获得准确,可靠数据,开发血清学试剂盒时,高质量试剂至关重要。
抗人二抗的质量是开发免疫测定试剂盒时的关键考虑因素,二抗需要谨慎选择,因为它们会结合一种一抗的多个表位上,从而增强了信号的灵敏度和选择性。
表2总结了在进行免疫测定选择合适的二抗时需要考虑的多个方面。
表2.在免疫分析中选择合适的二抗时的考虑因素以及我们抗体的特征抗人二抗产品推荐:亲和纯化山羊抗人IgG(H+L)二抗,货号:109-005-088;HRP标记亲和纯化山羊抗人IgG二抗,货号:109-035-008;亲和纯化山羊抗人IgG+IgM二抗,货号:109-065-127;亲和纯化山羊抗人IgM二抗,货号:109-005-129Note:Bov:牛;Hrs:马;Ms:小鼠;Rb:兔子;Sr Prot:血清蛋白。
WB检测抗体如何选择WB检测之二抗二抗选择二抗是用一抗免疫动物制备的抗一抗的抗体,选择范围较窄,基本是商品化的,在不考虑二抗修饰类型的前提下,二抗的选择需要遵循以下原则:二抗来源种属、一抗来源种属和抗原来源种属互不相同。
例如如果研究对象是人的蛋白X,选择了鼠抗X一抗,则可选择兔抗鼠二抗或者羊抗鼠二抗。
二抗选择要考虑的问题有:①对单抗类一抗,二抗需与一抗的类别或亚类相匹配(多抗类一抗主要是IgG类免疫球蛋白故相应二抗就是抗IgG F(ab’)2二抗,避免各种Ig保守结构域导致的交叉反应。
然而各种Ig仍具有保守的轻链结构域,因此还是有一定程度的交叉反应。
WB检测之内参抗体Western Blot检测方法不仅能检测靶蛋白存在与否,还能比较不同条件下或者不同组织中靶蛋白的相对表达量,可作为蛋白表达水平最直接的证据。
在WB实验中有众多不确定因素影响靶蛋白表达水平的测定,如方法学本身性质、操作误差等。
为准确衡量靶蛋白表达水平,需要精确一致的上样量,使用内参的意义即是保证上样量的一致。
内参即内部参照(Internal Control),对哺乳动物细胞一般指管家基因的表达蛋白(Housekeeping Proteins)。
此类蛋白在各组织和细胞中的表达相对恒定,可作为检测蛋白表达水平变化的参照物。
当内参条带亮度基本一致时,基本可以确定上样量是一致的,通常采用比较靶蛋白和内参蛋白条带亮度比值来进行相对定量。
WB实验中涉及到的蛋白-抗体结合是一个复杂的活性生物大分子间的相互作用,众多因素都会影响实验的结果。
例如时间、温度、浓度、离子强度等,在实验设计时就需要有严谨的对照方案,通过对照就容易判断问题所在,严谨的WB实验中需要设立蛋白分子量标准、空白载体对照、未诱导对照、已知量标准物正对照和内参。
内参使用方法1.标记内参:酶标的内参抗体可避免二抗结合总蛋白中某些免疫球蛋白产生的杂带,使用时只需在二抗孵育时加入酶标内参抗体,按照正常操作即可。
免疫荧光一抗二抗的选择及其技巧据一抗种属及类型-如何选择二抗?如何选择二抗——根据一抗种属及类型选择合适的二抗二抗广义上是指专门和一抗进行特异性反应和结合的抗体,在免疫学反应中,经常需要针对试验选择不同的二抗,艾美捷能为您的科研工作提供最适合和最全面的二抗产品。
检测任何目的靶蛋白都有不止一种抗体可供选择,同时在后继试验中也会有不同的检测方案,因此在选择二抗的时候要综合考虑一抗的类型及后继检测方案的要求,一般来说,选择合适的二抗需要从下面几个方面考虑:【一抗的种属来源】二抗应选用与使用的一抗相同的物种来源,例如:如果你的一抗是小鼠源的单克隆抗体,二抗则选抗小鼠的二抗(山羊抗小鼠或者兔抗小鼠等均可);如果一抗是从兔血清里制备的兔源多克隆抗体,则相应的二抗需要选择抗兔的二抗。
即根据一抗的物种来源选择相应的抗该物种的二抗。
艾美捷能为您提供最全的抗不同种属的原装进口二抗,包括抗小鼠、大鼠、兔、山羊、绵羊、人、豚鼠、猪、马、牛、鸡、鸭等二抗。
【一抗的类别亚型】二抗需与一抗的类别或亚类相匹配。
这通常是针对单克隆抗体而言。
多克隆抗体主要是IgG类免疫球蛋白,因此相应的二抗就是抗IgG抗体。
其中单克隆抗体的类别及亚类通常会在产品说明书中都会有描述,如果你的一抗是小鼠IgM,那么相应的二抗就应当是抗小鼠IgM。
如果单克隆一抗是小鼠IgG的某一亚类(IgG1,IgG2a,IgG2b,IgG3),那么几乎所有的抗小鼠IgG都可以与之结合,或者你也可以选择专门针对这一亚类的二抗,例如,如果你的一抗是小鼠IgG1,那么你可以选择抗IgG1的二抗,此种抗体在双标记实验中尤其适合。
在不清楚一抗为何种类/亚类的情况下,可以选用抗相应物种IgG。
艾美捷能为您提供通用的IgG(H+L)二抗,或者特异性只结合IgM的Anti IgM (mu) Antibody、IgA的Anti IgA (alpha-Antibody、IgE的Anti IgE (epsilon) Antibody等。
如何正确选择二抗二抗选择指南2012-03-28 20:18 来源:丁香园点击次数:691 关键词:二抗单抗一抗片段基因如何选择正确的二抗?以下指南将帮助您选择最适合该应用的二抗。
常见问题1.一抗的宿主物种是什么?2.需要了解哪些有关一抗同型的内容?3.需要酶学或荧光检测吗?4.是否需要预吸附的二抗?5.是否需要亲和纯化的抗体或IgG 片段?6.有必要使用F(ab) 或F(ab')2 片段抗体吗?7.是否需要抗IgG 重链和轻链、抗轻链或抗F(ab')2二抗?1. 一抗的宿主物种是什么?二抗指向一抗的物种。
如果使用来源于兔的一抗,则需要来源于除兔以外的其它物种的抗兔二抗。
