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ISS N 100727626C N 1123870ΠQ中国生物化学与分子生物学报Chinese Journal of Biochemistry and M olecular Biology2005年4月21(2):282～286・研究简报・生长激素信号肽可诱导重组蛋白外分泌表达张志谦3, 李金萍, 胡 颖(北京大学临床肿瘤学院暨北京市肿瘤防治研究所,北京 100034)Secretion of R ecombinant Proteins in Mammalian Cells Directedby G row th H ormone Signal PeptideZH ANG Zhi 2Qian 3,LI Jin 2Ping ,H U Y ing(Department o f Cell Biology ,Peking Univer sity School o f Oncology ,Beijing Institute for Cancer Research ,Beijing 100034,China )Abstract Signal peptide capable of efficiently directing many protein secretion in mammalian cells is one ofthe key elements in recombinant protein production ,gene therapy and the development of DNA vaccines.In order to explore the possibility of rat growth horm one signal peptide as such an element ,a new vector based on the mammalian expression vector pcDNA3was constructed by em ploying rat growth horm one (rG H )signal peptide as leading sequence ,followed by multiple cloning sites ,the myc epitope 2tag and 6×his purification tag in the expression cassette.The vector was validated by success fully expressing and secretion of chick M MP 22C 2terminal PEX domain ,a potential angiogenesis inhibitor ,and tandem peptide repeats of myc epitope 2tag in C OS 27cells.These results suggest that rat growth horm one signal peptide is effective in the mediation of recombinant protein expression and secretion ,and this vector provides a new tool for universal cloning and secretion of ex ogenous proteins in mammalian cells.K ey w ords rat growth horm one ,signal peptide ,secretion vector ,mammalian cell中图分类号 R392收稿日期:2004210222,接收日期:2004212221国家自然科学基金(N o.30270658)、北京市自然科学基金(N o.7002009)、北京市肿瘤分子生物学高技术实验室、人事部留学回国人学重点项目、教育部留学回国人员启动基金、中华医学基金专项人才基金项目3联系人T el :010*********,E 2mail :zqzhang @Received :October 22,2004;Accepted :December 21,2004Supported by National Natural Science F oundation of China (N o.30270658),Natural Science F oundation of Beijing Municipal (N o.7002009),Beijing K ey High 2T echnology Laboratory of Cancer M olecular Biology ,and Chinese M edical Board F oundation3C orresponding author T el :86210266179250E 2mail :zqzhang @ 重组蛋白质的表达是生物医药开发、基因功能和作用机理研究中关键技术环节.虽然细菌表达体系由于表达量大、经济等而被广泛采用,但由于其不能提供许多蛋白质必需的翻译后修饰如糖基化等,所表达的蛋白又多以不可溶包涵体形式存在,变性复性过程复杂,产率低,因此真核细胞表达体系如CH O 、C OS 等成为活性要求高的蛋白质表达的首选[1].重组蛋白质在CH O 、C OS 等真核细胞的表达多需要由信号肽引导分泌至细胞培养基内.信号肽由15～30个疏水性氨基酸组成,位于表达蛋白的N 末端,在蛋白质表达过程中介导与粗面内质网的蛋白质翻译复合体作用,进一步转运入高尔基氏体的管腔.在转运过程中,该前导肽序列被肽酶水解切割释放,蛋白质完成糖基化和其它的翻译后修饰.如所表达的蛋白不具有跨膜结构域,则可以从细胞分泌至细胞外的培养基内[2,3].哺乳类细胞表达重组蛋白虽然从活性角度讲具有优势,但产量很低,在医药领域的大规模应用受到极大限制.目前主要从提高基因表达的量、信号肽顺序的优化、利用蛋白酶缺陷细胞系避免蛋白质的降解、宿主细胞改造适合高密度悬浮培养以及培养条件的优化等方面进行改进以提高产量和分泌的效率[4].小鼠IgG κ链[5]、前胰蛋白酶原[6]、红细胞生成素[7]、降钙素前体的前导肽序列[8]已被尝试用于重组蛋白质在哺乳类细胞的分泌表达,但实际表达过程中不同的蛋白分泌量具有较大差异.由于信号肽位于蛋白质的N 末端,其实际还决定着蛋白质的翻译起始,不同的信号肽一级结构可能还影响着蛋白质的折叠、细胞内的转运和分泌的效率[9],因此具有相对实用性广和可高效率引导蛋白质表达分泌信号肽的筛选是该领域有待解决的关键问题之一.我们推测在体液内存在的蛋白质或肽如各种激素、细胞因子的信号肽可能在诱导蛋白质的分泌表达方面具有优势.本文利用大鼠生长激素的信号肽尝试表达鸡M MP22C末端PEX片段,建立了以大鼠生长激素信号肽为前导肽、具有纯化标签的哺乳类细胞重组蛋白质分泌表达载体.1 材料和方法111 细胞、菌种和试剂中国仓鼠卵巢细胞C OS27细胞来源于美国AT CC,本室保存.所用限制性内切酶、Vent耐热DNA 聚合酶购自美国New England Biolabs;T4DNA聚合酶购自Promega公司.细胞培养基及血清均购自GI BC O/BR L公司.所用其它试剂除特别注明外均购自Sigma公司.112 大鼠生长激素信号肽RT2PCR扩增及载体构建用RT2PCR分别从大鼠脑垂体和11日龄鸡胚胎扩增大鼠生长激素(rG H)信号肽序列和鸡M MP22 C末端片段PEX序列.大鼠生长激素引物:正义:5’2 GG CAAG CTT(Hin dⅢ)AC AG AT C ACTG AG TGG23′、反义:5′2AG AGG AT CCT(Bam HⅠ)GG AC AAGGG C ATG2 3’;鸡M MP22C末端PEX引物:正义:5’2CGG AT CC (Bam HⅠ)T CTG C AAG C ACG23’,反义:5’2CCT CT AG A (XbaⅠ)G C AAG T CCT CTT C AG AAAT C AG TTTTTGCT CG AG(XhoⅠ)G C AACCC AACC AG T C.大鼠生长激素信号肽与PEX的PCR产物以约等分子比混合作为模板,以rG H的正义引物和PEX的反义引物PCR扩增使rG H信号肽与PEX相连接,再以该产物为模板用rG H的正义引物和引物5’2CTGGG CCC(ApaⅠ) T AATG ATG ATG ATG ATG ATGT CT AG A(XbaⅠ)C AAG T CCT CTT C AG23’在融合蛋白的C端PCR加上Myc抗原标签和6×His纯化标签的编码序列,Hin dⅢ与ApaⅠ酶切后,T4DNA聚合酶连接装入相应酶切的真核表达载体pcDNA310(美国Invitrogen公司产品).