Jackson ImmunoResearch 公司二抗选用指南

ISS N 100727626C N 1123870ΠQ中国生物化学与分子生物学报Chinese Journal of Biochemistry and M olecular Biology2005年4月21(2):282～286・研究简报・生长激素信号肽可诱导重组蛋白外分泌表达张志谦3,　李金萍,　胡　颖(北京大学临床肿瘤学院暨北京市肿瘤防治研究所,北京　100034)Secretion of R ecombinant Proteins in Mammalian Cells Directedby G row th H ormone Signal PeptideZH ANG Zhi 2Qian 3,LI Jin 2Ping ,H U Y ing(Department o f Cell Biology ,Peking Univer sity School o f Oncology ,Beijing Institute for Cancer Research ,Beijing 100034,China )Abstract Signal peptide capable of efficiently directing many protein secretion in mammalian cells is one ofthe key elements in recombinant protein production ,gene therapy and the development of DNA vaccines.In order to explore the possibility of rat growth horm one signal peptide as such an element ,a new vector based on the mammalian expression vector pcDNA3was constructed by em ploying rat growth horm one (rG H )signal peptide as leading sequence ,followed by multiple cloning sites ,the myc epitope 2tag and 6×his purification tag in the expression cassette.The vector was validated by success fully expressing and secretion of chick M MP 22C 2terminal PEX domain ,a potential angiogenesis inhibitor ,and tandem peptide repeats of myc epitope 2tag in C OS 27cells.These results suggest that rat growth horm one signal peptide is effective in the mediation of recombinant protein expression and secretion ,and this vector provides a new tool for universal cloning and secretion of ex ogenous proteins in mammalian cells.K ey w ords rat growth horm one ,signal peptide ,secretion vector ,mammalian cell中图分类号　R392收稿日期:2004210222,接收日期:2004212221国家自然科学基金(N o.30270658)、北京市自然科学基金(N o.7002009)、北京市肿瘤分子生物学高技术实验室、人事部留学回国人学重点项目、教育部留学回国人员启动基金、中华医学基金专项人才基金项目3联系人T el :010*********,E 2mail :zqzhang @Received :October 22,2004;Accepted :December 21,2004Supported by National Natural Science F oundation of China (N o.30270658),Natural Science F oundation of Beijing Municipal (N o.7002009),Beijing K ey High 2T echnology Laboratory of Cancer M olecular Biology ,and Chinese M edical Board F oundation3C orresponding author T el :86210266179250E 2mail :zqzhang @ 重组蛋白质的表达是生物医药开发、基因功能和作用机理研究中关键技术环节.虽然细菌表达体系由于表达量大、经济等而被广泛采用,但由于其不能提供许多蛋白质必需的翻译后修饰如糖基化等,所表达的蛋白又多以不可溶包涵体形式存在,变性复性过程复杂,产率低,因此真核细胞表达体系如CH O 、C OS 等成为活性要求高的蛋白质表达的首选[1].重组蛋白质在CH O 、C OS 等真核细胞的表达多需要由信号肽引导分泌至细胞培养基内.信号肽由15～30个疏水性氨基酸组成,位于表达蛋白的N 末端,在蛋白质表达过程中介导与粗面内质网的蛋白质翻译复合体作用,进一步转运入高尔基氏体的管腔.在转运过程中,该前导肽序列被肽酶水解切割释放,蛋白质完成糖基化和其它的翻译后修饰.如所表达的蛋白不具有跨膜结构域,则可以从细胞分泌至细胞外的培养基内[2,3].哺乳类细胞表达重组蛋白虽然从活性角度讲具有优势,但产量很低,在医药领域的大规模应用受到极大限制.目前主要从提高基因表达的量、信号肽顺序的优化、利用蛋白酶缺陷细胞系避免蛋白质的降解、宿主细胞改造适合高密度悬浮培养以及培养条件的优化等方面进行改进以提高产量和分泌的效率[4].小鼠IgG κ链[5]、前胰蛋白酶原[6]、红细胞生成素[7]、降钙素前体的前导肽序列[8]已被尝试用于重组蛋白质在哺乳类细胞的分泌表达,但实际表达过程中不同的蛋白分泌量具有较大差异.由于信号肽位于蛋白质的N 末端,其实际还决定着蛋白质的翻译起始,不同的信号肽一级结构可能还影响着蛋白质的折叠、细胞内的转运和分泌的效率[9],因此具有相对实用性广和可高效率引导蛋白质表达分泌信号肽的筛选是该领域有待解决的关键问题之一.我们推测在体液内存在的蛋白质或肽如各种激素、细胞因子的信号肽可能在诱导蛋白质的分泌表达方面具有优势.本文利用大鼠生长激素的信号肽尝试表达鸡M MP22C末端PEX片段,建立了以大鼠生长激素信号肽为前导肽、具有纯化标签的哺乳类细胞重组蛋白质分泌表达载体.1　材料和方法111　细胞、菌种和试剂中国仓鼠卵巢细胞C OS27细胞来源于美国AT CC,本室保存.所用限制性内切酶、Vent耐热DNA 聚合酶购自美国New England Biolabs;T4DNA聚合酶购自Promega公司.细胞培养基及血清均购自GI BC O/BR L公司.所用其它试剂除特别注明外均购自Sigma公司.112　大鼠生长激素信号肽RT2PCR扩增及载体构建用RT2PCR分别从大鼠脑垂体和11日龄鸡胚胎扩增大鼠生长激素(rG H)信号肽序列和鸡M MP22 C末端片段PEX序列.大鼠生长激素引物:正义:5’2 GG CAAG CTT(Hin dⅢ)AC AG AT C ACTG AG TGG23′、反义:5′2AG AGG AT CCT(Bam HⅠ)GG AC AAGGG C ATG2 3’;鸡M MP22C末端PEX引物:正义:5’2CGG AT CC (Bam HⅠ)T CTG C AAG C ACG23’,反义:5’2CCT CT AG A (XbaⅠ)G C AAG T CCT CTT C AG AAAT C AG TTTTTGCT CG AG(XhoⅠ)G C AACCC AACC AG T C.大鼠生长激素信号肽与PEX的PCR产物以约等分子比混合作为模板,以rG H的正义引物和PEX的反义引物PCR扩增使rG H信号肽与PEX相连接,再以该产物为模板用rG H的正义引物和引物5’2CTGGG CCC(ApaⅠ) T AATG ATG ATG ATG ATG ATGT CT AG A(XbaⅠ)C AAG T CCT CTT C AG23’在融合蛋白的C端PCR加上Myc抗原标签和6×His纯化标签的编码序列,Hin dⅢ与ApaⅠ酶切后,T4DNA聚合酶连接装入相应酶切的真核表达载体pcDNA310(美国Invitrogen公司产品).转化大肠杆菌DH5α,取酶解鉴定正确的克隆测序确认,用T ip2500(Qiagen公司产品)大量提取和纯化质粒备用.113　细胞培养、基因转染C OS27细胞常规生长在生长培养基(含10%胎牛血清的ME M),基因转染采用Lipofectamine (GI BC OΠBR L),按照厂家使用说明书进行.114　免疫荧光染色生长在盖片上的细胞经2%甲醛ΠP BS固定3 min,0.5%T riton X2100ΠP BS抽提3次,每次10min.与一抗鼠抗Myc10肽抗原标签单抗9E10细胞培养上清(1∶10稀释)(购自美国宾夕法尼亚大学细胞中心)37℃反应1h,0.5%T riton X2100ΠP BS洗涤3次,每次10min,与二抗罗丹明标记的山羊抗小鼠抗体(Jacks on ImmunoResearch Laboratories)37℃温育1h, 0.5%T riton X2100ΠP BS洗涤,封片,Olym pus BH22落射荧光显微镜观察,K odak T max2400胶卷照相.115　Western杂交分析细胞培养上清变性后经12%S DS2PAGE分离,电转移至PVDF膜(Milipore).5%脱脂奶粉ΠTT BS室温封闭1h,TT BS洗膜,一抗鼠抗Myc10肽抗原标签单抗9E10细胞培养上清(1∶1000稀释)作用1h, TT BS洗膜,二抗HRP标记的山羊抗小鼠抗体(1∶80000稀释)(Jacks on ImmunoResearch Laboratories)室温孵育1h,TT BS洗膜后,加入EC L化学发光试剂(Amersham公司),曝光,冲片.2　结果211　大鼠生长激素信号肽能改变重组蛋白的细胞内分布将PEX与pMyc2N融合构建MycPEX/pcDNA3载体,转染C OS27细胞,分别于转染后24h、48h利用Myc抗原决定基标签肽抗体9E10进行免疫荧光染色,结果在细胞质内可见大量大小不等、数量差异的聚集物(Fig.1),提示该蛋白在细胞内不可溶,斑块大小、数量与转染后的时间无关.选用人胃腺癌细胞MG C2803得到相同结果(结果未显示),说明不可溶性团块的形成与细胞类型无关.将PEX的N段通过DNA重组换为大鼠生长激素信号肽,免疫荧光结果显示PEX在核周呈帽状聚集分布,大小较为均匀,与高尔基氏体的细胞亚单位定位相一致,具备分泌蛋白的典型细胞亚区分布特征.提示大鼠生长激素信号肽可诱导外源重组蛋白进入细胞内分泌蛋白的加工、转运途径.212　大鼠生长激素信号肽可成功诱导重组蛋白分泌到细胞培养基取基因瞬时转染后48h的C OS27细胞的培养基,S DS2PAGE后,用Myc抗体进行Western杂交分析,结果如Fig.2所示.rG HPEX mycHisΠpcDNA培养基382第2期张志谦等:生长激素信号肽可诱导重组蛋白外分泌表达　Fig.1　Immunofluorescent staining of M yc/PEX to dem onstrate the localization of expressed PEX in trans fected COS27cells(A)M ycPEXΠpcDNA3;(B)rG HPEX/pcDNA3.Bar:20μm15μl用Myc抗体即可检测到约26kD的阳性条带,与理论推导的PEX分泌蛋白的分子量吻合.不带信号肽的MycPEXΠpcDNA和空载体转染的培养基内均未检测到条带.这提示大鼠生长激素信号肽可诱导外源重组蛋白分泌到细胞外,同时改变蛋白的可溶性. 213　带有大鼠生长激素信号肽、Myc抗原以及6×H is纯化标签载体的建立和验证为使该载体适用于多数基因的克隆和表达,我Fig.2　W estern blot analysis of COS2culture supernatants48hours aftertransient trans fection probed with M yc antibody1.rG HPEX mycHisΠpcDNA;2.E.coli expressed PEX as positive control;3.M ycPEXΠpcDNA without signal peptide们将PEX序列置换成多克隆位点,构建成大鼠生长激素信号肽诱导的具有外分泌功能的真核细胞表达载体prG HSecmycHis(Fig.3).