例如山羊多克隆抗兔IgG - H&L (HRP) 二抗(ab6721) 可以检测兔多克隆抗Ki67 一抗(ab15580)。
2. 需要了解哪些有关一抗同型的内容?二抗必须指向一抗同型。
多克隆一抗通常来源于兔、山羊、绵羊或驴,并且是IgG 同型。
二抗通常为抗IgG 重链和轻链的抗体。
单克隆一抗通常来源于小鼠、兔和大鼠。
例如,如果单克隆一抗为小鼠IgG1,则需要抗小鼠IgG 或特异性较低的F(ab) 片段抗小鼠IgG。
人免疫球蛋白类、亚类、型和亚型:•类或同型:IgG (γ heavy chains), IgM (μ), IgA (α), IgE (ε), IgD (δ)•亚类:IgG1 (γ1 heavy chains), IgG2 (γ2), IgG3 (γ3), IgG4 (γ4); IgA1 (α1), IgA2 (α2)•型:κ light chain, λ light chain•亚型:λ1, λ2, λ3, λ4其它类型的反应:•多价抗体与所有免疫球蛋白类反应•抗Fc 或重链(α, δ, ε, γ, and μ) 抗体仅与重链反应•抗F(ab) 或完整分子抗体与重链和轻链反应,而与免疫球蛋白类无关•由于所有免疫球蛋白类均使用相同的κ 和λ 轻链,因此抗轻链(κ 和λ)抗体与所有免疫球蛋白类反应3. 需要酶学或荧光检测吗?偶联类型是依赖于应用的。
如何选择二抗羊抗兔:指把兔体内的抗原注射到羊的体内,而在羊的体内产生抗兔的抗体,即羊抗兔抗体,这个抗体来由羊产生的,是羊源的。
一抗如果是鼠抗人的抗体,二抗应该是另一种动物抗鼠的抗体,而且一抗和二抗的动物种属原则上不应该相同。
一般来说,一抗多用兔抗和鼠抗,而二抗多用羊抗。
二抗一般选择被碱性磷酸酶标记过的。
单克隆抗体是指针对于抗原标志物上某一种抗原决定簇产生的单一种类的抗体,一般通过杂交瘤细胞技术制得;多克隆抗体是指针对抗原上多个抗原决定簇产生的抗体,一般将抗原免疫动物血清直接制得。
对于一抗来说,现用单克隆抗体较多。
相对于一抗的特异性,二抗要求广谱抗体,最好能够一对多。
现在购买的二抗多是二抗加亲和素生物素的复合物,与传统二抗有所不同。
In most cases, there are actually several antibody-conjugates that would work well in a particular application and finding the best one requires comparing them side-by-side.The following information is provided to help you decide which secondary antibody may be best for your particular application:1.In what animal was the primary antibody developed?For example if your primary antibody is raised in a mouse, you will need ananti-mouse secondary antibody. If it is raised in a rabbit, for example A2066(rabbit anti-actin), you will need an anti-rabbit secondary antibody.2.What is the class and/or subclass of the primary antibody.This is primarily important in the case of monoclonal antibodies. Polyclonalantibodies (generally developed in rabbit, goat, sheep or donkey) are typicallyIgG class immunoglobulins. For this reason, the secondary antibodies for thesespecies will mainly be anti-IgG. Monoclonal antibodies (MAbs) are mostcommonly developed in mice and occasionally in rats. The class and subclass ofour monoclonals is indicated in the product listing. For example, if the primaryMab is mouse IgM, one would want a secondary antibody that reacts with mouseIgM (anti-Mouse IgM or anti-Mouse IgG (Fab)).If the primary monoclonal is one of the mouse IgG subclasses (IgG1, IgG2a,IgG2b, IgG3), almost any of our anti-mouse IgG secondary antibodies shouldbind to it. However, we offer different specificities to