转化大肠杆菌DH5α,取酶解鉴定正确的克隆测序确认,用T ip2500(Qiagen公司产品)大量提取和纯化质粒备用.113 细胞培养、基因转染C OS27细胞常规生长在生长培养基(含10%胎牛血清的ME M),基因转染采用Lipofectamine (GI BC OΠBR L),按照厂家使用说明书进行.114 免疫荧光染色生长在盖片上的细胞经2%甲醛ΠP BS固定3 min,0.5%T riton X2100ΠP BS抽提3次,每次10min.与一抗鼠抗Myc10肽抗原标签单抗9E10细胞培养上清(1∶10稀释)(购自美国宾夕法尼亚大学细胞中心)37℃反应1h,0.5%T riton X2100ΠP BS洗涤3次,每次10min,与二抗罗丹明标记的山羊抗小鼠抗体(Jacks on ImmunoResearch Laboratories)37℃温育1h, 0.5%T riton X2100ΠP BS洗涤,封片,Olym pus BH22落射荧光显微镜观察,K odak T max2400胶卷照相.115 Western杂交分析细胞培养上清变性后经12%S DS2PAGE分离,电转移至PVDF膜(Milipore).5%脱脂奶粉ΠTT BS室温封闭1h,TT BS洗膜,一抗鼠抗Myc10肽抗原标签单抗9E10细胞培养上清(1∶1000稀释)作用1h, TT BS洗膜,二抗HRP标记的山羊抗小鼠抗体(1∶80000稀释)(Jacks on ImmunoResearch Laboratories)室温孵育1h,TT BS洗膜后,加入EC L化学发光试剂(Amersham公司),曝光,冲片.2 结果211 大鼠生长激素信号肽能改变重组蛋白的细胞内分布将PEX与pMyc2N融合构建MycPEX/pcDNA3载体,转染C OS27细胞,分别于转染后24h、48h利用Myc抗原决定基标签肽抗体9E10进行免疫荧光染色,结果在细胞质内可见大量大小不等、数量差异的聚集物(Fig.1),提示该蛋白在细胞内不可溶,斑块大小、数量与转染后的时间无关.选用人胃腺癌细胞MG C2803得到相同结果(结果未显示),说明不可溶性团块的形成与细胞类型无关.将PEX的N段通过DNA重组换为大鼠生长激素信号肽,免疫荧光结果显示PEX在核周呈帽状聚集分布,大小较为均匀,与高尔基氏体的细胞亚单位定位相一致,具备分泌蛋白的典型细胞亚区分布特征.提示大鼠生长激素信号肽可诱导外源重组蛋白进入细胞内分泌蛋白的加工、转运途径.212 大鼠生长激素信号肽可成功诱导重组蛋白分泌到细胞培养基取基因瞬时转染后48h的C OS27细胞的培养基,S DS2PAGE后,用Myc抗体进行Western杂交分析,结果如Fig.2所示.rG HPEX mycHisΠpcDNA培养基382第2期张志谦等:生长激素信号肽可诱导重组蛋白外分泌表达 Fig.1 Immunofluorescent staining of M yc/PEX to dem onstrate the localization of expressed PEX in trans fected COS27cells(A)M ycPEXΠpcDNA3;(B)rG HPEX/pcDNA3.Bar:20μm15μl用Myc抗体即可检测到约26kD的阳性条带,与理论推导的PEX分泌蛋白的分子量吻合.不带信号肽的MycPEXΠpcDNA和空载体转染的培养基内均未检测到条带.这提示大鼠生长激素信号肽可诱导外源重组蛋白分泌到细胞外,同时改变蛋白的可溶性. 213 带有大鼠生长激素信号肽、Myc抗原以及6×H is纯化标签载体的建立和验证为使该载体适用于多数基因的克隆和表达,我Fig.2 W estern blot analysis of COS2culture supernatants48hours aftertransient trans fection probed with M yc antibody1.rG HPEX mycHisΠpcDNA;2.E.coli expressed PEX as positive control;3.M ycPEXΠpcDNA without signal peptide们将PEX序列置换成多克隆位点,构建成大鼠生长激素信号肽诱导的具有外分泌功能的真核细胞表达载体prG HSecmycHis(Fig.3).将Myc标签的十肽串重重复序列(含有多个Myc标签的十肽,构建过程将另文发表)用常规重组技术构建入prG HSecmycHis载体,使阅读框架吻合.基因瞬时转染C OS27细胞,Western杂交成功检测到转染48h后培养基内预期分子量的Myc标签十肽的串重重复序列重组蛋白(Fig.4),证明该载体亦可用于其它外源蛋白的真核细胞外分泌表达.Fig.3 Multiple cloning sequence of the eukary otic secretion expression vector prG HSecmycHisT o construct prG HSecmycHis,this sequence replaced the multiple cloning sites between Hin dⅢand ApaⅠof pcDNA3.Arrow:signal peptide cleavage site482中国生物化学与分子生物学报21卷Fig.4 W estern blot result of(M yc)nΠprG HSecmycHis trans fected COS27 culture medium probed with9E10M yc antibodyFifteen m icroliters of culture supernatants were loaded in each lane.1.untrans fected cell supernatants;2.(M yc)nΠprG HSecmycHis trans fected cell supernatants3 讨论许多分泌蛋白质具有其特有的信号肽序列,一些分泌性细胞因子有时可具有相同的信号肽序列.信号肽在体内分泌型蛋白质的成熟过程中十分重要,近年来发现其亦可使本不具有分泌功能的蛋白质或短肽分泌到细胞外[5,8],并具有生物活性,这一策略在生物医药工程中的应用价值日益引起人们的重视并得到广泛应用.然而,一种信号肽能否成功引导蛋白质的高效表达和分泌,受许多因素影响,具体调控机制不清,Li等人的工作提示含有较多阳性氨基酸的信号肽可能不利于蛋白质的分泌表达[9].我们感兴趣的是不同的信号肽在诱导同一种蛋白的表达和分泌上是否具有相同的效应,希望最终筛选到具有相对广泛适用性的信号肽.作为该工作目标的第一步,本工作初步研究结果发现,大鼠生长激素信号肽作为前导肽序列,可以分别将鸡源M MP22的C 末端片段PEX以及Myc标签十肽串重复序列分泌到细胞培养基中.氨基酸顺序分析表明,大鼠生长激素信号肽不含有任何带正电荷氨基酸,其一级结构特点符合文献报道的具高效率分泌功能的信号肽的特性,表明以其作为真核细胞外分泌表达载体中的前导肽序列是可行的.初步研究结果表明,在分泌的表达量上,该信号肽高于人干扰素信号肽,与lgGκ链等已知信号肽的比较需要进一步的工作.PEX是近年来发现具有抗肿瘤血管发生的由M MP22降解产生的内源性因子[10,11],PEX在细菌表达体系里以不可溶包涵体形式存在[10],变性复性过程复杂,产率也比较低.当不用信号肽以哺乳类细胞C OS27表达时,表达蛋白也以细胞内聚积体形式存在,亦提示高度不可溶,这使得获得大量具有活性的PEX相对较为困难.大鼠生长激素信号肽在诱导PEX进入蛋白质分泌途径时,可以对蛋白质进行诸如糖基化等修饰,以可溶形式分泌到细胞培养基中,使蛋白既容易保留其原来的自然状态和活性,下游的纯化又可容易进行.由于所构建的载体含有6×His纯化标签,当要表达的蛋白与其形成融合蛋白时可以利用Ni2NT A亲和柱进行纯化.我们已成功利用其从转染的细胞培养基中纯化到表达分泌的PEX (未发表结果).在所构建的表达分泌载体prG HSecmycHis的Myc抗原决定基标签、6×His标签前后均有常用内切酶位点,在构建过程中可以根据实验目的和需要很容易对标签肽随意选择,有利于重组过程. PcDNA3是应用较为广泛的真核细胞表达载体, prG HSecmycHis构建以其作为骨架,继承了该载体已有特点,如以C MV为启动子、含有S V40复制子(可以在含S V40大T抗原的细胞如C OS27多拷贝复制)和Neomycin筛选标志等.这些特点使prG HSecmycHis 在核酸疫苗载体开发、基因治疗、蛋白质表达等领域有广阔的应用前景.