将Myc标签的十肽串重重复序列(含有多个Myc标签的十肽,构建过程将另文发表)用常规重组技术构建入prG HSecmycHis载体,使阅读框架吻合.基因瞬时转染C OS27细胞,Western杂交成功检测到转染48h后培养基内预期分子量的Myc标签十肽的串重重复序列重组蛋白(Fig.4),证明该载体亦可用于其它外源蛋白的真核细胞外分泌表达.Fig.3　Multiple cloning sequence of the eukary otic secretion expression vector prG HSecmycHisT o construct prG HSecmycHis,this sequence replaced the multiple cloning sites between Hin dⅢand ApaⅠof pcDNA3.Arrow:signal peptide cleavage site482中国生物化学与分子生物学报21卷Fig.4　W estern blot result of(M yc)nΠprG HSecmycHis trans fected COS27 culture medium probed with9E10M yc antibodyFifteen m icroliters of culture supernatants were loaded in each lane.1.untrans fected cell supernatants;2.(M yc)nΠprG HSecmycHis trans fected cell supernatants3　讨论许多分泌蛋白质具有其特有的信号肽序列,一些分泌性细胞因子有时可具有相同的信号肽序列.信号肽在体内分泌型蛋白质的成熟过程中十分重要,近年来发现其亦可使本不具有分泌功能的蛋白质或短肽分泌到细胞外[5,8],并具有生物活性,这一策略在生物医药工程中的应用价值日益引起人们的重视并得到广泛应用.然而,一种信号肽能否成功引导蛋白质的高效表达和分泌,受许多因素影响,具体调控机制不清,Li等人的工作提示含有较多阳性氨基酸的信号肽可能不利于蛋白质的分泌表达[9].我们感兴趣的是不同的信号肽在诱导同一种蛋白的表达和分泌上是否具有相同的效应,希望最终筛选到具有相对广泛适用性的信号肽.作为该工作目标的第一步,本工作初步研究结果发现,大鼠生长激素信号肽作为前导肽序列,可以分别将鸡源M MP22的C 末端片段PEX以及Myc标签十肽串重复序列分泌到细胞培养基中.氨基酸顺序分析表明,大鼠生长激素信号肽不含有任何带正电荷氨基酸,其一级结构特点符合文献报道的具高效率分泌功能的信号肽的特性,表明以其作为真核细胞外分泌表达载体中的前导肽序列是可行的.初步研究结果表明,在分泌的表达量上,该信号肽高于人干扰素信号肽,与lgGκ链等已知信号肽的比较需要进一步的工作.PEX是近年来发现具有抗肿瘤血管发生的由M MP22降解产生的内源性因子[10,11],PEX在细菌表达体系里以不可溶包涵体形式存在[10],变性复性过程复杂,产率也比较低.当不用信号肽以哺乳类细胞C OS27表达时,表达蛋白也以细胞内聚积体形式存在,亦提示高度不可溶,这使得获得大量具有活性的PEX相对较为困难.大鼠生长激素信号肽在诱导PEX进入蛋白质分泌途径时,可以对蛋白质进行诸如糖基化等修饰,以可溶形式分泌到细胞培养基中,使蛋白既容易保留其原来的自然状态和活性,下游的纯化又可容易进行.由于所构建的载体含有6×His纯化标签,当要表达的蛋白与其形成融合蛋白时可以利用Ni2NT A亲和柱进行纯化.我们已成功利用其从转染的细胞培养基中纯化到表达分泌的PEX (未发表结果).在所构建的表达分泌载体prG HSecmycHis的Myc抗原决定基标签、6×His标签前后均有常用内切酶位点,在构建过程中可以根据实验目的和需要很容易对标签肽随意选择,有利于重组过程. PcDNA3是应用较为广泛的真核细胞表达载体, prG HSecmycHis构建以其作为骨架,继承了该载体已有特点,如以C MV为启动子、含有S V40复制子(可以在含S V40大T抗原的细胞如C OS27多拷贝复制)和Neomycin筛选标志等.这些特点使prG HSecmycHis 在核酸疫苗载体开发、基因治疗、蛋白质表达等领域有广阔的应用前景.参考文献(R eferences)1　Y an S C B,G rinnell W,W old F.P ost2translational m odifications of proteins:s ome problems left to s olve.Trends Biol Sci,1989,14:2642　V on Heijne G.Patterns of am ino acids near signal2sequence cleavage sites.Eur J Biochem,1983,133:17～213　Perlman D,Halv orors on H O.A putative signal peptidase recognition site and sequence in eukary otic and prokary otic signal peptides.J Mol Biol, 1983,167:391～4094　Schm idt F R.Recombinant expression systems in the pharmaceutical industry.Applied Microbiol.Biotechnol,2004,65(4):363～3725　C oloma M J,Hastings A,W ims L A,M orris on S L.N ovel vectors for the expression of antibody m olecules using variable regions generated by polymerase chain reaction.J Immunol Methods,1992,152:89～1046　Chubet R G,Brizzard B L.Vectors for expression and secretion of F LAG epitope2tagged proteins in mammalian cells.BioTechniques,1996,20: 136～1417　Herrera A M,Musacchio A,Fernandez J R,Duarte C.E fficiency of erythropoietin’s signal peptide for HIV m m21gp120expression.Biochem Biophys Res Commun,2000,273:557～5598　Liu Y C,K awagishi M,M ikayama T,Inagaki Y,T akeuchi T,Ohashi H.Processing of a fusion protein by endoprotease in COS21cells for secretion of mature peptide by using a chimeric expression vector.Proc Natl Acad Sci USA,1993,90:8957～8961582第2期张志谦等:生长激素信号肽可诱导重组蛋白外分泌表达　9　Li Y,Luo L,Ras ool N,W agner R R,K ang C Y.Viral lipos omes released from insect cells in fected with recombinant baculovirus expressing the matrix protein of vesicular stomatitis virus.J Virol,1993,7:584～588 10　Brooks P C,S illetti S,v on Schalscha T L,Friedlander M,Cheresh D A.Disruption of angiogenesis by PEX,a noncatalytic metalloproteinase fragment with integrin binding activity.Cell,1998,92(3):391～400 11　李金萍,张光谋,柯杨,林本耀,赵威,胡颖,宁涛,林仲翔,张志谦.基质金属蛋白酶22C端片段PEX的原核表达及其对血管发生的抑制作用.生物化学与生物物理进展(Li Jin2Ping,Zhang G uang2M ou,K e Y ang,Lin Ben2Y ao,Zhao W ei,Hu Y ing,Ning T ao,Lin Zhong2X iang,Zhang Zhi2Qian.Prokary otic expression of PEX:a C2 term inal fragment of matrix metalloproteinase2and its effect on the inhibition of angiogenesis.Prog Biochem Biophys),2002,29(1):120～123《中国生物化学与分子生物学报》第五届编辑委员会名单The Fifth Editorial Board of Chinese Journal of Biochemistryand Molecular Biology顾　问(Advisors)郑　集　ZHE NGJi 张昌颖　ZH ANG Chang2Y ing 邹承鲁　Z OU Cheng2Lu(Chen2lu TS OU)主　编(Editor2in2Chief)贾弘 J I A H ong2T i副主编(Associate Editors2in2Chief)昌增益　CH ANG Z eng2Y i李　林　LI Lin尚永丰　SH ANG Y ong2Feng孙志贤　S UN Zhi2X ian王琳芳　W ANGLin2Fang王志珍　W ANG Zhi2Zhen杨福愉　Y ANG Fu2Y u查锡良　ZH A X i2Liang编　委(Members of the Board,alph abetically)昌增益　CH ANG Z eng2Y i陈清西　CHE N Qing2X i耿运琪　GE NG Y un2Qi顾　军　G U Jun杭海英　H ANG Hai2Y ing赫荣乔　HE R ong2Qiao黄　力　H UANGLi贾弘 J I A H ong2T i蒋澄宇　J I ANG Cheng2Y u焦炳华　J I AO Bing2Hua柯　扬　KE Y ang金由辛　J I N Y ou2X in李伯良　LI Bo2Liang李　刚　LI G ang李根喜　LI G en2X i李桂源　LI G ui2Y uan李　林　LI Lin李　宁　LI Ning李载平　LI Z ai2Ping梁爱华　LI ANG Ai2Hua梁宋平　LI ANG S ong2Ping林其谁　LI N Qi2Shui刘德富　LI U De2Fu刘德培　LI U De2Pei刘国琴　LI U G uo2Qin刘进元　LI U Jin2yuan缪时英　MI AO Shi2Y ing彭景 PE NGJing2Pian钱关祥　QI AN G uan2X iang强伯勤　QI ANG Bo2Qin屈良鹄　QU Liang2Hu饶子和　RAO Z i2He施蕴渝　SHI Y un2Y u阮康成　RUAN K ang2Cheng尚永丰　SH ANG Y ong2Feng寿成超　SH OU Cheng2Chao孙志贤　S UN Zhi2X ian王嘉玺　W ANGJia2X i王琳芳　W ANGLin2Fang王志珍　W ANG Zhi2Zhen魏　群　WEI Qun温进坤　WE N Jin2K un许根俊　X U G en2Jun杨福愉　Y ANG Fu2Y u杨克恭　Y ANG K e2G ong杨晓明　Y ANG X iao2M ing药立波　Y AO Li2Bo姚仁杰　Y AO Ren2Jie叶棋浓　YE Qi2N ong袁勤生　Y UAN Qin2Sheng查锡良　ZH A X i2Liang张　今　ZH ANGJin张　蘅　ZH ANG Nai2Heng张旭家　ZH ANG Xu2Jia张　翼　ZH ANG Y i周春燕　ZH OU Chun2Y an周海梦　ZH OU Hai2Meng周筠梅　ZH OU Jun2Mei朱大海　ZH U Da2Hai朱卫国　ZH U Wei2G uo朱玉贤　ZH U Y u2X ian特邀编委(Specially I nvited Members of the Board)吴　瑞　Ray W U(US A)于宽仁　R obert K.Y U(US A)682中国生物化学与分子生物学报21卷。