provide the end-user withoptions, especially for specific double labeling experiments. If the class and/orsubclass of the primary antibody is not known, the anti-Mouse IgG (Fab)secondary antibodies may be used since they recognize most mouseimmunoglobulin subtypes.You may experience difficulty when choosing a the best secondary anti-mouseor anti-human IgG. This is because there are many specificities to IgG. The important thing to remember is that light chains (kappa and lambda) of immunoglobulins are shared among all the immunoglobulin classes. That is, IgG, IgM, IgA, IgD and IgE all have either kappa or lambda light chains. The heavy chain (lambda for IgG, µ for IgM and alpha for IgA), however, is class specific. The following summarizes the specificities we offer:1.Polyvalent: react with all classes2.Fc and heavy-chain specific:react with heavy chains only,therefore, they are class specific (i.e. gamma chain specific reactsonly with IgG; µ chain specific reacts only with IgM, etc.)3.Fab and whole molecule (wm) specific:react with heavy andlight chains. Due to the light chain reactivity, they can react with allclasses.4.Light chain (kappa, lambda) specific:react with all classes,since all classes use the same kappa or lambda light chains.1.What form of antibody should be used?Most people prefer affinity isolated antibodies. These products are the most purified, and therefore, give the lowest amount of non-specific binding. However, in certain cases, IgG fractions may be considered. IgG fractions may have the benefit of containing very high affinity antibodies. Affinity isolation may remove some very high affinity antibodies because they bind so tightly to the affinity matrix that they are not eluted. Therefore, IgG fractions may be useful in situations where very high affinity is required, most commonly when the antigen of interest is rare or present in low abundance.2.What kind of label?The label is very application dependent. For immunoblotting and ELISA, enzyme-labeled secondary antibodies are the most popular. Peroxidase is economical, rapid and a more stable enzyme, in general, than alkaline phosphatase. Also, It has become very popular for use in chemiluminescent detection systems. Alkaline phosphatase on the other hand is considered more sensitive than peroxidase particularly when