参考文献(R eferences)1 Y an S C B,G rinnell W,W old F.P ost2translational m odifications of proteins:s ome problems left to s olve.Trends Biol Sci,1989,14:2642 V on Heijne G.Patterns of am ino acids near signal2sequence cleavage sites.Eur J Biochem,1983,133:17～213 Perlman D,Halv orors on H O.A putative signal peptidase recognition site and sequence in eukary otic and prokary otic signal peptides.J Mol Biol, 1983,167:391～4094 Schm idt F R.Recombinant expression systems in the pharmaceutical industry.Applied Microbiol.Biotechnol,2004,65(4):363～3725 C oloma M J,Hastings A,W ims L A,M orris on S L.N ovel vectors for the expression of antibody m olecules using variable regions generated by polymerase chain reaction.J Immunol Methods,1992,152:89～1046 Chubet R G,Brizzard B L.Vectors for expression and secretion of F LAG epitope2tagged proteins in mammalian cells.BioTechniques,1996,20: 136～1417 Herrera A M,Musacchio A,Fernandez J R,Duarte C.E fficiency of erythropoietin’s signal peptide for HIV m m21gp120expression.Biochem Biophys Res Commun,2000,273:557～5598 Liu Y C,K awagishi M,M ikayama T,Inagaki Y,T akeuchi T,Ohashi H.Processing of a fusion protein by endoprotease in COS21cells for secretion of mature peptide by using a chimeric expression vector.Proc Natl Acad Sci USA,1993,90:8957～8961582第2期张志谦等:生长激素信号肽可诱导重组蛋白外分泌表达 9 Li Y,Luo L,Ras ool N,W agner R R,K ang C Y.Viral lipos omes released from insect cells in fected with recombinant baculovirus expressing the matrix protein of vesicular stomatitis virus.J Virol,1993,7:584～588 10 Brooks P C,S illetti S,v on Schalscha T L,Friedlander M,Cheresh D A.Disruption of angiogenesis by PEX,a noncatalytic metalloproteinase fragment with integrin binding activity.Cell,1998,92(3):391～400 11 李金萍,张光谋,柯杨,林本耀,赵威,胡颖,宁涛,林仲翔,张志谦.基质金属蛋白酶22C端片段PEX的原核表达及其对血管发生的抑制作用.生物化学与生物物理进展(Li Jin2Ping,Zhang G uang2M ou,K e Y ang,Lin Ben2Y ao,Zhao W ei,Hu Y ing,Ning T ao,Lin Zhong2X iang,Zhang Zhi2Qian.Prokary otic expression of PEX:a C2 term inal fragment of matrix metalloproteinase2and its effect on the inhibition of angiogenesis.Prog Biochem Biophys),2002,29(1):120～123《中国生物化学与分子生物学报》第五届编辑委员会名单The Fifth Editorial Board of Chinese Journal of Biochemistryand Molecular Biology顾 问(Advisors)郑 集 ZHE NGJi 张昌颖 ZH ANG Chang2Y ing 邹承鲁 Z OU Cheng2Lu(Chen2lu TS OU)主 编(Editor2in2Chief)贾弘 J I A H ong2T i副主编(Associate Editors2in2Chief)昌增益 CH ANG Z eng2Y i李 林 LI Lin尚永丰 SH ANG Y ong2Feng孙志贤 S UN Zhi2X ian王琳芳 W ANGLin2Fang王志珍 W ANG Zhi2Zhen杨福愉 Y ANG Fu2Y u查锡良 ZH A X i2Liang编 委(Members of the Board,alph abetically)昌增益 CH ANG Z eng2Y i陈清西 CHE N Qing2X i耿运琪 GE NG Y un2Qi顾 军 G U Jun杭海英 H ANG Hai2Y ing赫荣乔 HE R ong2Qiao黄 力 H UANGLi贾弘 J I A H ong2T i蒋澄宇 J I ANG Cheng2Y u焦炳华 J I AO Bing2Hua柯 扬 KE Y ang金由辛 J I N Y ou2X in李伯良 LI Bo2Liang李 刚 LI G ang李根喜 LI G en2X i李桂源 LI G ui2Y uan李 林 LI Lin李 宁 LI Ning李载平 LI Z ai2Ping梁爱华 LI ANG Ai2Hua梁宋平 LI ANG S ong2Ping林其谁 LI N Qi2Shui刘德富 LI U De2Fu刘德培 LI U De2Pei刘国琴 LI U G uo2Qin刘进元 LI U Jin2yuan缪时英 MI AO Shi2Y ing彭景 PE NGJing2Pian钱关祥 QI AN G uan2X iang强伯勤 QI ANG Bo2Qin屈良鹄 QU Liang2Hu饶子和 RAO Z i2He施蕴渝 SHI Y un2Y u阮康成 RUAN K ang2Cheng尚永丰 SH ANG Y ong2Feng寿成超 SH OU Cheng2Chao孙志贤 S UN Zhi2X ian王嘉玺 W ANGJia2X i王琳芳 W ANGLin2Fang王志珍 W ANG Zhi2Zhen魏 群 WEI Qun温进坤 WE N Jin2K un许根俊 X U G en2Jun杨福愉 Y ANG Fu2Y u杨克恭 Y ANG K e2G ong杨晓明 Y ANG X iao2M ing药立波 Y AO Li2Bo姚仁杰 Y AO Ren2Jie叶棋浓 YE Qi2N ong袁勤生 Y UAN Qin2Sheng查锡良 ZH A X i2Liang张 今 ZH ANGJin张 蘅 ZH ANG Nai2Heng张旭家 ZH ANG Xu2Jia张 翼 ZH ANG Y i周春燕 ZH OU Chun2Y an周海梦 ZH OU Hai2Meng周筠梅 ZH OU Jun2Mei朱大海 ZH U Da2Hai朱卫国 ZH U Wei2G uo朱玉贤 ZH U Y u2X ian特邀编委(Specially I nvited Members of the Board)吴 瑞 Ray W U(US A)于宽仁 R obert K.Y U(US A)682中国生物化学与分子生物学报21卷。
如何选择二抗抗体简介抗体：是高等动物在抗原物质的刺激下由浆细胞产生的一类能与相应抗原发生特异性结合的免疫球蛋白。
抗体通常存在于血清合淋巴（组织液）中。
