WB检测抗体如何选择(下)

W e s t e r n b l o t一抗和二抗的选择Westernblot一抗和二抗的选择抗体分类：根据重链恒定区的血清学类型，可将抗体分为IgM，IgG，IgA，IgD，IgE 五类，它们的重链分别为mu, gamma, alpha, delta, epsilon链。

在上述每一类别中，按重链构造上的变异又可分为几个亚类，例如人的IgG可分为IgG1，IgG2，IgG3，IgG4四个亚类。

轻链分为两种类型，kappa链和lambda链，但每种抗体中只存在一种类型的轻链。

二抗：二抗是在其它宿主体内制备的能与一抗或一抗片段结合的抗体，上面通常连有酶或荧光素等标签。

由于二抗所具备的优点使得其在免疫学实验中得以应用广泛，如western blot（通过与特异性抗体结合来鉴定蛋白质），ELISA（以耦联有酶的抗体或抗原为标记来检测特异性的蛋白质，尤其是相应的抗原或抗体），免疫组织化学（检测组织中的特异性抗原），免疫细胞化学（通过免疫学方法检测细胞的抗原组成），流式细胞术（通过检测激光所激发荧光来鉴定分离不同类型的细胞）及免疫沉淀（通过抗原与抗体的特异性结合作用来分离相应抗原）。

二抗针对某一特定物种（如小鼠）的所有抗体均具有特异性，因而使用标记的二抗可以免去对每一个一抗进行标记，大大节省了时间和费用；此外，一个一抗分子可以同时结合几个二抗分子，从而使信号大大增强，提高了实验灵敏度。

二，如何选择二抗——根据一抗种属及类型选择合适的二抗广义上是指专门和进行特异性反应和结合的抗体，在免疫学反应中，经常需要针对试验选择不同的二抗，**捷能为您的科研工作提供最适合和最全面的二抗产品。

检测任何目的靶蛋白都有不止一种抗体可供选择，同时在后继试验中也会有不同的检测方案，因此在选择二抗的时候要综合考虑一抗的类型及后继检测方案的要求，一般来说，选择合适的二抗需要从下面几个方面考虑：【一抗的种属来源】二抗应选用与使用的一抗相同的物种来源，例如：如果你的一抗是小鼠源的单克隆抗体，二抗则选抗小鼠的二抗（山羊抗小鼠或者兔抗小鼠等均可）；如果一抗是从兔血清里制备的兔源多克隆抗体，则相应的二抗需要选择抗兔的二抗。

免疫双标，抗体如何选择？注意几点：1）最好是不同种属来源的一抗，而且最好都是单抗。

这样就要选择相应不同种属来源的二抗，避免同种属来源的二抗与两个一抗的交叉反应。

选择单抗也是避免交叉反应和假阳性。

好的抗体真的还是很重要。

2）如果条件所限，只找到一种抗体，而且说明书没有明确说可以做免疫荧光怎么办？这个可能不是说就一定不能做，也可能是厂家没做这方面的实验，可以大胆的try3)为何免疫双标一般是免疫荧光为主？一方面是不同抗体标记不同的荧光，图片漂亮；另一方面也是为了避免SP和ABC法中还要封闭内源性过氧化物酶等可能会引起假阳性反应。

4）是否可以用不同荧光染料直接标记的不同一抗来做？可以做，过程还可省一步。

但是注意没有二抗的放大效应，结果可能有时很难出来。

5）免疫双标荧光的图像如何整合？可以用扫描共聚焦，或者用园子的软件整合。

注意及时照相，荧光过段时间会淬灭。

免疫双标中，最为关键的是一抗、二抗的选择以及恰当的搭配：1. 免疫双标做得好的基本原则是：一抗种属不同，二抗匹配对应的一抗，二抗不同颜色标记，二抗之间无交叉反应2. 抗体的选择一般根据本实验相关的一些关键词（抗体名称、编号、目标动物种属、实验方法...）来检索一些档次较高的文献，看看图片较好的文献中研究者们用的哪个公司的什么编号抗体，不见得知名公司的抗体就一定做得出来，实践检验过了的才是金标准。

3. 封闭液的选择封闭液作用就是尽量封闭掉能与二抗结合产生非特异性染色的抗原。

所以，封闭液尽量选择与二抗种属同源的血清封闭液。

比如，二抗是“驴抗羊FITC、驴抗兔CY3”，那么最佳封闭液就是驴血清封闭液。

免疫双标一抗的选择主要有两种形式:第一：一抗种属来源相同：即一抗A和B都是小鼠抗大鼠，或者都是兔抗大鼠；对于这种情况，采用的双标方法是顺序法，即把免疫组化的过程走两遍，一抗不能同时加。