如何选择二抗抗体简介抗体：是高等动物在抗原物质的刺激下由浆细胞产生的一类能与相应抗原发生特异性结合的免疫球蛋白。

抗体通常存在于血清合淋巴（组织液）中。

单克隆抗体及多克隆抗体：由单一克隆的细胞（通常是单一克隆的杂交瘤细胞）所产生的识别某一抗原表位的单一抗体；多克隆抗体是由多种细胞分别接触相应抗原而产生的多种抗体的总和，多克隆抗体抗原识别抗原的多个表位。

抗体结构：抗体是由四条肽链构成的“Y”形对称的分子，包括两条重链和两条轻链。

在“Y”的尖端部位的氨基酸顺序在不同的抗体分子中差别很大，是负责与抗原进行特异性结合的区域，称为可变区，余下的区域则称为恒定区。

抗体分类抗体分类：根据重链恒定区的血清学类型，可将抗体分为IgM，IgG，IgA，IgD，IgE五类，它们的重链分别为mu, gamma, alpha, delta, epsilon链。

在上述每一类别中，按重链构造上的变异又可分为几个亚类，例如人的IgG可分为IgG1，IgG2，IgG3，IgG4四个亚类。

轻链分为两种类型，kappa链和lambda链，但每种抗体中只存在一种类型的轻链。

二抗：二抗是在其它宿主体内制备的能与一抗或一抗片段结合的抗体，上面通常连有酶或荧光素等标签。

由于二抗所具备的优点使得其在免疫学实验中得以应用广泛，如western blot（通过与特异性抗体结合来鉴定蛋白质），ELISA（以耦联有酶的抗体或抗原为标记来检测特异性的蛋白质，尤其是相应的抗原或抗体），免疫组织化学（检测组织中的特异性抗原），免疫细胞化学（通过免疫学方法检测细胞的抗原组成），流式细胞术（通过检测激光所激发荧光来鉴定分离不同类型的细胞）及免疫沉淀（通过抗原与抗体的特异性结合作用来分离相应抗原）。

二抗针对某一特定物种（如小鼠）的所有抗体均具有特异性，因而使用标记的二抗可以免去对每一个一抗进行标记，大大节省了时间和费用；此外，一个一抗分子可以同时结合几个二抗分子，从而使信号大大增强，提高了实验灵敏度。

·论著·腺苷Ａ３受体激活对肠上皮细胞屏障的调节作用及其机制肖　鹏　吕敏敏　安晓萌　张　霁　司徒伟基　任天华 【摘要】　目的　探讨腺苷Ａ３受体（Ａ３ＡＲ）激活对体外肠上皮细胞屏障的作用及其潜在机制。