单克隆抗体及多克隆抗体：由单一克隆的细胞（通常是单一克隆的杂交瘤细胞）所产生的识别某一抗原表位的单一抗体；多克隆抗体是由多种细胞分别接触相应抗原而产生的多种抗体的总和，多克隆抗体抗原识别抗原的多个表位。
抗体结构：抗体是由四条肽链构成的“Y”形对称的分子，包括两条重链和两条轻链。
在“Y”的尖端部位的氨基酸顺序在不同的抗体分子中差别很大，是负责与抗原进行特异性结合的区域，称为可变区，余下的区域则称为恒定区。
抗体分类抗体分类：根据重链恒定区的血清学类型，可将抗体分为IgM，IgG，IgA，IgD，IgE五类，它们的重链分别为mu, gamma, alpha, delta, epsilon链。
在上述每一类别中，按重链构造上的变异又可分为几个亚类，例如人的IgG可分为IgG1，IgG2，IgG3，IgG4四个亚类。
轻链分为两种类型，kappa链和lambda链，但每种抗体中只存在一种类型的轻链。
二抗：二抗是在其它宿主体内制备的能与一抗或一抗片段结合的抗体，上面通常连有酶或荧光素等标签。
由于二抗所具备的优点使得其在免疫学实验中得以应用广泛，如western blot（通过与特异性抗体结合来鉴定蛋白质），ELISA（以耦联有酶的抗体或抗原为标记来检测特异性的蛋白质，尤其是相应的抗原或抗体），免疫组织化学（检测组织中的特异性抗原），免疫细胞化学（通过免疫学方法检测细胞的抗原组成），流式细胞术（通过检测激光所激发荧光来鉴定分离不同类型的细胞）及免疫沉淀（通过抗原与抗体的特异性结合作用来分离相应抗原）。
二抗针对某一特定物种（如小鼠）的所有抗体均具有特异性，因而使用标记的二抗可以免去对每一个一抗进行标记，大大节省了时间和费用；此外，一个一抗分子可以同时结合几个二抗分子，从而使信号大大增强，提高了实验灵敏度。
抗人二抗丨Jackson ImmmoResecarch二抗选择指南血清学检测在临床决策中起着至关重要的作用，免疫分析是目前可用的最强大，最灵敏的血清学检测方法之一，它基于抗原抗体之间的高度特异性结合，即使在低浓度下也能进行定性和定量检测。
当选择用于夹心法检测的抗人二抗时（图1A），需要考虑一抗的种属，并使用与该物种有最小交叉反应的二抗。
尽管免疫测定的功能和目的有所不同，但为了在临床上获得准确，可靠数据，开发血清学试剂盒时，高质量试剂至关重要。
抗人二抗的质量是开发免疫测定试剂盒时的关键考虑因素，二抗需要谨慎选择，因为它们会结合一种一抗的多个表位上，从而增强了信号的灵敏度和选择性。
在免疫分析中选择合适的二抗时的考虑因素以及抗体的特征，Jackson 二抗为例：1.抗体来源：人体样品的血清学检测应使用抗人二抗，以最大程度地减少非特异性结合，以最大程度降低背景信号和假阳性。
Jackson 二抗可以提供多种来源的抗人二抗，包括羊驼，驴，山羊，小鼠和兔子。
2.产品类别：二抗可以是完整的免疫球蛋白（Ig）G，也可以是F（ab'）2和Fab片段，完整的IgG分子可适用于大多数检测，而F（ab'）2和Fab片段可用于避免与具有Fc受体的活细胞的非特异性结合。
Jackson 二抗可以提供完整IgG形式的二抗以及F（ab'）2和Fab片段3.特异性：根据所需免疫测定的特异性，可以制备针对整个Ig分子的二抗，以及针对于Fc 或F（ab'）2结构域特异性的二抗。
Jackson 二抗可以提供针对于对整个人源Ig分子的二抗，以及针对于Fc和F（ab'）2结构域特异性的二抗。
4.亚型：大多数免疫测定均只检测IgG型抗体，这种类型抗体占总血清Ig的?75％，是次级免疫反应的一部分。
但是，血清中同时也存在IgM和IgA，而且二抗只对同亚型一抗的具有特异性。
Jackson 二抗可以提供对IgG，IgM，IgA，IgG+IgM和IgG+IgM+IgA一种或几种亚型有特异性的二抗。
免疫荧光一抗二抗的选择及其技巧据一抗种属及类型-如何选择二抗?如何选择二抗——根据一抗种属及类型选择合适的二抗二抗广义上是指专门和一抗进行特异性反应和结合的抗体，在免疫学反应中，经常需要针对试验选择不同的二抗，艾美捷能为您的科研工作提供最适合和最全面的二抗产品。
检测任何目的靶蛋白都有不止一种抗体可供选择，同时在后继试验中也会有不同的检测方案，因此在选择二抗的时候要综合考虑一抗的类型及后继检测方案的要求，一般来说，选择合适的二抗需要从下面几个方面考虑：【一抗的种属来源】二抗应选用与使用的一抗相同的物种来源，例如：如果你的一抗是小鼠源的单克隆抗体，二抗则选抗小鼠的二抗（山羊抗小鼠或者兔抗小鼠等均可）；如果一抗是从兔血清里制备的兔源多克隆抗体，则相应的二抗需要选择抗兔的二抗。
即根据一抗的物种来源选择相应的抗该物种的二抗。
艾美捷能为您提供最全的抗不同种属的原装进口二抗，包括抗小鼠、大鼠、兔、山羊、绵羊、人、豚鼠、猪、马、牛、鸡、鸭等二抗。
【一抗的类别亚型】二抗需与一抗的类别或亚类相匹配。
这通常是针对单克隆抗体而言。
多克隆抗体主要是IgG类免疫球蛋白，因此相应的二抗就是抗IgG抗体。
其中单克隆抗体的类别及亚类通常会在产品说明书中都会有描述，如果你的一抗是小鼠IgM，那么相应的二抗就应当是抗小鼠IgM。
如果单克隆一抗是小鼠IgG的某一亚类（IgG1，IgG2a，IgG2b，IgG3），那么几乎所有的抗小鼠IgG都可以与之结合，或者你也可以选择专门针对这一亚类的二抗，例如，如果你的一抗是小鼠IgG1，那么你可以选择抗IgG1的二抗，此种抗体在双标记实验中尤其适合。
在不清楚一抗为何种类/亚类的情况下，可以选用抗相应物种IgG。
艾美捷能为您提供通用的IgG（H+L）二抗，或者特异性只结合IgM的Anti IgM （mu） Antibody、IgA的Anti IgA （alpha-Antibody、IgE的Anti IgE （epsilon） Antibody等。
抗体它是高等动物在抗原物质的刺激下由浆细胞产生的一类能与相应抗原发生特异性结合的免疫球蛋白。
抗体通常存在于血清合淋巴（组织液）中。
单克隆抗体及多克隆抗体：由单一克隆的细胞（通常是单一克隆的杂交瘤细胞）所产生的识别某一抗原表位的单一抗体；多克隆抗体是由多种细胞分别接触相应抗原而产生的多种抗体的总和，多克隆抗体抗原识别抗原的多个表位。
抗体分类抗体分类：根据重链恒定区的血清学类型，可将抗体分为IgM，IgG，IgA，IgD，IgE五类，它们的重链分别为mu, gamma, alpha, delta, epsilon链。
在上述每一类别中，按重链构造上的变异又可分为几个亚类，例如人的IgG可分为IgG1，IgG2，IgG3，IgG4四个亚类。
轻链分为两种类型，kappa链和lambda链，但每种抗体中只存在一种类型的轻链。
第一抗体第一抗体就是能和非抗体性抗原特异性结合的蛋白。
第一抗体的选择1.分析自己实验应用的实验方法是哪种？一般抗体说明书都列出该抗体经试验验证过适用于何种分析类型，如：可以应用于WB、IHC、ICC、ELISA、FCM分析等。
2.分析自己实验中标本的种属是哪种动物或人的？一般抗体说明书都列出该抗体经试验验证过适用于何种动物或人的标本，如：可以用于rat、mouse、human、pig、goat等动物的标本的实验。
也就是说应选择物种相同或有交叉反应的抗体，抗体可能与不同物种的同种靶蛋白有交叉反应，因其氨基酸序列同源性较高。
3.分析样本中的蛋白质的结构性质了解样本蛋白的结构性质有助于选择最合适的抗体，至少两方面因素需要考虑待测样本蛋白的结构域：抗体是由各种不同免疫原免疫宿主而制备得来，其中的免疫原包括：全长蛋白、蛋白片断、多肽、全有机体（如：细菌）或细胞，抗体说明书一般都有免疫原的描述，如果打算检测的是蛋白片断或一种特殊的同型物或蛋白全长的某一区域，则必须选择用含此片段域的免疫原制备出的抗体。
Jackson ImmunoResearch 公司二抗选用指南(此部分内容来源于Jackson ImmunoResearch Laboratories Inc网站，如有疑问，请参考原网站）亲和层析法纯化的二抗用亲和层析法纯化的抗体是指，利用耦联到琼脂糖凝胶上的抗原将抗血清中的抗体亲和层析下来。
我们采用一种特有的连续的洗脱过程将抗体从固态抗原上分离出来。
我们提供的未标记的亲和层析法纯化的抗体是不含有稳定剂和防腐剂的无菌液体。
耦联标记物的抗体是冻干粉，里面含有稳定剂和防腐剂，但是过氧化物酶标记的抗体里面不含防腐剂。
(下面内容中的页码指的是Jackson 2019年原版目录中的页码）亲和层析纯化抗体的选择和定位第一步：选择Whole IgG（8－17页）、F(ab’)2片段（18－22页），或者Fab片段（23－25）抗体。
我们提供三种亲和纯化的抗体：Whole IgG，F(ab’)2片段，Fab片段。
Whole IgG（8－17页）抗体是从抗血清中分离出来的完整的分子。
这些抗体有一个Fc部分和两个与抗原结合的Fab部分，因此是二价的。