colorimetric detection is used. For cell or tissue staining, alkaline phosphatase, peroxidase or fluorescent secondary antibodies may be used for cytochemistry or histochemistry.Secondary antibodies labeled with a fluorochrome (FITC, phycoerythrin, and Quantum Red) may be used for flow cytometry.To generate increased amplification, a two-step biotin/avidin system may be used. Biotin binds with very high affinity to avidin resulting in an essentially irreversible interaction. A biotinylated secondary antibody is applied first, then avidin, ExtrAvidin. or streptavidin conjugated to an enzyme or fluorochrome binds to multiple sites on the biotinylated secondary antibody, thus amplifying the signal and resulting in greater sensitivity than that achieved with an antibody-enzyme or antibody-fluorochrome conjugate alone.3.Is there an appropriate adsorbed secondary antibody available?If working with human tissues, cells or proteins, choose a secondary antibody that has been adsorbed with human serum or human IgG. If working with bovine tissues, cells or proteins, choose a product that has been adsorbed with bovine serum or bovine IgG, etc. Using these products will reduce non-specific background4.Is a F(ab )2 fragment product necessary?If working with tissues or cells that have Fc receptors (thymus, spleen, blood, leukocytes, B cells etc.), choose an F(ab )2 fragment when possible to eliminate non-specific binding through Fc receptors present on cells.Alternatively, Fc receptors can be blocked. Perform an absorption step, using purified IgG from the host species of the your secondary antibody. In that case an F(ab)2 secondary antibody may not be necessary.5.If all else is equal, decide based on price/titer and availability.。
二抗广义上是指专门和一抗进行特异性反应和结合的抗体,在免疫学反应中,经常需要针对试验选择不同的二抗,艾美捷能为您的科研工作提供最适合和最全面的二抗产品。
检测任何目的靶蛋白都有不止一种抗体可供选择,同时在后继试验中也会有不同的检测方案,因此在选择二抗的时候要综合考虑一抗的类型及后继检测方案的要求,一般来说,选择合适的二抗需要从下面几个方面考虑:【一抗的种属来源】二抗应选用与使用的一抗相同的物种来源,例如:如果你的一抗是小鼠源的单克隆抗体,二抗则选抗小鼠的二抗(山羊抗小鼠或者兔抗小鼠等均可);如果一抗是从兔血清里制备的兔源多克隆抗体,则相应的二抗需要选择抗兔的二抗。
即根据一抗的物种来源选择相应的抗该物种的二抗。
艾美捷能为您提供最全的抗不同种属的原装进口二抗,包括抗小鼠、大鼠、兔、山羊、绵羊、人、豚鼠、猪、马、牛、鸡、鸭等二抗。
【一抗的类别亚型】二抗需与一抗的类别或亚类相匹配。
这通常是针对单克隆抗体而言。
多克隆抗体主要是IgG类免疫球蛋白,因此相应的二抗就是抗IgG抗体。
其中单克隆抗体的类别及亚类通常会在产品说明书中都会有描述,如果你的一抗是小鼠IgM,那么相应的二抗就应当是抗小鼠IgM。
如果单克隆一抗是小鼠IgG的某一亚类(IgG1,IgG2a,IgG2b,IgG3),那么几乎所有的抗小鼠IgG都可以与之结合,或者你也可以选择专门针对这一亚类的二抗,例如,如果你的一抗是小鼠IgG1,那么你可以选择抗IgG1的二抗,此种抗体在双标记实验中尤其适合。