方法　使用Ａ３ＡＲ激动剂２ Ｃｌ ＩＢ ＭＥＣＡ处理ＴＮＦ α诱导的Ｃａｃｏ ２细胞损伤模型。

采用跨上皮细胞电阻值（ＴＥＥＲ）法和细胞旁通透性测定法评估体外培养的上皮细胞屏障功能。

采用免疫荧光法和蛋白质印迹法评估紧密连接蛋白ＺＯ １的分布和表达。

采用蛋白质印迹法检测ＮＦ κＢｐ６５、肌球蛋白轻链激酶（ＭＬＣＫ）和磷酸化肌球蛋白轻链（ｐ ＭＬＣ）的表达水平。

采用ＥＬＩＳＡ法检测细胞培养上清液中促炎细胞因子ＩＬ １β、ＩＬ ８的表达水平。

结果　与对照组相比，ＴＮＦ α组ＴＥＥＲ降低，细胞旁通透性增高，ＺＯ １表达水平降低，ＮＦ κＢｐ６５、ＭＬＣＫ、ｐ ＭＬＣ、ＩＬ １β和ＩＬ ８的表达水平均升高，两组的差异均有统计学意义（犘均＜０．０５）。

与ＴＮＦ α组相比，２ Ｃｌ ＩＢ ＭＥＣＡ组ＴＥＥＲ升高，细胞旁通透性降低，ＺＯ １表达水平升高，ＮＦ κＢｐ６５、ＭＬＣＫ、ｐ ＭＬＣ、ＩＬ １β和ＩＬ ８的表达水平均降低，两组的差异均有统计学意义（犘均＜０．０５）。

结论　Ａ３ＡＲ激活可减轻肠上皮细胞屏障损伤，该作用可能通过抑制ＮＦ κＢ／ＭＬＣＫ／ｐＭＬＣ信号通路实现。

【关键词】　腺苷Ａ３受体；肠上皮细胞屏障；紧密连接；核因子 κＢＤＯＩ：１０．３９６９／ｊ．ｉｓｓｎ．１６７３ ５３４Ｘ．２０２１．０６．０１１　基金项目：广东省自然科学基金（２０１８Ａ０３０３１３７７２）；深圳市科技计划项目（ＪＣＹＪ２０１７０３０７１７１５４８５１９）；香港大学深圳医院高水平医院建设科研培育计划（ＨＫＵＳＺＨ２０１９０１０２７）　作者单位：５１８０５３　广东深圳，香港大学深圳医院消化内科（肖鹏、司徒伟基、任天华），中心实验室（吕敏敏、安晓萌、张霁）　通信作者：任天华，Ｅｍａｉｌ：ｒｅｎｔｈ＠ｈｋｕ ｓｚｈ．ｏｒｇ犚犲犵狌犾犪狋犻狅狀狅犳犪犱犲狀狅狊犻狀犲犃３狉犲犮犲狆狋狅狉犪犮狋犻狏犪狋犻狅狀狅狀犻狀狋犲狊狋犻狀犪犾犲狆犻狋犺犲犾犻犪犾犮犲犾犾犫犪狉狉犻犲狉犪狀犱犻狋狊犿犲犮犺犪狀犻狊犿　犡犐犃犗犘犲狀犵，犛犈犜犗犠犪犻犽犪狔，犚犈犖犜犻犪狀犺狌犪．犇犲狆犪狉狋犿犲狀狋狅犳犌犪狊狋狉狅犲狀狋犲狉狅犾狅犵狔，狋犺犲犝狀犻狏犲狉狊犻狋狔狅犳犎狅狀犵犓狅狀犵 犛犺犲狀狕犺犲狀犎狅狊狆犻狋犪犾，犛犺犲狀狕犺犲狀５１８０５３，犆犺犻狀犪；犔犢犝犕犻狀犿犻狀，犃犖犡犻犪狅犿犲狀犵，犣犎犃犖犌犑犻．犇犲狆犪狉狋犿犲狀狋狅犳犆狅狉犲犔犪犫狅狉犪狋狅狉狔，狋犺犲犝狀犻狏犲狉狊犻狋狔狅犳犎狅狀犵犓狅狀犵 犛犺犲狀狕犺犲狀犎狅狊狆犻狋犪犾，犛犺犲狀狕犺犲狀５１８０５３，犆犺犻狀犪【犃犫狊狋狉犪犮狋】　犗犫犼犲犮狋犻狏犲　ＡｎａｔｔｅｍｐｔｉｓｍａｄｅｉｎｔｈｉｓｐａｐｅｒｔｏｉｎｖｅｓｔｉｇａｔｅｔｈｅｅｆｆｅｃｔｏｆａｄｅｎｏｓｉｎｅＡ３ｒｅｃｅｐｔｏｒ（Ａ３ＡＲ）ｏｎｉｎｔｅｓｔｉｎａｌｅｐｉｔｈｅｌｉａｌｂａｒｒｉｅｒ犻狀狏犻狋狉狅ａｎｄｉｔｓｕｎｄｅｒｌｙｉｎｇｍｅｃｈａｎｉｓｍ．犕犲狋犺狅犱狊　ＴｈｅｉｎｊｕｒｅｄｍｏｄｅｌｏｆＣａｃｏ ２ｃｅｌｌｓｉｎｄｕｃｅｄｂｙＴＮＦ αｗａｓｔｒｅａｔｅｄｗｉｔｈＡ３ＡＲａｇｏｎｉｓｔ２ Ｃｌ ＩＢ ＭＥＣＡ．Ｔｈｅｅｐｉｔｈｅｌｉａｌｂａｒｒｉｅｒｆｕｎｃｔｉｏｎ犻狀狏犻狋狉狅ｗａｓｅｖａｌｕａｔｅｄｂｙｔｒａｎｓ ｅｐｉｔｈｅｌｉａｌｅｌｅｃｔｒｉｃｒｅｓｉｓｔａｎｃｅ（ＴＥＥＲ）ａｎｄｐａｒａｃｅｌｌｕｌａｒｐｅｒｍｅａｂｉｌｉｔｙａｓｓａｙ．ＴｈｅｄｉｓｔｒｉｂｕｔｉｏｎａｎｄｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎｏｆｔｉｇｈｔｊｕｎｃｔｉｏｎｐｒｏｔｅｉｎＺＯ １ｗｅｒｅｅｖａｌｕａｔｅｄｂｙｉｍｍｕｎｏｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅａｎｄＷｅｓｔｅｒｎｂｌｏｔｔｉｎｇ．ＷｅｓｔｅｒｎｂｌｏｔｔｉｎｇｗａｓａｌｓｏｕｓｅｄｔｏｄｅｔｅｃｔｔｈｅｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎｏｆＮＦ κＢｐ６５，ｍｙｏｓｉｎｌｉｇｈｔｃｈａｉｎｋｉｎａｓｅ（ＭＬＣＫ）ａｎｄｐｈｏｓｐｈｏｒｙｌａｔｅｄＭＬＣ（ｐ ＭＬＣ）．Ｔｈｅｓｅｃｒｅｔｉｏｎｏｆｐｒｏ ｉｎｆｌａｍｍａｔｏｒｙｃｙｔｏｋｉｎｅｓＩＬ １βａｎｄＩＬ ８ｉｎｔｈｅｓｕｐｅｒｎａｔａｎｔｏｆｃｅｌｌｃｕｌｔｕｒｅｗａｓｄｅｔｅｃｔｅｄｂｙＥＬＩＳＡ．犚犲狊狌犾狋狊　Ｃｏｍｐａｒｅｄｗｉｔｈｔｈｅｃｏｎｔｒｏｌｇｒｏｕｐ，ｔｈｅＴＮＦ αｇｒｏｕｐｓｈｏｗｓａｒｅｄｕｃｅｄＴＥＥＲ，ａｎｉｎｃｒｅａｓｅｄｐａｒａｃｅｌｌｕｌａｒｐｅｒｍｅａｂｉｌｉｔｙ，ａｄｅｃｒｅａｓｅｄＺＯ １ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ，ａｎｄａｎｉｎｃｒｅａｓｅｄＮＦ κＢｐ６５，ＭＬＣＫ，ｐ ＭＬＣ，ＩＬ １βａｎｄＩＬ ８ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ，ｗｉｔｈｓｔａｔｉｓｔｉｃａｌｌｙｓｉｇｎｉｆｉｃａｎｔｄｉｆｆｅｒｅｎｃｅｓ（犘＜０．０５）．ＣｏｍｐａｒｅｄｗｉｔｈｔｈｅＴＮＦ αｇｒｏｕｐ，ｔｈｅ２ Ｃｌ ＩＢ ＭＥＣＡｇｒｏｕｐｄｅｍｏｎｓｔｒａｔｅｓａｎｉｎｃｒｅａｓｅｄＴＥＥＲ，ａｄｅｃｒｅａｓｅｄｐａｒａｃｅｌｌｕｌａｒ·５４４·国际消化病杂志２０２１年１２月第４１卷第６期　ＩｎｔＪＤｉｇＤｉｓ，Ｄｅｃｅｍｂｅｒ２５，２０２１，Ｖｏｌ．４１，Ｎｏ．６Copyright©博看网 . All Rights Reserved.ｐｅｒｍｅａｂｉｌｉｔｙ，ａｎｉｎｃｒｅａｓｅｄＺＯ １ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ，ａｎｄａｄｅｃｒｅａｓｅｄＮＦ κＢｐ６５，ＭＬＣＫ，ｐ ＭＬＣ，ＩＬ １βａｎｄＩＬ ８ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ，ｗｉｔｈｓｔａｔｉｓｔｉｃａｌｌｙｓｉｇｎｉｆｉｃａｎｔｄｉｆｆｅｒｅｎｃｅｓ（犘＜０．０５）．犆狅狀犮犾狌狊犻狅狀　ＴｈｅａｃｔｉｖａｔｉｏｎｏｆＡ３ＡＲｃａｎａｌｌｅｖｉａｔｅｔｈｅｂａｒｒｉｅｒｉｎｊｕｒｙｏｆｉｎｔｅｓｔｉｎａｌｅｐｉｔｈｅｌｉａｌｃｅｌｌｓ，ｐｅｒｈａｐｓｔｈｒｏｕｇｈｔｈｅｉｎｈｉｂｉｔｉｏｎｏｆＮＦ κＢ／ＭＬＣＫ／ｐ ＭＬＣｓｉｇｎａｌｐａｔｈｗａｙ．【犓犲狔狑狅狉犱狊】　ＡｄｅｎｏｓｉｎｅＡ３ｒｅｃｅｐｔｏｒ；Ｉｎｔｅｓｔｉｎａｌｅｐｉｔｈｅｌｉａｌｂａｒｒｉｅｒ；Ｔｉｇｈｔｊｕｎｃｔｉｏｎ；Ｎｕｃｌｅａｒｆａｃｔｏｒ κＢ 肠上皮屏障由单层上皮细胞组成，通过紧密连接结合在一起。