Whole IgG抗体适用于多数情况（见F(ab’)2片段、Fab片段的特例），也是性价比最高的。
F(ab’)2片段（18－22页）抗体是用胃蛋白酶消化IgG去除Fc部分，剩下两个靠二硫键连接的结合抗原的Fab部分（依然是二价的）。
这些抗体用在特定的情况中，例如避免抗体与Protain A 或G 结合，或者与有Fc受体的活细胞结合。
但是，如果一抗是whole IgG，不管二抗是哪种形式都可能出现结合Fc受体。
这时，为了阻止抗体结合到Fc受体上，可以在4度将细胞预培养于含有叠氮钠和二抗来源物种正常血清的缓冲液中。
注意：当使用的是带标记的二抗时，千万不能用一抗来源物种的正常血清和IgG来封闭。
如果血清中的免疫球蛋白非特异性的结合到样品上，他们会被带有标记的二抗识别，导致背景过高。
肝癌微环境中M2型肿瘤相关巨噬细胞对肝癌转移功能的影响及其机制研究一、本文概述肝癌，作为全球范围内致死率极高的恶性肿瘤之一，其发生、发展及转移过程涉及众多复杂的生物学机制。
在众多影响肝癌进程的微环境因素中，肿瘤相关巨噬细胞（TAMs）的作用日益受到关注。
特别是M2型TAMs，因其具有促进肿瘤生长、侵袭和转移的特性，已成为肝癌研究的新热点。
本文旨在深入探讨M2型TAMs在肝癌微环境中对肝癌转移功能的影响及其潜在机制，以期为肝癌的诊疗提供新的思路和方法。
我们将首先概述肝癌的流行病学特征、临床表现及其治疗现状，以明确肝癌研究的背景和重要性。
随后，我们将重点分析M2型TAMs 在肝癌微环境中的分布、功能及其对肝癌转移的影响，通过文献综述和实验数据相结合的方式，揭示M2型TAMs与肝癌转移之间的内在联系。
在机制研究方面，我们将深入探讨M2型TAMs如何通过分泌特定细胞因子、趋化因子等方式，与肝癌细胞相互作用，促进肝癌的侵袭和转移。
我们还将关注M2型TAMs在肝癌免疫逃逸中的作用，以及其与肝癌预后的关系。
通过本文的研究，我们期望能够为揭示肝癌转移的分子机制提供新的视角，同时为开发针对M2型TAMs的肝癌治疗方法提供理论依据。
这不仅有助于提升我们对肝癌发生、发展过程的理解，还可能为肝癌的临床治疗带来革命性的突破。
二、材料与方法1 细胞系：本研究所用肝癌细胞系（HepG2和MHCC97H）及小鼠巨噬细胞系（RAW7）均购自中国科学院细胞库。
2 主要试剂：RPMI 1640培养基、胎牛血清（FBS）、青霉素/链霉素双抗、胰蛋白酶等细胞培养所需试剂购自Gibco公司；M2型巨噬细胞诱导剂IL-4和IL-13购自PeproTech公司；细胞迁移和侵袭实验所需Transwell小室购自Corning公司；RNA提取试剂Trizol、逆转录试剂盒及实时荧光定量PCR试剂盒购自Thermo Fisher Scientific公司；Western Blot所需试剂购自Bio-Rad公司；其他常用化学试剂均购自国药集团。
如何选择二抗羊抗兔：指把兔体内的抗原注射到羊的体内，而在羊的体内产生抗兔的抗体，即羊抗兔抗体，这个抗体来由羊产生的，是羊源的。
一抗如果是鼠抗人的抗体，二抗应该是另一种动物抗鼠的抗体，而且一抗和二抗的动物种属原则上不应该相同。
一般来说，一抗多用兔抗和鼠抗，而二抗多用羊抗。
二抗一般选择被碱性磷酸酶标记过的。
单克隆抗体是指针对于抗原标志物上某一种抗原决定簇产生的单一种类的抗体，一般通过杂交瘤细胞技术制得；多克隆抗体是指针对抗原上多个抗原决定簇产生的抗体，一般将抗原免疫动物血清直接制得。
对于一抗来说，现用单克隆抗体较多。
相对于一抗的特异性，二抗要求广谱抗体，最好能够一对多。
现在购买的二抗多是二抗加亲和素生物素的复合物，与传统二抗有所不同。
In most cases, there are actually several antibody-conjugates that would work well in a particular application and finding the best one requires comparing them side-by-side.The following information is provided to help you decide which secondary antibody may be best for your particular application:1.In what animal was the primary antibody developed?For example if your primary antibody is raised in a mouse, you will need ananti-mouse secondary antibody. If it is raised in a rabbit, for example A2066(rabbit anti-actin), you will need an anti-rabbit secondary antibody.2.What is the class and/or subclass of the primary antibody.This is primarily important in the case of monoclonal antibodies. Polyclonalantibodies (generally developed in rabbit, goat, sheep or donkey) are typicallyIgG class immunoglobulins. For this reason, the secondary antibodies for thesespecies will mainly be anti-IgG. Monoclonal antibodies (MAbs) are mostcommonly developed in mice and occasionally in rats. The class and subclass ofour monoclonals is indicated in the product listing. For example, if the primaryMab is mouse IgM, one would want a secondary antibody that reacts with mouseIgM (anti-Mouse IgM or anti-Mouse IgG (Fab)).If the primary monoclonal is one of the mouse IgG subclasses (IgG1, IgG2a,IgG2b, IgG3), almost any of our anti-mouse IgG secondary antibodies shouldbind to it. However, we offer different specificities to provide the end-user withoptions, especially for specific double labeling experiments. If the class and/orsubclass of the primary antibody is not known, the anti-Mouse IgG (Fab)secondary antibodies may be used since they recognize most mouseimmunoglobulin subtypes.You may experience difficulty when choosing a the best secondary anti-mouseor anti-human IgG. This is because there are many specificities to IgG. The important thing to remember is that light chains (kappa and lambda) of immunoglobulins are shared among all the immunoglobulin classes. That is, IgG, IgM, IgA, IgD and IgE all have either kappa or lambda light chains. The heavy chain (lambda for IgG, µ for IgM and alpha for IgA), however, is class specific. The following summarizes the specificities we offer:1.Polyvalent: react with all classes2.Fc and heavy-chain specific:react with heavy chains only,therefore, they are class specific (i.e. gamma chain specific reactsonly with IgG; µ chain specific reacts only with IgM, etc.)3.Fab and whole molecule (wm) specific:react with heavy andlight chains. Due to the light chain reactivity, they can react with allclasses.4.Light chain (kappa, lambda) specific:react with all classes,since all classes use the same kappa or lambda light chains.1.What form of antibody should be used?Most people prefer affinity isolated antibodies. These products are the most purified, and therefore, give the lowest amount of non-specific binding. However, in certain cases, IgG fractions may be considered. IgG fractions may have the benefit of containing very high affinity antibodies. Affinity isolation may remove some very high affinity antibodies because they bind so tightly to the affinity matrix that they are not eluted. Therefore, IgG fractions may be useful in situations where very high affinity is required, most commonly when the antigen of interest is rare or present in low abundance.2.What kind of label?The label is very application dependent. For immunoblotting and ELISA, enzyme-labeled secondary antibodies are the most popular. Peroxidase is economical, rapid and a more stable enzyme, in general, than alkaline phosphatase. Also, It has become very popular for use in chemiluminescent detection systems. Alkaline phosphatase on the other hand is considered more sensitive than peroxidase particularly when colorimetric detection is used. For cell or tissue staining, alkaline phosphatase, peroxidase or fluorescent secondary antibodies may be used for cytochemistry or histochemistry.Secondary antibodies labeled with a fluorochrome (FITC, phycoerythrin, and Quantum Red) may be used for flow cytometry.To generate increased amplification, a two-step biotin/avidin system may be used. Biotin binds with very high affinity to avidin resulting in an essentially irreversible interaction. A biotinylated secondary antibody is applied first, then avidin, ExtrAvidin. or streptavidin conjugated to an enzyme or fluorochrome binds to multiple sites on the biotinylated secondary antibody, thus amplifying the signal and resulting in greater sensitivity than that achieved with an antibody-enzyme or antibody-fluorochrome conjugate alone.3.Is there an appropriate adsorbed secondary antibody available?If working with human tissues, cells or proteins, choose a secondary antibody that has been adsorbed with human serum or human IgG. If working with bovine tissues, cells or proteins, choose a product that has been adsorbed with bovine serum or bovine IgG, etc. Using these products will reduce non-specific background4.Is a F(ab )2 fragment product necessary?If working with tissues or cells that have Fc receptors (thymus, spleen, blood, leukocytes, B cells etc.), choose an F(ab )2 fragment when possible to eliminate non-specific binding through Fc receptors present on cells.Alternatively, Fc receptors can be blocked. Perform an absorption step, using purified IgG from the host species of the your secondary antibody. In that case an F(ab)2 secondary antibody may not be necessary.5.If all else is equal, decide based on price/titer and availability.。
二抗广义上是指专门和一抗进行特异性反应和结合的抗体，在免疫学反应中，经常需要针对试验选择不同的二抗，艾美捷能为您的科研工作提供最适合和最全面的二抗产品。
检测任何目的靶蛋白都有不止一种抗体可供选择，同时在后继试验中也会有不同的检测方案，因此在选择二抗的时候要综合考虑一抗的类型及后继检测方案的要求，一般来说，选择合适的二抗需要从下面几个方面考虑：【一抗的种属来源】二抗应选用与使用的一抗相同的物种来源，例如：如果你的一抗是小鼠源的单克隆抗体，二抗则选抗小鼠的二抗（山羊抗小鼠或者兔抗小鼠等均可）；如果一抗是从兔血清里制备的兔源多克隆抗体，则相应的二抗需要选择抗兔的二抗。
即根据一抗的物种来源选择相应的抗该物种的二抗。
艾美捷能为您提供最全的抗不同种属的原装进口二抗，包括抗小鼠、大鼠、兔、山羊、绵羊、人、豚鼠、猪、马、牛、鸡、鸭等二抗。
【一抗的类别亚型】二抗需与一抗的类别或亚类相匹配。
这通常是针对单克隆抗体而言。
多克隆抗体主要是IgG类免疫球蛋白，因此相应的二抗就是抗IgG抗体。