第二：一抗种属来源不同：比如一抗A是小鼠抗大鼠，一抗B是兔抗大鼠，即A的种属来源是小鼠，B的种属来源是兔；针对的组织是大鼠。

WB检测抗体如何选择WB检测之二抗二抗选择二抗是用一抗免疫动物制备的抗一抗的抗体，选择范围较窄，基本是商品化的，在不考虑二抗修饰类型的前提下，二抗的选择需要遵循以下原则：二抗来源种属、一抗来源种属和抗原来源种属互不相同。

例如如果研究对象是人的蛋白X，选择了鼠抗X一抗，则可选择兔抗鼠二抗或者羊抗鼠二抗。

二抗选择要考虑的问题有：①对单抗类一抗，二抗需与一抗的类别或亚类相匹配（多抗类一抗主要是IgG类免疫球蛋白故相应二抗就是抗IgG F(ab’)2二抗，避免各种Ig保守结构域导致的交叉反应。

然而各种Ig仍具有保守的轻链结构域，因此还是有一定程度的交叉反应。

WB检测之内参抗体Western Blot检测方法不仅能检测靶蛋白存在与否，还能比较不同条件下或者不同组织中靶蛋白的相对表达量，可作为蛋白表达水平最直接的证据。

在WB实验中有众多不确定因素影响靶蛋白表达水平的测定，如方法学本身性质、操作误差等。

为准确衡量靶蛋白表达水平，需要精确一致的上样量，使用内参的意义即是保证上样量的一致。

内参即内部参照（Internal Control），对哺乳动物细胞一般指管家基因的表达蛋白(Housekeeping Proteins)。

此类蛋白在各组织和细胞中的表达相对恒定，可作为检测蛋白表达水平变化的参照物。

当内参条带亮度基本一致时，基本可以确定上样量是一致的，通常采用比较靶蛋白和内参蛋白条带亮度比值来进行相对定量。

WB实验中涉及到的蛋白-抗体结合是一个复杂的活性生物大分子间的相互作用，众多因素都会影响实验的结果。

例如时间、温度、浓度、离子强度等，在实验设计时就需要有严谨的对照方案，通过对照就容易判断问题所在，严谨的WB实验中需要设立蛋白分子量标准、空白载体对照、未诱导对照、已知量标准物正对照和内参。

内参使用方法1.标记内参：酶标的内参抗体可避免二抗结合总蛋白中某些免疫球蛋白产生的杂带，使用时只需在二抗孵育时加入酶标内参抗体，按照正常操作即可。

Bioss讲堂｜Westernblot内参抗体选择攻略大全Western Blot除了能证明某样品中含有某种蛋白之外，其最为重要的作用是比较不同条件下或者不同组织中，目的蛋白表达量的相对多少——即为蛋白表达水平最直接的证据。

要衡量蛋白的表达水平，前提条件就是等量的上样量。

内参的意义就是保证上样量的一致。

内参即是内部参照（Internal Control），对于哺乳动物细胞来说一般是指由管家基因编码表达的蛋白(Housekeeping Proteins)，它们在各组织和细胞中的表达相对恒定，在检测蛋白的表达水平变化时常用它来做参照物。

选择内参抗体应遵循的原则1、样本来源♠哺乳动物的组织或细胞：β-Actin、β-Tubulin、GAPDH、Lamin B1、PCNA 等；♠植物样本：plant actin、Rubisco 等；♠其他来源样本，应参照已发表文献,选择合适蛋白作为内参。

2、目的蛋白定位▶全细胞蛋白和细胞质：β-Actin、beta Tubulin、GAPDH 等；▶细胞核蛋白：PCNA、LaminA、LaminB、HistoneH3，K70、K80、Erk2、TATAbindingprotein(TBP)以及c-Jun、c-Fos等；▶胞膜蛋白：Na( )/K( ) ATPase 等；▶线粒体蛋白：VDAC1、COXIV等；▶血清：Transferrin等。

3、目的蛋白分子量目的蛋白分子量最好能与内参蛋白分子量相差5kd 以上，各内参蛋白分子量详见下方汇总表。

Tips: 内参的选择还需要考虑实际的试验环境：★在做多组织多细胞样本对比表达量时，最好选用 GAPDH作为内参，因为GAPDH是代谢类蛋白，在活组织中表达比较恒定。