在不清楚一抗为何种类/亚类的情况下,可以选用抗相应物种IgG。
艾美捷能为您提供通用的IgG(H+L)二抗,或者特异性只结合IgM的Anti IgM (mu)Antibody、IgA的Anti IgA (alpha-Antibody、IgE的Anti IgE (epsilon)Antibody等。
【二抗的种属来源】一般来说,不同的种属来源与二抗的质量没有必然的联系,来源于山羊的二抗与来源于驴的二抗在一般的实验里没有太多的差别。
荧光双染实验一抗和二抗选择的基本要求荧光双染实验一抗和二抗选择的基本要求,听起来好像很高大上,但其实也就是让我们的实验结果更清晰、更有说服力。
那么,我们该如何选择合适的一抗和二抗呢?接下来,就让我用简单易懂的语言给大家科普一下吧!我们要明确什么是一抗和二抗。
在荧光双染实验中,一抗就是用来检测我们想要研究的蛋白质的第一种抗体,而二抗则是用来检测我们想要研究的蛋白质的第二种抗体。
它们就像是我们的“眼睛”,帮助我们看清楚实验结果中的细节。
那么,如何选择合适的一抗和二抗呢?这里有两个基本要求:一是尽量选择特异性高、灵敏度高的抗体;二是尽量选择与我们想要研究的蛋白质结合良好的抗体。
下面,我分别给大家详细介绍一下这两个要求。
1. 尽量选择特异性高、灵敏度高的抗体特异性是指一抗只能识别我们想要研究的蛋白质,而不会误识别其他蛋白质。
灵敏度是指一抗能够检测到我们想要研究的蛋白质的能力。
这两个要求都很重要,因为如果一抗的特异性和灵敏度不高,那么我们的实验结果可能会被其他蛋白质的影响所干扰,从而导致结果不准确。
那么,如何判断一抗的特异性和灵敏度呢?这里给大家一个小技巧:可以先用一些已知特异性和灵敏度较高的一抗进行初步筛选,然后再根据我们的实验需求进行优化。
这样,我们就可以尽量选择到特异性高、灵敏度高的一抗了。
2. 尽量选择与我们想要研究的蛋白质结合良好的抗体结合良好意味着一抗能够与我们想要研究的蛋白质紧密地结合在一起,从而不会被其他蛋白质的影响所干扰。
这样,我们就可以更准确地检测到我们想要研究的蛋白质了。
那么,如何判断一抗与我们想要研究的蛋白质结合得好不好呢?这里也给大家一个小技巧:可以先用一些已知与目标蛋白结合良好的一抗进行初步筛选,然后再根据我们的实验需求进行优化。
这样,我们就可以尽量选择到与我们想要研究的蛋白质结合良好的一抗了。
当然啦,选择合适的一抗和二抗并不是一件容易的事情,需要我们不断地尝试和优化。
但是,只要我们遵循上述的基本要求,相信我们一定能够找到最适合我们的一抗和二抗的!荧光双染实验一抗和二抗的选择是非常重要的,它关系到我们的实验结果是否准确。
*教你如何正确选择二抗
通常情况下,某一特定的实验中可能同时有几种二抗可供选择,如何能选择到最适合该实验的二抗,需要综合以下几个方面进行考虑:
●一抗的物种来源
一抗是在什么物种来源的,相应的二抗也要是抗该物种的抗体。
例如,如果一抗是在小鼠体内制备的,那么你就应当选择抗小鼠的二抗,如果一抗是在兔体内制备的,那么二抗就应当是抗兔的抗体。
至于二抗本身是在什么动物中制备的对二抗的质量并无明显的影响。
●一抗是属于哪个类或亚类
二抗需与一抗的类别或亚类相匹配。
这通常是针对单克隆抗体而言。
多克隆抗体主要是IgG类免疫球蛋白,因此相应的二抗就是抗IgG抗体.
单克隆抗体的类别及亚类通常会在产品列表中列出,如果你的一抗是小鼠IgM,那么相应的二抗就应当是抗小鼠IgM,或是抗小鼠IgG抗体。
如果单克隆一抗是小鼠IgG的某一亚类(IgG1,IgG2a,IgG2b,IgG3),那么几乎所有的抗小鼠IgG都可以与之结合,或者你也可以选择专门针对这一亚类的二抗,例如,如果你的一抗是小鼠IgG1,那么你可以选择抗IgG1的二抗,此种抗体在双标记实验中尤其适合。
如果你不知道一抗是哪一类别或亚类,那么抗小鼠IgG是一个不错的选择,因为此种抗体可以识别大多数类型的IgG免疫球蛋白。
二抗的特异性
下面总结了几种具有不同特异性的二抗:针对整个抗体分子(H+L)具有特异性:如抗IgG(H+L),此类抗体既可以与抗体的重链结合也可以与轻链结合,即与抗体分子的Fc,F(ab’)2/Fab部分(见图5)均可反应,抗IgG(H+L)也可以与其他免疫球蛋白家族反应(如IgM和IgA),因为所有的免疫球蛋白都具有相同的轻链(kappa链或lambda 链)。
针对Fab片段具有特异性:这类抗体与重链轻链均可以结合,由于它们可以与轻链反应,它们同时也已和具有相同轻链的其他种类的免疫球蛋白反应。
这对Fc片段或重链具有特异性:这类抗体和重链的Fc部分反应,一次它们是类别特异性的(即gamma链特异性抗体只与IgG反应,mu链特异性抗体只识别IgM,依此类推)。
轻链(kappa,labmda)特异性:与所有类别的抗体反应,因为所有类别的抗体均具有相同的lambda链或kappa链。
经过吸附处理的二抗(cross-absorbed):不同来源的免疫球蛋白含有相似的结构,抗一个物种的抗体可能与其他物种发生交叉反应,一次有些二抗经过了动物或人类IgG吸附处理,以减少非特异性背景。
例如,如果是小
鼠的组织或细胞,那么选择经小鼠血清或IgG吸附处理过的二抗可以减少非特异性结合。
但是此种抗体识别表位的数量被大大减少。
●二抗的形式
选择哪种形式的二抗,是整个IgG分子,F(ab’)2片段,还是Fab片段?