如何选择二抗——根据一抗种属及类型选择合适的二抗二抗广义上是指专门和一抗进行特异性反应和结合的抗体，在免疫学反应中，经常需要针对试验选择不同的二抗，艾美捷能为您的科研工作提供最适合和最全面的二抗产品。

检测任何目的靶蛋白都有不止一种抗体可供选择，同时在后继试验中也会有不同的检测方案，因此在选择二抗的时候要综合考虑一抗的类型及后继检测方案的要求，一般来说，选择合适的二抗需要从下面几个方面考虑：【一抗的种属来源】二抗应选用与使用的一抗相同的物种来源，例如：如果你的一抗是小鼠源的单克隆抗体，二抗则选抗小鼠的二抗（山羊抗小鼠或者兔抗小鼠等均可）；如果一抗是从兔血清里制备的兔源多克隆抗体，则相应的二抗需要选择抗兔的二抗。

即根据一抗的物种来源选择相应的抗该物种的二抗。

艾美捷能为您提供最全的抗不同种属的原装进口二抗，包括抗小鼠、大鼠、兔、山羊、绵羊、人、豚鼠、猪、马、牛、鸡、鸭等二抗。

【一抗的类别亚型】二抗需与一抗的类别或亚类相匹配。

这通常是针对单克隆抗体而言。

多克隆抗体主要是IgG类免疫球蛋白，因此相应的二抗就是抗IgG抗体。

其中单克隆抗体的类别及亚类通常会在产品说明书中都会有描述，如果你的一抗是小鼠IgM，那么相应的二抗就应当是抗小鼠IgM。

如果单克隆一抗是小鼠IgG的某一亚类（IgG1，IgG2a，IgG2b，IgG3），那么几乎所有的抗小鼠IgG都可以与之结合，或者你也可以选择专门针对这一亚类的二抗，例如，如果你的一抗是小鼠IgG1，那么你可以选择抗IgG1的二抗，此种抗体在双标记实验中尤其适合。

在不清楚一抗为何种类/亚类的情况下，可以选用抗相应物种IgG。

艾美捷能为您提供通用的IgG(H+L)二抗，或者特异性只结合IgM的Anti IgM (mu) Antibody、IgA的Anti IgA (alpha-Antibody、IgE的Anti IgE (epsilon) Antibody等。

【二抗的种属来源】一般来说，不同的种属来源与二抗的质量没有必然的联系，来源于山羊的二抗与来源于驴的二抗在一般的实验里没有太多的差别。

AMI3409GTXMS IG'S HUADS BIOTIN B2763biotin-XX goat anti-mouse IgG (H+L)AMI4401IG'S UNCONJ GT F(AB')2XMSA10534F(ab')2 fragment of goat anti-mouse IgG (H+L)AMI4404IG'S HRP GT F(AB')2 XMS F21453F(ab')2 fragment of goat anti-mouse IgG (H+L), horseradish peroxidase conjugateAMI4405IG'S ALK PHOS GT F(AB')2XMSF21452F(ab')2 fragment of goat anti-mouse IgG (H+L), alkalinephosphatase conjugateAMI4407GT F(AB') XMS IG'S R PE A10543R-phycoerythrin F(ab')2 fragment of goat anti-mouse IgG (H+L)AMI4408IG'S FITC GT F(AB')2 XMS F11021fluorescein F(ab')2 fragment ofgoat anti-mouse IgG (H+L)A11017AMI4409GT F(AB')2 XMS IG'S BIOTIN B11027biotin-XX F(ab')2 fragment of goat anti-mouse IgG (H+L)ARI3401IG'S UNCONJ GTXRT A10536goat anti-rat IgG (H+L)ARI3404IG'S ADS HRP GTXRT A10549goat anti-rat IgG (H+L), horseradish peroxidase conjugateARI3405IG'S ADS ALK PHOS GTXRT A10546goat anti-rat IgG (H+L), alkaline phosphatase conjugateARI3408IG'S ADS FITC GTXRT A10528fluorescein goat anti-rat IgG (H+L)A11006ARI4404IG'S HRP GT F(AB')2 XRT A10548F(ab')2 fragment of goat anti-rat IgG (H+L), horseradish peroxidase conjugateARI4407IGG R PE GT F(AB')2 XRT A10544R-phycoerythrin F(ab')2 fragment of goat anti-rat IgG (H+L)ARI4408IG'S FITC GT F(AB')2 XRT A10527fluorescein F(ab')2 fragment of goat anti-rat IgG (H+L)Caltag™ ProductsCurrent SKU #Current SKU NameAlternateSKU #Alternate SKU NameComparableAlexa Fluor®SKU #L42000IgG (H+L), Goat Anti-Rabbit,(Purified)A10533goat anti-rabbit IgG (H+L)L42001IgG (H+L), Goat Anti-Rabbit,(FITC)F2765fluorescein goat anti-rabbit IgG(H+L)A11008L42007IgG (H+L), Goat Anti-Rabbit,(HRPO)G21234goat anti-rabbit IgG (H+L),horseradish peroxidase conjugateL42008IgG (H+L), Goat Anti-Rabbit,(Alk. Phos.)G21079goat anti-rabbit IgG (H+L), alkalinephosphatase conjugateL42010IgG (H+L), Goat Anti-Rabbit,(Cy3)A10520Cy3® goat anti-rabbit IgG (H+L)A21428L42015IgG (H+L), Goat Anti-Rabbit,(Biotin)B2770biotin-XX goat anti-rabbit IgG(H+L)L43001IgG (H+L), Goat F(ab')2 Anti-Rabbit, (FITC)A10526fluorescein F(ab')2 fragment ofgoat anti-rabbit IgG (H+L)A11070L43004IgG (H+L), Goat F(ab')2 Anti-Rabbit, (R-PE)A10542R-phycoerythrin F(ab')2 fragmentof goat anti-rabbit IgG (H+L)L43007GT FAB'2 X RB IGG HRP A10547F(ab')2 fragment of goat anti-rabbit IgG (H+L), horseradish peroxidase conjugate。