而β-Actin和β-Tubulin是结构蛋白，不同组织的细胞结构会有差异性；★而在某些细胞中，由于组织缺氧、糖尿病等因素会导致GAPDH 的表达增高，不适合做内参；★涉及细胞增殖的相关试验中，c-Jun由于自身表达变化不适合做内参；★凋亡实验时，TBP、Lamin等也不适合作为内参；★做诱导后样本或检测磷酸化等修饰性抗体时，应选择结构蛋白作为内参，如β-Actin 和β-Tubulin。

组织蛋白wb最佳蛋白浓度
在进行蛋白质Western blot (WB)实验时,选择合适的抗体浓度是确保实验结果准确性和重复性的关键步骤之一。

过高或过低的抗体浓度都可能导致背景信号强、特异性条带模糊或者缺失等问题。

因此,优化抗体浓度对于获得清晰、可靠的Western blot结果至关重要。

一般来说,初级抗体的推荐使用浓度范围在1:500-1:5000之间。

但由于不同抗体的性质存在差异,最佳浓度还需要根据具体情况进行试验确定。

以下是一些优化抗体浓度的技巧:
1. 从制造商推荐的浓度范围内选择几个不同的浓度进行试验,观察条带的清晰度和背景情况。

2. 逐步调整抗体浓度,直到获得最佳结果。

可先从较高浓度开始,如1:500,然后逐渐降低,直到背景较清晰时停止。

3. 使用新鲜制备的抗体溶液,因为抗体会随时间降解而失活。

4. 适当延长孵育时间和温度,有利于提高抗体与抗原的结合效率。

5. 优化blocker成分和浓度,有助于降低非特异性背景。

6. 调节洗膜条件,如洗膜缓冲液的成分、次数和时间等,以去除多余抗体。

通过反复试验和优化,确定适用于特定蛋白和抗体的最佳浓度,可以极
大程度上提高Western blot实验的灵敏度和特异性,获得令人满意的结果。

抗体的选择和保存指南当我们要检测目的蛋白在组织中表达情况的时候，如何选择适合我们实验需要的抗体，并恰当保存使用，是每个科研人员需要细心考虑的。

抗体种类繁多，品牌众多，技术参数不一，价格和质量更是相差甚大，如何购买到高质量价格合适的抗体，并准确地做出我们想要的结果，其中有很多细节需要注意。

一、怎样选择适合你实验需要的抗体1. 一抗选择要点（1）确定抗体的名字，注意中英文名字、它名、亚型等信息。

（2）确定你的实验类型，Elisa，WB，IHC，ICC，还是FACS。

一般抗体的说明书都会列出该抗体经验证过适用于何种实验的类型，如果抗体说明书没有提及的应用类型，并不意味着该抗体不适用于此种分析应用类型，而仅是说明尚未经过此种实验验证，请根据说明书列出的已验证的类型来选择适合你实验的抗体。

（3）确定实验样本的种属，Human，Mouse，还是Rat。

一般抗体说明书都列出该抗体经试验验证过适用于何种物种实验，请根据说明书列出已验证的种属来选择适合你实验的抗体。

（4）样本蛋白的结构性质。

了解样本蛋白的结构性质有助于选择最合适的抗体，待测样本蛋白的结构域和样本在提取和处理过程中是否会变性，蛋白空间构象的改变，会影响抗体的免疫亲和反应。

（5）单多克隆抗体的选择。

市面上的抗体还是以多克隆抗体为主，一般单克隆抗体特异性强，但亲和力相对小，检测抗原灵敏度相对就低；而多克隆抗体特异性稍弱，但抗体的亲和力强，灵敏度高，但易出现非特异性染色（可以通过封闭等避免）。

2. 二抗选择要点（1）种属来源。

主要根据一抗种属来源来决定购买二抗来源，如一抗是小鼠来源，那二抗就买抗小鼠的即可（羊、兔等均可）。

（2）标记物的选择。

有HRP、Biotin、荧光素等标记物。

一般SP三步法二抗选择Biotin标记的二抗，以与后面的SP结合反应，而免疫荧光染色就需要购买不同荧光素标记的二抗，如罗丹明、FITC、Cy3等常用荧光素。

二、抗体的稳定性1. 抗体的稳定性是自然界长期进化的结果。

1.我该定制单抗还是多抗？首先应该考虑的就是定制的抗体是应用于什么实验，需要的量是多少？对于科研用户来说1. 抗体常常应用于WesternBlotting、IP等实验中，对于抗体的特异性有一定的要求，但并不是特别的强调2. 往往在研究很多新的蛋白时，并不确定新蛋白是否很重要，是否会是将来很长一段时间的研究重点，所以抗体用量也不大所以针对科研用户，在定制新的蛋白的抗体时，我们强烈建议首先制备多抗用于实验，当得到了理想的实验结果并需要长期的使用该抗体时再考虑制备单抗。