其中单克隆抗体的类别及亚类通常会在产品说明书中都会有描述，如果你的一抗是小鼠IgM，那么相应的二抗就应当是抗小鼠IgM。
如果单克隆一抗是小鼠IgG的某一亚类（IgG1，IgG2a，IgG2b，IgG3），那么几乎所有的抗小鼠IgG都可以与之结合，或者你也可以选择专门针对这一亚类的二抗，例如，如果你的一抗是小鼠IgG1，那么你可以选择抗IgG1的二抗，此种抗体在双标记实验中尤其适合。
在不清楚一抗为何种类/亚类的情况下，可以选用抗相应物种IgG。
艾美捷能为您提供通用的IgG（H+L）二抗，或者特异性只结合IgM的Anti IgM （mu）Antibody、IgA的Anti IgA （alpha-Antibody、IgE的Anti IgE （epsilon）Antibody等。
【二抗的种属来源】一般来说，不同的种属来源与二抗的质量没有必然的联系，来源于山羊的二抗与来源于驴的二抗在一般的实验里没有太多的差别。
如何选择荧光二抗如何选择二抗--根据一抗种属及类型选择合适的二抗二抗广义上是指专门和一抗进行特异性反应和结合的抗体，在免疫学反应中，经常需要针对试验选择不同的二抗，检测任何目的靶蛋白都有不止一种抗体可供选择，同时在后继试验中也会有不同的检测方案，因此在选择二抗的时候要综合考虑一抗的类型及后继检测方案的要求，一般来说，选择合适的二抗需要从下面几个方面考虑：【一抗的种属来源】二抗应选用与使用的一抗相同的物种来源，例如：如果你的一抗是小鼠源的单克隆抗体，二抗则选抗小鼠的二抗（山羊抗小鼠或者兔抗小鼠等均可）；如果一抗是从兔血清里制备的兔源多克隆抗体，则相应的二抗需要选择抗兔的二抗。
即根据一抗的物种来源选择相应的抗该物种的二抗。
抗不同种属的原装进口二抗，包括抗小鼠、大鼠、兔、山羊、绵羊、人、豚鼠、猪、马、牛、鸡、鸭等二抗。
【一抗的类别亚型】二抗需与一抗的类别或亚类相匹配。
这通常是针对单克隆抗体而言。
多克隆抗体主要是IgG类免疫球蛋白，因此相应的二抗就是抗IgG抗体。
其中单克隆抗体的类别及亚类通常会在产品说明书中都会有描述，如果你的一抗是小鼠IgM，那么相应的二抗就应当是抗小鼠IgM。
如果单克隆一抗是小鼠IgG的某一亚类（IgG1，IgG2a，IgG2b，IgG3），那么几乎所有的抗小鼠IgG都可以与之结合，或者你也可以选择专门针对这一亚类的二抗，例如，如果你的一抗是小鼠IgG1，那么你可以选择抗IgG1的二抗，此种抗体在双标记实验中尤其适合。
在不清楚一抗为何种类/亚类的情况下，可以选用抗相应物种IgG。
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【二抗的种属来源】一般来说，不同的种属来源与二抗的质量没有必然的联系，来源于山羊的二抗与来源于驴的二抗在一般的实验里没有太多的差别。
Nrf2对肝纤维化过程中炎症细胞的影响王维昊;林森;王洪波;王红娟;许伟华【摘要】目的:探索在四氯化碳诱导小鼠肝纤维化形成过程中,核因子相关因子2(Nrf2)对炎症细胞浸润的影响.方法:野生鼠和Nrf2基因敲除鼠各24只,分别随机平均分成对照组和模型组.HE染色、Masson三色染色观察肝组织病理学变化及肝脏纤维化程度;天狼星红染色观察胶原沉积情况;免疫组化方法检测肝组织中中性粒细胞浸润(Ly6-G阳性)情况;免疫荧光方法检测巨噬细胞浸润及活化(ER-MP23阳性)情况.结果:两个对照组均未有肝纤维化表现;基因敲除模型组小鼠肝组织坏死及纤维化程度重于野生模型组,胶原含量更多(P＜0.05).四氯化碳诱导可增强肝组织中中性粒细胞的浸润,但基因敲除鼠中性粒细胞浸润轻于野生模型鼠(P＜0.05).Nrf2基因敲除和四氯化碳诱导均增强肝组织中巨噬细胞的活化,两者具有协同效应(P＜0.05).结论:Nr2可以通过抑制巨噬细胞活化抑制四氯化碳诱导的肝纤维化发展.【期刊名称】《郑州大学学报（医学版）》【年(卷),期】2016(051)003【总页数】5页(P337-341)【关键词】核因子相关因子2;中性粒细胞;巨噬细胞;肝纤维化;小鼠【作者】王维昊;林森;王洪波;王红娟;许伟华【作者单位】山东大学第二医院消化内科济南250033;山东大学第二医院消化内科济南250033;山东大学第二医院消化内科济南250033;山东大学第二医院消化内科济南250033;山东大学第二医院消化内科济南250033【正文语种】中文【中图分类】R575.2肝纤维化是绝大部分慢性肝病发展到肝硬化的必经过程，其发生机制主要是肝脏损伤因素持续存在(如酒精、病毒、药物等)，引起肝细胞变性坏死、炎症细胞浸润，继而使肝内纤维结缔组织异常增生。
各种原因导致的肝纤维化病程进展中都伴有不同程度的氧化应激，持续的氧化应激可以加重肝细胞损伤、促进炎症介质及细胞因子的释放、促进肝星状细胞的活化，加速肝纤维化的进程[1]。
宿主物种丨Jackson告诉你选择二抗的注意事项蛋白质印迹实验中二抗的选择是非常重要的。
那么接下来就一起来看Jackson ImmunoResearch公司选择二抗的相关注意事项吧~ 宿主物种的相容性如果使用多种二抗，例如探测两种一抗，请选择相同的宿主物种以尽量减少任何交叉反应。
如果这不可能，则选择与实验中其他二抗的宿主物种交叉吸附的二抗。
交叉反应物种虽然在蛋白质印迹中不常见，但某些应用需要针对其他物种吸附的二抗，以尽量减少对内源性免疫球蛋白的识别（例如用抗大鼠一抗探测小鼠组织裂解物）或其他一抗。
因此，请选择可用于预期应用的具有适当交叉吸附的二抗宿主。
经验或偏好宿主物种的选择通常归结为个人偏好或先前的实验验证。
在不同宿主物种中产生的二抗之间似乎几乎没有质量差异，只是某些物种更适合大规模生产。
特异性选择具有正确特异性的二抗很重要。
尽管全 IgG (H+L) 适用于大多数免疫测定，但其他专业特异性允许设计更复杂的实验，以消除不必要检测的潜在干扰。
抗 IgG (H+L)Jackson ImmunoResearch 公司抗 IgG (H+L)与 IgG 分子的重链和轻链都发生反应，即与 IgG 的 Fc 和 F(ab')2 / Fab 区发生反应（图 1）。
抗 IgG (H+L) 抗体也与其他免疫球蛋白类别（IgM、IgA、IgD、IgE）和亚类发生反应，因为它们都共享相同的轻链（kappa 或 lambda）。
抗 IgG (H+L) 抗体比抗片段特异性抗体具有更广泛的表位识别。
它们也被建议用于所有一般的免疫检测程序。
同种型特异性：Fc 特异性抗体大多数一抗是 IgG 同种型。
有时根据抗体的产生方式使用其他类别，例如 IgM 和 IgA。
对免疫球蛋白的 Fc 域特异的二抗将特异于该特定 Fc 域的同种型。
因此，Fcγ特异性抗体将对IgG特异性，而对Fcα特异性的抗体将特异性检测IgA，而Fcμ将检测IgM。
二抗的名词解释二抗，是指对抗生素的耐药性产生的第二种抗菌药物选择。
由于抗生素滥用和不正确的使用，许多细菌已经逐渐产生了对一线抗生素的抗药性。
为了对抗这种抗药性，医生们开始使用二抗来治疗感染病例。
本文将对二抗的定义、使用范围和发展趋势进行探讨。
一、二抗的定义二抗是指存在于抗生素第一代和第三代之间的一类抗菌剂。
与一线抗生素相比，二抗通常具有更广谱的杀菌作用，并可以抵抗一线抗生素无法消灭的耐药菌。
二抗根据化学结构和作用机制的不同，分为多个类别，包括氨基糖苷类、喹诺酮类、大环内酯类、硝基咪唑类等。
二、二抗的使用范围二抗主要被用于治疗因为广谱抗生素无法有效清除耐药菌引起的感染。
这些耐药菌包括MRSA（耐甲氧西林金黄色葡萄球菌）、VRE（耐万古霉素肠球菌）等等。
由于这些耐药菌已经对一线抗生素产生了抵抗能力，二抗成为了处理这些感染的重要药物。
三、二抗的发展趋势随着耐药菌的不断产生，二抗也在不断的创新和发展。
其中，抗菌肽类药物被认为是未来二抗发展的重要方向之一。
抗菌肽具有独特的杀菌机制，可以破坏细菌细胞膜和细胞壁，从而有效杀死细菌。
由于抗菌肽作用靶点的独特性，它们能够对抗耐药的细菌，并且在治疗某些耐药菌感染的效果已经被证明是非常有效的。
此外，融合抗生素也是二抗研究中的一项重要领域。
融合抗生素是通过将两种或多种不同的抗生素结构融合在一起，形成新的药物分子。
这种新型药物可以同时具有几种不同抗生素的特点，从而在杀菌谱和抗药性方面具有更高的效果。
虽然融合抗生素的研发仍处于起步阶段，但已经显示出很大的潜力。
综上所述，二抗作为对抗抗生素耐药性的重要药物类别，在医学领域扮演着重要的角色。
随着耐药菌的不断演变和抗生素的不断研发，二抗的发展也将不断深入。
未来，我们可以期待更多新的二抗出现，为治疗细菌感染带来更好的效果。
Jackson ImmunoResearch 公司二抗选用指南(此部分内容来源于Jackson ImmunoResearch Laboratories Inc网站，如有疑问，请参考原网站）亲和层析法纯化的二抗用亲和层析法纯化的抗体是指，利用耦联到琼脂糖凝胶上的抗原将抗血清中的抗体亲和层析下来。