抗体它是高等动物在抗原物质的刺激下由浆细胞产生的一类能与相应抗原发生特异性结合的免疫球蛋白。

抗体通常存在于血清合淋巴（组织液）中。

单克隆抗体及多克隆抗体：由单一克隆的细胞（通常是单一克隆的杂交瘤细胞）所产生的识别某一抗原表位的单一抗体；多克隆抗体是由多种细胞分别接触相应抗原而产生的多种抗体的总和，多克隆抗体抗原识别抗原的多个表位。

抗体分类抗体分类：根据重链恒定区的血清学类型，可将抗体分为IgM，IgG，IgA，IgD，IgE五类，它们的重链分别为mu, gamma, alpha, delta, epsilon链。

在上述每一类别中，按重链构造上的变异又可分为几个亚类，例如人的IgG可分为IgG1，IgG2，IgG3，IgG4四个亚类。

轻链分为两种类型，kappa链和lambda链，但每种抗体中只存在一种类型的轻链。

第一抗体第一抗体就是能和非抗体性抗原特异性结合的蛋白。

第一抗体的选择1.分析自己实验应用的实验方法是哪种？一般抗体说明书都列出该抗体经试验验证过适用于何种分析类型，如：可以应用于WB、IHC、ICC、ELISA、FCM分析等。

2.分析自己实验中标本的种属是哪种动物或人的？一般抗体说明书都列出该抗体经试验验证过适用于何种动物或人的标本，如：可以用于rat、mouse、human、pig、goat等动物的标本的实验。

也就是说应选择物种相同或有交叉反应的抗体，抗体可能与不同物种的同种靶蛋白有交叉反应，因其氨基酸序列同源性较高。

3.分析样本中的蛋白质的结构性质了解样本蛋白的结构性质有助于选择最合适的抗体，至少两方面因素需要考虑待测样本蛋白的结构域：抗体是由各种不同免疫原免疫宿主而制备得来，其中的免疫原包括：全长蛋白、蛋白片断、多肽、全有机体（如：细菌）或细胞，抗体说明书一般都有免疫原的描述，如果打算检测的是蛋白片断或一种特殊的同型物或蛋白全长的某一区域，则必须选择用含此片段域的免疫原制备出的抗体。

肝癌微环境中M2型肿瘤相关巨噬细胞对肝癌转移功能的影响及其机制研究一、本文概述肝癌，作为全球范围内致死率极高的恶性肿瘤之一，其发生、发展及转移过程涉及众多复杂的生物学机制。

在众多影响肝癌进程的微环境因素中，肿瘤相关巨噬细胞（TAMs）的作用日益受到关注。

特别是M2型TAMs，因其具有促进肿瘤生长、侵袭和转移的特性，已成为肝癌研究的新热点。

本文旨在深入探讨M2型TAMs在肝癌微环境中对肝癌转移功能的影响及其潜在机制，以期为肝癌的诊疗提供新的思路和方法。

我们将首先概述肝癌的流行病学特征、临床表现及其治疗现状，以明确肝癌研究的背景和重要性。

随后，我们将重点分析M2型TAMs 在肝癌微环境中的分布、功能及其对肝癌转移的影响，通过文献综述和实验数据相结合的方式，揭示M2型TAMs与肝癌转移之间的内在联系。

在机制研究方面，我们将深入探讨M2型TAMs如何通过分泌特定细胞因子、趋化因子等方式，与肝癌细胞相互作用，促进肝癌的侵袭和转移。

我们还将关注M2型TAMs在肝癌免疫逃逸中的作用，以及其与肝癌预后的关系。

通过本文的研究，我们期望能够为揭示肝癌转移的分子机制提供新的视角，同时为开发针对M2型TAMs的肝癌治疗方法提供理论依据。

这不仅有助于提升我们对肝癌发生、发展过程的理解，还可能为肝癌的临床治疗带来革命性的突破。

二、材料与方法1 细胞系：本研究所用肝癌细胞系（HepG2和MHCC97H）及小鼠巨噬细胞系（RAW7）均购自中国科学院细胞库。

2 主要试剂：RPMI 1640培养基、胎牛血清（FBS）、青霉素/链霉素双抗、胰蛋白酶等细胞培养所需试剂购自Gibco公司；M2型巨噬细胞诱导剂IL-4和IL-13购自PeproTech公司；细胞迁移和侵袭实验所需Transwell小室购自Corning公司；RNA提取试剂Trizol、逆转录试剂盒及实时荧光定量PCR试剂盒购自Thermo Fisher Scientific公司；Western Blot所需试剂购自Bio-Rad公司；其他常用化学试剂均购自国药集团。

2015最新体外诊断原材料品牌汇总1、Fitzgerald 公司简介Fitzgerald 公司主要提供抗体（特色是配对好的抗体）、纯化的抗原、ELISA试剂盒以及专业化的研究产品，是诊断试剂原料行业的全球首要供应商。

应用领域：胶体金免疫层析检测，酶联免疫吸附法检测、以及放射免疫分析法、免疫印记、免疫组织化学、流式细胞方法。

20 多年来，Fitzgerald 产品数量不断地稳步增长，并致力于开发新的产品以满足客户的需求。

2、BBI Solutions 公司简介BBI Solutions 是英国一家体外诊断试剂制造商，服务于体外诊断试剂行业已经有50余年，积累了丰富的经验，它为药品市场原材料和成品提供测试的平台。

BBI Solutions 的产品包括人的抗原，抗体，血清，血浆和临床化学酶、ELISA 试剂盒、生物传感器、侧向层析的标签、黄金纳米粒子和葡萄糖氧化酶等。

3、Medix Biochemica 公司简介Medix Biochemica 是芬兰的一家生物技术公司，致力服务于体外诊断以及快速疾病诊断行业。

Medix 一直致力于开发实用、高性价比的单克隆抗体，以满足这二十多年来蓬勃发展的免疫诊断试剂领域原料的需求。

Medix 单抗包括性激素（HCGLHPRL FSH ）、肿瘤标志物（AFP CEA HB PG PSANSE ）、激素（TSH T3 T4）、心肌类（CK-MB cTnI ），以及传染病类、血清学等多种标志物蛋白的单抗，各标志物其单抗也有各种不同克隆配对可供用户筛选。

4、Biospacific 公司简介BiosPacific 公司于1989年成立于美国，是全球著名的临床诊断抗原抗体原料的供应商。

公司产品主要集中在癌症（肿瘤）、内分泌、传染病、人血清蛋白、类固醇、心脏病病等标记物的优质单抗、多抗、抗原、偶联抗体，以及抗体对（matchedpairs ）。

细胞因子 心肌标志物 毒品检测 激素类固醇 传染病项目 肿瘤标志物 神经学项目5、康乃格/CanAg简介康乃格诊断公司（也称Fujirebio Diagnostics，Inc公司）是体外诊断领域的世界领先者，同时也是全世界肿瘤标记物检验用品的金标准生产商。