当然，如果您对该抗体的特异性要求特别高（多抗的特异性已无法满足实验要求，比如应用于流式细胞术等）时，还是应该定制单抗对于工业用户来说1. 抗体往往应用于检测定量实验或者功能性实验，对于抗体的特异性要求非常之高2. 目标蛋白基本上都是已知的确定有相当商业开发价值的，而且产品一旦形成，用量会非常大所以针对工业用户，基本上可以直接定制单抗2.我该选多肽还是蛋白作为抗原呢？需要根据抗体应用于什么实验，以及您所能获得的材料来决定1. 实验过程中蛋白处于天然状态，这时使用的抗体识别的一般是蛋白的构象表位和线性表位；这样的实验主要有CO-IP、FACS、Neutralizing/Blocking以及Elisa法检测天然蛋白等2. 实验过程中蛋白处于变性或半变性状态，这时大部分的构象表位已被破坏，抗体识别的一般都是线性表位；这样的实验主要有：Western、IHC/ICC/IF等以多肽作为抗原制备的抗体，识别的是线性表位，在使用时蛋白处于变性或半变性状态下，结果可以令人满意；但不能够保证识别天然蛋白以蛋白作为抗原制备的抗体，识别蛋白的线性和构象表位，基本上所有的实验都可以应用，所以，用蛋白作为抗原应是首选，但是在多肽抗原已可满足实验要求而且得到蛋白有一定难度的情况下，以多肽作为抗原制备抗体更加合适。

3、什么情况应该考虑用设计多肽做抗原？答：如果氨基酸序列已知，但是由于基因克隆或表达等原因得不到抗原蛋白，或者仅需要得到针对抗原蛋白某几个特定表位的抗体，就可以采用多肽合成的方式得到抗原。