我们采用一种特有的连续的洗脱过程将抗体从固态抗原上分离出来。
我们提供的未标记的亲和层析法纯化的抗体是不含有稳定剂和防腐剂的无菌液体。
耦联标记物的抗体是冻干粉，里面含有稳定剂和防腐剂，但是过氧化物酶标记的抗体里面不含防腐剂。
亲和层析纯化抗体的选择和定位第一步：选择Whole IgG、F(ab’)2片段，或者Fab片段抗体。
我们提供三种亲和纯化的二抗：Whole IgG，F(ab’)2片段，Fab片段。
Whole IgG抗体是从抗血清中分离出来的完整的分子。
这些抗体有一个Fc部分和两个与抗原结合的Fab部分，因此是二价的（图1）。
它的平均分子量约为160KD，Whole IgG抗体适用于多数情况，也是性价比最高的。
F(ab’)2片段抗体是用胃蛋白酶消化IgG去除Fc部分，剩下两个靠二硫键连接的结合抗原的Fab部分，依然是二价的。
（图1）这抗体用在特定的情况中，例如避免抗体与Protain A 或G结合，或者与有Fc受体的活细胞结合。
但是，如果一抗是wholeIgG，不管二抗是哪种形式都可能出现结合Fc受体。
这时，为了阻止抗体结合到Fc受体上，可以在4度将细胞预培养于含有叠氮钠和二抗来源物种正常血清的缓冲液中。
注意：当使用的是带标记的二抗时，千万不能用一抗来源物种的正常血清和IgG来封闭。
如果血清中的免疫球蛋白非特异性的结合到样品上，他们会被带有标记的二抗识别，导致背景过高。
牛血清白蛋白（BSA）和奶粉是最为常用的封闭液，它们可能含有IgG, 除了牛抗羊IgG外，许多二抗如抗牛，抗山羊，抗绵羊与牛IgG有较强的反应。
因此，使用BSA或奶粉封闭或稀释抗体会增加背景或降低抗体效价。
推荐用来自二抗的物种的正常血清（5% v/v）封闭。
Fab片段抗体是用木瓜蛋白酶消化IgG后得到的。
这些抗体只含有一个结合位点（图1）。
它们用来封闭内源性的免疫球蛋白，或者在使用相同物种来源的一抗作多标记的实验中，用于封闭暴露的免疫球蛋白。
而二价的抗体（whole IgG 或F（ab’）2片段）不能用来封闭，因为它们有二个结合位点。
封闭后，一些结合位点可能为暴露出来，与一抗结合，从而导致高的背景或假阳性标记。
第二步：在左边标记“antibody description”的拦里找到一抗的物种来源。
抗体是根据一抗的物种来源的字母表顺序排列。
比如，如果一抗是小鼠来源的，就找“anti-mouse”。
说明：目录中提供了抗叙利亚仓鼠和抗亚美尼亚仓鼠的抗体。
为了正确的选择二抗，必须知道一抗是在哪种仓鼠中制备的。
第三步：在标有“Host”这一栏中选择二抗的物种来源。
二抗的物种来源在抗体描述的开始部分，选择二抗的物种来源应考虑几点: 1) 个人的取向或经验。
二抗的质量问题与物种特异性没有关系。
2）与蛋白A和蛋白G结合。
兔抗体能很好地与蛋白A和蛋白G结合，但羊和猴抗体能更好的与蛋白G结合。
3）经物种吸附处理的抗体可用性。
某些物种来源的抗体可能不能被具有交叉反应的物种进行吸附处理。
选择经过吸附处理的物种。
4）物种兼容性。
在多标记实验中，一些物种不能和其他物种兼容。
一般地，多标记二抗必须来自同一物种。
第四步：在“antibody description”下面选择二抗的特异性。
下面词语的解释将对选择合适的抗体有所帮助。
注意：不同来源的免疫球蛋白含有相似的结构，抗体的生成过程也相似。
抗一个物种的抗体可能与其他物种发生交叉反应，除非特异性的经过交叉反应物种的吸附处理。
在抗体描述中，经过其他物种的吸附处理的抗体标有“(min X …Sr Prot)”字样。
Anti-IgG (H+L)这类抗体和IgG分子的重链和轻链都可以反应，比如，和IgG分子的Fc，F(ab’)2/Fab部分。
Anti-IgG (H+L)抗体也可以和其他的免疫球蛋白家族（IgM，IgA，IgD,IgE）和亚家族反应，因为所有的免疫球蛋白都有相同的轻链（或者κ链，或者λ链）。
Anti-IgG (H+L)抗体比只抗片段的抗体识别更多的抗原表位，适合普通的免疫检查过程。
Anti-IgG，Fc/ Fcγfragment specific这类抗体和IgG重链的Fc部分反应。
它们通过ELISA检测，和/或针对Fab片段吸附测试。
某些情况下，这类抗体需要额外检测和/或吸收处理来降低IgM和或IgA的交叉反应。
在这种情况下（抗人，抗鼠和抗大鼠），抗体标有“抗IgG（Fcγ）”，表示这类抗体只与IgG重链反应，通常不能和IgA或IgM任何表位反应。
注意：不是所有anti-IgG, Fc抗体和所有亚型的IgG反应能力一致。
要找和四种IgG亚类反应能力差不多的抗鼠IgG, Fcγ抗体的话，应当选羊抗鼠IgG(亚类1+2a+2b+3), Fcγ特异性片段(min X Hu,Bov,Rb Sr Prot)。
Anti-IgG，F(ab’)2 fragment specific这类抗体和IgG的F(ab’)2/Fab部分反应。
它们经过了ELISA和/或Fc片段的吸附检测。
它们不是特异性IgG，因为它们是和轻链反应的，它们同时也和具有相同轻链的其他种类的免疫球蛋白（Ig D, IgM, IgA和IgE）和亚类反应。
(min X…Sr Prot)与一个物种反应的二抗可能与其他物种发生交叉反应，除非这类抗体经过其他物种的吸收实验。
这类抗体经过了检测，以及针对IgG和圆括号中的物种的血清蛋白的吸附处理。
（标有“(min X…Prot)”字样的抗体是经过了圆括号中所标的物种的IgG和/或血清蛋白的吸附处理的）。
当其他物种免疫球蛋白的出现可能导致交叉反应时，推荐使用这类抗体。
但是，当要选择经过针对相近物种吸附处理的抗体时，要特别注意，因为它们能识别的表位数量大大减小了，可能识别单抗的能力很弱。
例如，在含有内源性免疫球蛋白的大鼠的组织样本中，只用经大鼠IgG吸附处理的抗鼠IgG检测大鼠组织中的鼠源一抗，或者在多标记实验中使用了大鼠的一抗。
另个一个例子是抗大鼠IgG(min X Mouse… Sr Prot) 和抗叙利亚仓鼠IgG（min X….Mouse, Rat Sr Prot）。
以下是圆括号中所使用的一些简称：Bov = BovineCk = ChickenGt = GoatGP = Guinea PigSy Hms = Syrian HamsterHrs = HorseHu = HumanMs = MouseRb = RabbitShp = SheepSw = SwineSr = SerumProt = Protein.ML （Multiple Labeling）有些抗体标明了“ML”，来强调它们除了可以用于单标，还可用于多标记实验。
抗亚美尼亚仓鼠IgG和抗叙利亚仓鼠IgG大部分仓鼠单克隆抗体是来原于亚美尼亚仓鼠的脾脏细胞和鼠骨髓瘤细胞的杂交瘤细胞，它是亚美尼亚（而不是叙利亚）仓鼠IgG.许多商业化的多克隆抗仓鼠IgG是抗叙利亚仓鼠IgG,这种抗体在检测亚美尼亚仓鼠IgG单克隆抗体时，它的效果没有抗亚美尼亚仓鼠IgG好。
注意：抗亚美尼亚仓鼠IgG(H+L)(min X Bov, Hu, Ms, Rb, Rat Sr Prot)不能识别所有的亚美尼亚仓鼠单克隆抗体，因为它经相近物种的吸附处理过（粗体字）。
因此，使用经过少数物种或少数相近物种的吸附处理过的抗体可达到较好的效果，如抗亚美尼亚仓鼠IgG(H+L)(min X BoV Sr Prot), 除此之外，在小鼠或大鼠免疫球蛋白中也应该检测亚美尼亚仓鼠单抗。
第五步：从表格顶部选择需要的探针。
关于探针的技术信息参考其他网页。
第六步：在antibody description一行和探针栏相交处，找到选择的抗体的价钱、规格和目录号。
每个方格顶部的数字是每单位的价钱，底部的9位数字为目录号。
第七步：以定购目的查看产品说明为了避免错误，产品说明应该遵循一个特定的语法排列。
比如，目录号为115－096－072的产品应当描述为：FITC-conjugated| AffiniPure|F(ab')2 fragment|of Goat|Anti-Mouse|IgG, F(ab')2 fragment specific|A B C D E F(minimal cross-reactivity to human, bovine, and horse serum proteins)|GA.耦联的探针说明，如荧光素，酶，生物素等。
如果抗体没有耦联，不用写。
B.抗体纯化是商标名字，是指从抗血清中通过偶联琼脂糖的抗原免疫层析的方法分离得到的抗体。
C．抗体的形式－完整IgG, 或者F(ab’)2、Fab片段。
D.抗体来源物种名称。
E．和该抗体反应的物种名称。
F.抗体特异性描述。
G.经过吸附处理以后减小了交叉反应的物种名称。