中国图书分类号R392-33文献标识码A文章编号1004-5503（2008）11-0999-03【诊断制品】牛血清白蛋白单克隆抗体的筛选与双抗体夹心ELISA检测方法的建立张加利1蔡芳2高强2宋莉莉2于丹2桑建利1【摘要】目的筛选高效抗牛血清白蛋白（BSA）单克隆抗体细胞株，并建立BSA抗原检测的双抗体夹心ELISA法。

方法分别采用辛酸-硫酸铵法和葡萄球菌A蛋白亲和层析法纯化单抗，并进行抗体类型、腹水效价、特异性和相对亲和力测定；应用纯化的单抗建立BSA双抗体夹心ELISA检测法，并进行初步应用。

结果筛选出4株可稳定分泌抗BSA单抗的杂交瘤细胞株，抗体类型为IgG，抗体滴度均可达10-6，特异性良好，相对亲和力较高。

建立的双抗体夹心ELISA法线性范围为1.25～20ng／ml，R2>0.98，灵敏度为1.25ng／ml。

结论已筛选出高效抗BSA的单抗，并建立了BSA双抗体夹心ELISA检测方法。

【关键词】牛血清白蛋白；单克隆抗体；双抗体夹心ELISA法Screening of Monoclonal Antibody against Bovine Serum Albumin and Devel－opment of Double Antibody Sandwich ELISA for BSAZHANG Jia-li△,CAI Fang,GAO Qiang,et al（△College of Life Science,Beijing Normal University,Beijing 100875,China）【Abstract】Objective To screen the monoclonal antibody（McAb）against bovine serum albumin（BSA）and develop a dou－ble antibody sandwich ELISA for BSA.Methods The McAb was purified by caprylic acid-ammonium sulphate precipitation and staphylococcal protein A affinity chromatography and analyzed for type,titer in ascites,specificity and relative affinity.A double anti－body sandwich ELISA was developed with the purified McAb and applied primarily.Results Four hybridoma cell strains stably se－creting McAb against BSA was screened.The secreted McAb with a titer of10-6was IgG which showed good specificity and high rel－ative affinity.The sensitivity of developed double antibody ELISA was1.25ng／ml,and the linear range and R2value of detection result by the method were1.25-20ng／ml and more than0.98respectively.Conclusion The McAb against BSA was successfully screened,and a double antibody sandwich ELISA for BSA was developed.【Key words】Bovine serum albumin;Monoclonal antibody;Double antibody sandwich ELISA《中国药典》三部（2005版）规定制品中牛血清白蛋白（Bovine serum albumin，BSA）残留量应不高于50ng／剂。

一抗的选择检测任何目的靶蛋白都有不止一种抗体可供选择，为缩小抗体的选择范围选中合适的抗体，需要考虑如下几种因素：分析试验应用的类型l样本蛋白的结构性质l样本的种属l抗体宿主的种类l抗体的标记和检测l1.分析试验应用的类型一般抗体说明书都列出该抗体经试验验证过适用于何种分析类型，如：可以应用于WB IHC ICC ELASA分析等，如果抗体说明书没有提及的应用类型，并不意味着该抗体不适用于此种分析应用类型，而仅是说明尚未经过此种分析试验验证，如果抗体不适用某些分析试验，则会在抗体说明书上标注出来不适于某分析试验。

2.样本蛋白的结构性质了解样本蛋白的结构性质有助于选择最合适的抗体，至少两方面因素需要考虑待测样本蛋白的结构域：抗体是由各种不同免疫原免疫宿主而制备得来，其中的免疫原包括：全长蛋白、蛋白片断、多肽、全有机体（如：细菌）或细胞，抗体说明书一般都有免疫原的描述，如果打算检测的是蛋白片断或一种特殊的同型物或蛋白全长的某一区域，则必须选择用含此片段域的免疫原制备出的抗体。

如果打算用FACS流式检测活细胞的表面蛋白，则需要选择含该表面蛋白的胞外域来免疫制备的抗体。

l 样本的提取或处理过程：某些抗体要求样本经过某些特殊处理，例如：许多抗体只识别还原和变性的、表位已暴露不受二级四级结构阻碍的蛋白样本，另一方面，某些抗体仅识别天然折叠状态的蛋白。

当选择免疫组化的抗体时，应注意某些抗体只识别未固定的冷冻的组织，而另一些抗体则适用于无需抗原修复解交联步聚的甲醛固定石蜡包埋的组织，这些都会在抗体说明书上应用部分标示出来l3.样本的物种应选择物种相同或有交叉反应的抗体，抗体可能与不同物种的同种靶蛋白有交叉反应，因其氨基酸序列同源性较高，如果样本的种类未列入抗体说明书上的交叉反应种属表中，并不意味着该抗体不适用于检测该物种的蛋白，而只是表示该物种尚未用此抗体检测验证过，应通过序列比对的方法来预测交叉反应，可应用Expasy 和NCBI BLAST来进行不同物种蛋白同源性比对。

JacksonImmunoResearch山羊抗羊驼IgG说明书Jackson ImmunoResearch AffiniPure 山羊抗羊驼 IgG (H+L)基于免疫电泳和/或 ELISA，抗体与全分子羊驼 IgG 和美洲驼 IgG 反应。

该抗体主要与 Fc 区反应，不推荐用于检测 VHH 抗体。

未检测到针对非免疫球蛋白血清蛋白的抗体。

该抗体可能与来自其他物种的免疫球蛋白发生交叉反应。

通过免疫亲和层析从抗血清中分离出完整的 IgG 抗体。

它们具有一个 Fc 部分和两个通过二硫键连接在一起的抗原结合 Fab 部分，因此它们是二价的。

据报道，平均分子量约为160 kDa。

整个 IgG 形式的抗体适用于大多数免疫检测程序。

Jackson ImmunoResearchAffiniPure 山羊抗羊驼 IgG (H+L)参数：目标： Alpaca宿主： GoatAntibody 形式： Whole IgG特异性： IgG (H+L)Conjugate： Unconjugated类别： Anti-Alpaca 二抗克隆性：多克隆物理状态：无菌过滤液体储存：在无菌条件下储存在 2-8°C。

在使用当天准备工作稀释液。

纯度：使用与琼脂糖珠偶联的抗原，通过免疫亲和层析从抗血清中纯化抗体。

缓冲液： 0.01M 磷酸钠，0.25M NaCl，pH 7.6防腐剂：无建议工作浓度或稀释范围：10-20 µg / ml稀释因子以范围的形式呈现，因为最佳稀释度是许多因素的函数，例如抗原密度、渗透性等。

实际使用的稀释度必须凭经验确定。

AffiniPure 山羊抗羊驼 IgG，亚类 2+3 特异性AffiniPure 山羊抗羊驼 IgG，VHH 结构域AffiniPure Goat Anti-Alpaca IgG、VHH 结构域。

Jackson ImmunoResearch 公司二抗选用指南(此部分内容来源于Jackson ImmunoResearch Laboratories Inc网站，如有疑问，请参考原网站）亲和层析法纯化的二抗用亲和层析法纯化的抗体是指，利用耦联到琼脂糖凝胶上的抗原将抗血清中的抗体亲和层析下来。

我们采用一种特有的连续的洗脱过程将抗体从固态抗原上分离出来。

我们提供的未标记的亲和层析法纯化的抗体是不含有稳定剂和防腐剂的无菌液体。

耦联标记物的抗体是冻干粉，里面含有稳定剂和防腐剂，但是过氧化物酶标记的抗体里面不含防腐剂。

(下面内容中的页码指的是Jackson 2006年原版目录中的页码）亲和层析纯化抗体的选择和定位第一步：选择Whole IgG（8－17页）、F(ab’)2片段（18－22页），或者Fab片段（23－25）抗体。