免疫组织化学技术中抗体的选择方法和注意事项免疫组织化学技术是一种用于检测组织中特定蛋白质表达的方法，通过使用抗体来实现。

在进行免疫组织化学技术时，选择合适的抗体至关重要，因为抗体的质量直接影响到结果的准确性和可靠性。

在选择抗体时，需要考虑许多因素，包括特异性、灵敏度、特异性和重现性等。

需要注意一些实验中的常见问题，比如非特异性结合、交叉反应和背景信号等。

下面就关于免疫组织化学技术中抗体的选择方法和注意事项做一些介绍。

一、抗体的选择方法1. 确定目标蛋白：在选择抗体之前，首先需要明确目标蛋白的特性和表达模式，比如它的亚细胞定位、分布情况和表达水平等。

2. 搜索合适的抗体：可以通过文献检索、商业抗体数据库、生产商提供的数据和其他实验室的经验等渠道来获得相关信息，然后筛选出合适的抗体。

3. 考虑实验条件：在选择抗体时需要考虑实验所需的条件，比如实验类型（免疫组化、免疫沉淀、免疫印迹等）、样本类型和处理方法等。

二、抗体的注意事项1. 抗体的特异性：选择具有较高特异性的抗体是十分重要的，避免出现与非目标蛋白的结合。

2. 抗体的灵敏度：选择具有较高灵敏度的抗体有助于检测低表达水平的蛋白。

3. 抗体的特异性验证：在使用抗体之前，最好通过Western blotting、siRNA敲低等方法对抗体进行特异性验证。

4. 购买抗体时需要关注生产商提供的抗体性能数据，如免疫组织化学应用图片、抗体的批次一致性以及使用文献等。

免疫组织化学技术中选择合适的抗体是影响实验成败的关键因素之一。

在选择抗体时需要全面考虑各种因素，严格控制实验条件并加强抗体的验证工作，以确保实验结果的准确性和可靠性。

也需要不断总结实验中的经验，加强与其他实验室的交流与分享，以提高免疫组织化学技术中抗体的选择水平和实验技术水平。

抗体的选择随着生命科学的发展，围绕蛋白进行的研究越来越多，抗体试剂在实验中的重要性越来越举足轻重。

面临着纷呈复杂的抗体试剂市场，如何选择到适合自己实验的抗体就变得尤为重要。

（一）目的蛋白的信息确定想检测的目的蛋白是否与抗体识别蛋白信息吻合，注意中英文名字、别名等信息。

某些蛋白具有多种不同的亚型，这需要在选择抗体之前确定要研究的蛋白亚型。

还有些抗体由于其抗原选择的是不同蛋白亚型共有的肽段区域，是可以同时识别多个亚型的。

有的蛋白通过剪切加工才能转变为成熟的活性形式，如Caspase、Insulin等，这就需要根据研究需要，选择针对前体或成熟形式的特异性抗体。

（二）抗体制备所用抗原的信息抗体是由各种不同抗原免疫宿主而制备得来，抗原类型包括：全长蛋白、蛋白片段、多肽、全有机体（如：细菌）或细胞，抗体说明书一般都有制备抗体所用抗原的描述。

在有些情况下，需要查阅抗体制备相关抗原信息来选择抗体。

比如，针对重组表达蛋白选择抗体，如果是表达部分蛋白片段，则需要注意抗体的抗原区域是否在该片段区域内。

某些特殊蛋白（如病原体蛋白）未经过内部验证种属的目的蛋白，需要求助生产商进行蛋白同源性序列比对，并结合制备抗体所用的抗原序列，查看交叉反应的情况。

（三）修饰位点的信息在选择合适的抗体用于特定修饰位点研究时，需要特别注意，不同位点的修饰可能有不同的机制存在，不宜一概而论。

有关不同修饰位点的功能，可以通过查阅文献确定。

另外，由于有的蛋白存在不同亚型且序列高度同源，而不同亚型的某些磷酸化修饰位点周围的序列完全相同，因此针对这些保守的修饰位点的抗体往往会同时识别不同亚型的相似修饰位点。

（四）实验样本的种属信息抗体一般会在出厂前对常见的不同种属目标样本进行内部验证，以确定可以满足的不同种属类型，可以在产品说明书的Species-Reactivity一栏中看到（如人、小鼠、大鼠等）。

通过验证，达到质检要求的种属会明确标记，以备参考。

如何正确的选择WB检测抗体WB免疫印迹法，也称免疫转移技术IBT(Immunoblotting)，是Towbin将1975年Southern 发明的Soutnern blotting技术应用于蛋白-蛋白相互作用建立的免疫学检测方法。

其操作简便，主要用于未知蛋白检测及抗原组分、抗原决定簇鉴定，同时也用于未知抗体的检测和单抗鉴定等，在生物学基础研究和临床疾病早期诊断和预后跟踪分析方面都有应用。

WB检测的基本原理不做细述，可根据以下图片脑补一下：WB实验中使用到的有三种抗体：一抗、二抗和内参抗体。

一抗是唯一针对目标抗原的抗体，可以进行制备也可以购买现货，难度系数较高；二抗直接买就OK，只是需要留意下种属选择；内参抗体必不可少，是WB实验中的质控环节。

那么，宝宝们在制备抗体或者选择抗体时，是不是十分纠结？今天，小编跟大家聊聊。

WB检测之一抗一抗制备如果目的蛋白的现货抗体没有找到，或者都不中意，就需要亲自动手制备了，请公司帮你做也不错哦！自己制备一抗通常情况下可以选小鼠、兔制备多抗或者选小鼠制备单抗，前者省时省钱，后者耗时耗财却各有优缺点。

多抗制备出来容易产生杂带，却容易出结果，单抗制备出来能得到单一条带及一张漂亮的WB图片，拿去炫耀下也不错。

然而做单抗如果没有强有力的细胞培养、融合、筛选经验，也有各种意想不到的结果。

比如完败，或者只筛到一株却不能做WB。

不过在每一步实验中注意细节还是可以得到满意的抗体的。

多抗制备过程：第一步：免疫及效价检测。

看似只是把抗原打进动物体内，其实暗藏玄机，不同的免疫方式效果不一。

通常情况下，免疫效果排序如下：皮内>皮下>腹腔>静脉，通常采用皮内或皮下免疫。

免疫剂量过多过少均会产生免疫耐受，一般小鼠每次每只免疫50 μg共4次，兔每次每只免疫300-500 μg共5次。

每次免疫后测定效价均要设置对照，以排除各种情况导致的ELISA假阳性或假阴性。

第二步：取血。