整个IgG分子:此种抗体适用于多数情况。
F(ab’)2片段:该种抗体是由两个靠二硫键连接的用于结合抗原的Fab片段组成,这些抗体用在特定的情况中,如需要避免抗体与具有Fc受体的细胞结合的情况。
Fab片段:它们只有一个结合位点,一般用来封闭内源性免疫球蛋白。
●二抗的偶联标记
一般来讲,耦联到二抗上的探针主要有酶(辣根过氧化酶HRP和碱性磷酸酶AP或其衍生物APAAP,PAP),荧光基团(FITC, RRX, TR, PE)和生物素。
选用哪种探针的二抗主要取决于具体的实验。
对于western blot和ELISA,最常用的二抗是酶标二抗,而细胞或组织标记实验(细胞免疫化学,组织免疫化学,流式细胞术)中通常使用荧光基团标记的二抗,免疫组化中也可以使用辣根过氧化酶或碱性磷酸酶标记的二抗。
如果想要更大程度的放大检测信号,可以使用biotin/avidin检测系统。
下面简单介绍几种二抗探针的优缺点及其适用的实验:
酶:主要有两种不同的酶耦联物,HRP和AP。
比较而言,前者更经济、快速、稳定,而后者较前者更为灵敏,通常情况下,HRP广泛应用于免疫组化,western blot和ELISA中,而碱性磷酸酶(AP)更适合于固相的免疫检测实验,如ELISA和western blot.
荧光基团:
1.FITC:FITC是广泛使用的荧光基团,但其最大的缺点是淬灭快,使用抗淬灭剂可以减轻。
2.AMCA:常用在多标记实验中,如免疫荧光、流式细胞术。
其缺点是,淬灭快,且由于肉眼不能很好的检测其所激发的蓝色荧光,因而AMCA耦联的二抗更适用于检测大量存在的抗原。
3.花青染料(Cy2,Cy3,Cy5):Cy2比FITC更稳定,且在表面荧光显微镜下,Cy2的荧光FITC更强。
Cy3和Cy5比大多数荧光基团更亮,更稳定,背景更弱。
二者常在共聚焦显微实验中作多标记。
但Cy5的缺点是不能用表面荧光显微镜观察,因此通常用具有远红外检测器的共聚焦显微镜观察。
4.TRITC,RRX,TR:TRITC经常和FITC一起用于双标记实验中,也可以使用RRX或TR,但TR会产生较高的背景。
在使用装有氪氢灯的激光共聚焦扫描显微镜作三标记实验时,RRX尤其有用,可以和Cy2(或FITC)及Cy5一起使用,因为RRX的发射波长在Cy2和Cy5中间,且和这两者的重叠很少。
5.PE:常和FITC一起用于流式细胞术双标记实验。
6.生物素:生物素(biotin)可以和抗生素蛋白(avidin)发生不可逆反应而紧密结合在一起。
首先加入生物素标记的二抗,在加入耦联有酶或荧光集团的avidin、ExtrAvidin或streptavidin,后者能够结合于二抗表面的多个位点上,从而极大的放大检测信号。
*本文内容来自网络
Bethyl优质二抗举例:
Rockland 优质二抗举例:
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