我们提供三种亲和纯化的抗体：Whole IgG，F(ab’)2片段，Fab片段。

Whole IgG（8－17页）抗体是从抗血清中分离出来的完整的分子。

这些抗体有一个Fc部分和两个与抗原结合的Fab部分，因此是二价的。

Whole IgG抗体适用于多数情况（见F(ab’)2片段、Fab片段的特例），也是性价比最高的。

F(ab’)2片段（18－22页）抗体是用胃蛋白酶消化IgG去除Fc部分，剩下两个靠二硫键连接的结合抗原的Fab部分（依然是二价的）。

这些抗体用在特定的情况中，例如避免抗体与Protain A 或G 结合，或者与有Fc受体的活细胞结合。

但是，如果一抗是whole IgG，不管二抗是哪种形式都可能出现结合Fc受体。

这时，为了阻止抗体结合到Fc受体上，可以在4度将细胞预培养于含有叠氮钠和二抗来源物种正常血清的缓冲液中。

注意：当使用的是带标记的二抗时，千万不能用一抗来源物种的正常血清和IgG来封闭。

如果血清中的免疫球蛋白非特异性的结合到样品上，他们会被带有标记的二抗识别，导致背景过高。

宿主物种丨Jackson告诉你选择二抗的注意事项蛋白质印迹实验中二抗的选择是非常重要的。

那么接下来就一起来看Jackson ImmunoResearch公司选择二抗的相关注意事项吧~ 宿主物种的相容性如果使用多种二抗，例如探测两种一抗，请选择相同的宿主物种以尽量减少任何交叉反应。

如果这不可能，则选择与实验中其他二抗的宿主物种交叉吸附的二抗。

交叉反应物种虽然在蛋白质印迹中不常见，但某些应用需要针对其他物种吸附的二抗，以尽量减少对内源性免疫球蛋白的识别（例如用抗大鼠一抗探测小鼠组织裂解物）或其他一抗。

因此，请选择可用于预期应用的具有适当交叉吸附的二抗宿主。

经验或偏好宿主物种的选择通常归结为个人偏好或先前的实验验证。

在不同宿主物种中产生的二抗之间似乎几乎没有质量差异，只是某些物种更适合大规模生产。

特异性选择具有正确特异性的二抗很重要。

尽管全 IgG (H+L) 适用于大多数免疫测定，但其他专业特异性允许设计更复杂的实验，以消除不必要检测的潜在干扰。

抗 IgG (H+L)Jackson ImmunoResearch 公司抗 IgG (H+L)与 IgG 分子的重链和轻链都发生反应，即与 IgG 的 Fc 和 F(ab')2 / Fab 区发生反应（图 1）。

抗 IgG (H+L) 抗体也与其他免疫球蛋白类别（IgM、IgA、IgD、IgE）和亚类发生反应，因为它们都共享相同的轻链（kappa 或 lambda）。

抗 IgG (H+L) 抗体比抗片段特异性抗体具有更广泛的表位识别。

它们也被建议用于所有一般的免疫检测程序。

同种型特异性：Fc 特异性抗体大多数一抗是 IgG 同种型。

有时根据抗体的产生方式使用其他类别，例如 IgM 和 IgA。

对免疫球蛋白的 Fc 域特异的二抗将特异于该特定 Fc 域的同种型。

因此，Fcγ特异性抗体将对IgG特异性，而对Fcα特异性的抗体将特异性检测IgA，而Fcμ将检测IgM。

米诺环素对黑质急性炎症的保护作用及与自噬相关性研究黄丹青; 孙奕; 王芬; 杨亚萍; 徐畅; 王变荣; 郑慧芬【期刊名称】《《实用老年医学》》【年(卷),期】2019(033)011【总页数】6页(P1046-1051)【关键词】米诺环素; 自噬; 小胶质细胞; 炎症【作者】黄丹青; 孙奕; 王芬; 杨亚萍; 徐畅; 王变荣; 郑慧芬【作者单位】210024 江苏省南京市南京医科大学附属老年医院神经内科; 215123 江苏省苏州市苏州大学神经科学研究所【正文语种】中文【中图分类】R749.1帕金森病(Parkinson′s disease，PD)是一种常见的神经系统退行性疾病，其病因尚未完全明确，研究表明，免疫/炎症机制参与了PD的发病[1]。

小胶质细胞是脑内主要的免疫/炎症细胞，小胶质细胞的激活，是PD等神经退行性疾病的共同病理生理机制。

黑质部位小胶质细胞的数量是脑内其他部位的4.5倍，因此该部位对炎症刺激更为敏感，一旦小胶质细胞的过度激活呈慢性、持续性状态，就会分泌出大量的促炎因子如肿瘤坏死因子-α(TNF-α)、白细胞介素-β(IL-β)、一氧化氮(NO)等，最终导致该部位多巴胺神经元细胞严重受损甚至死亡[1]。

受伤的神经元细胞同时还生成一些物质，如α-突触核蛋白(α-synuclein)[2]，其病理性蓄积的发生早于多巴胺神经元的死亡，而细胞自噬功能障碍是导致α-synuclein清除障碍和异常积聚的重要因素[3-4]。

随着对自噬应激认识的深入，日益认识到单纯的自噬激活并不能对α-synuclein 病理性蓄积引起的多巴胺能神经元死亡发挥保护作用，若自噬诱导与自噬降解之间失平衡反而可能会加剧神经元损伤。

四环素类抗生素是一类广谱碱性抗生素，其半合成有多西环素和米诺环素(minocyclein)等。

早已有研究发现，米诺环素能通过血脑屏障，在脑脊液和中枢神经系统中有很高的血药浓度，且具有显著的神经保护作用[5]。

抗人二抗丨Jackson ImmmoResecarch二抗选择指南血清学检测在临床决策中起着至关重要的作用，免疫分析是目前可用的最强大，最灵敏的血清学检测方法之一，它基于抗原抗体之间的高度特异性结合，即使在低浓度下也能进行定性和定量检测。

当选择用于夹心法检测的抗人二抗时（图1A），需要考虑一抗的种属，并使用与该物种有最小交叉反应的二抗。

尽管免疫测定的功能和目的有所不同，但为了在临床上获得准确，可靠数据，开发血清学试剂盒时，高质量试剂至关重要。

抗人二抗的质量是开发免疫测定试剂盒时的关键考虑因素，二抗需要谨慎选择，因为它们会结合一种一抗的多个表位上，从而增强了信号的灵敏度和选择性。

在免疫分析中选择合适的二抗时的考虑因素以及抗体的特征，Jackson 二抗为例：1.抗体来源：人体样品的血清学检测应使用抗人二抗，以最大程度地减少非特异性结合，以最大程度降低背景信号和假阳性。

Jackson 二抗可以提供多种来源的抗人二抗，包括羊驼，驴，山羊，小鼠和兔子。

2.产品类别：二抗可以是完整的免疫球蛋白（Ig）G，也可以是F（ab'）2和Fab片段，完整的IgG分子可适用于大多数检测，而F（ab'）2和Fab片段可用于避免与具有Fc受体的活细胞的非特异性结合。

Jackson 二抗可以提供完整IgG形式的二抗以及F（ab'）2和Fab片段3.特异性：根据所需免疫测定的特异性，可以制备针对整个Ig分子的二抗，以及针对于Fc 或F（ab'）2结构域特异性的二抗。

Jackson 二抗可以提供针对于对整个人源Ig分子的二抗，以及针对于Fc和F（ab'）2结构域特异性的二抗。

4.亚型：大多数免疫测定均只检测IgG型抗体，这种类型抗体占总血清Ig的?75％，是次级免疫反应的一部分。

但是，血清中同时也存在IgM和IgA，而且二抗只对同亚型一抗的具有特异性。

Jackson 二抗可以提供对IgG，IgM，IgA，IgG+IgM和IgG+IgM+IgA一种或几种亚型有特异性的二抗。