免疫荧光双染和细胞化学DAB染色步骤

制备细胞爬片

1、在无菌培养皿或6孔细胞培养板中铺上灭菌后的盖玻片，在每片盖玻片上滴一滴计数后的细胞悬液（细胞密度为2×105/ml）。再在每片盖玻片上滴加培养液至刚好覆盖满盖玻片。将培养皿（6孔细胞培养板）置于 37℃，含 5% CO2及饱和湿度的CO2培养箱中培养。

2、4小时后将培养液加量至覆盖整个培养皿的底面。

3、倒置显微镜下观察，当细胞增殖到合适的密度后取出培养皿中止培养（一般为1-3天）。

4、倾去培养液，加 PBS（PH 7.2～7.4）洗涤细胞爬片 2 次，每次 1 min。

5、加 10%中性多聚甲醛（或-20℃预冷的丙酮）固定 10～15min。

6、吸除固定液，加 PBS 再洗涤细胞爬片 3 次，每次 5 min。

7、置于室温下干燥1小时，如暂不染色，先放在-20 冰箱中保存。

8、取出盖玻片时注意盖玻片的正反面（有细胞的为正面）。

将硅化玻片放入饭盒（金属），排好顺序，一定要放平，消毒，将消化好的细胞滴在硅化玻片上，可一片滴两滴，放入培养箱2小时，待细胞贴片，2小时后取出加培液至没过玻片，放培养箱过夜，取出后即丙酮固定，偶做过，效果不错的。

免疫荧光双染

用两个不同的物种的原始抗体的双免疫荧光染色基本方案

1) 冰冻切片，晾干，4%多聚甲醛固定 10～15min。（细胞爬片固定后，以下步骤一样） 2) 漂洗和稀释：在10 mM磷酸钠缓冲液，pH7.5，150mM NaCl（PBS）中漂洗切片，3×5分钟。PBS液是用来漂洗和稀释的。其他缓冲液如Tris缓冲碱（TBS）也可用。

3) 在细胞爬片上加0.03%-1% Triton X-100溶液处理15min。（若是要检测的抗原表达于胞膜，此步可考虑省略），PBS液洗3×5分钟

4) 阻断步骤：用含5%的正常二度抗体物种来源血清的PBS孵化切片60分钟。（37℃） （一抗前不洗，只甩干）

5) 原始抗体：在切片上吸干多余的阻断液，在室温下孵化60分钟或在4℃下相应地用稀释的两个物种（如鼠和兔）的未标记的一度抗体混合一起孵化过夜。当用荧光标记的原始抗体用于直接免疫染色（一度抗体）时，你可以跳过用二度抗体的间接免疫染色方法（二度抗体）的步骤（6）。（4℃过夜最好）在PBS液或TBS中漂洗3×5分钟。

如有你有帮助，请购买下载，谢谢！

1页 制备细胞爬片

1、在无菌培养皿或6孔细胞培养板中铺上灭菌后的盖玻片，在每片盖玻片上滴一滴计数后的细胞悬液（细胞密度为2×105/ml）。再在每片盖玻片上滴加培养液至刚好覆盖满盖玻片。将培养皿（6孔细胞培养板）置于 37℃，含 5% CO2及饱和湿度的CO2培养箱中培养。

2、4小时后将培养液加量至覆盖整个培养皿的底面。

3、倒置显微镜下观察，当细胞增殖到合适的密度后取出培养皿中止培养（一般为1-3天）。

4、倾去培养液，加 PBS（PH 7.2～7.4）洗涤细胞爬片 2 次，每次 1 min。

5、加 10%中性多聚甲醛（或-20℃预冷的丙酮）固定 10～15min。

6、吸除固定液，加 PBS 再洗涤细胞爬片 3 次，每次 5 min。

7、置于室温下干燥1小时，如暂不染色，先放在-20 冰箱中保存。

8、取出盖玻片时注意盖玻片的正反面（有细胞的为正面）。

将硅化玻片放入饭盒（金属），排好顺序，一定要放平，消毒，将消化好的细胞滴在硅化玻片上，可一片滴两滴，放入培养箱2小时，待细胞贴片，2小时后取出加培液至没过玻片，放培养箱过夜，取出后即丙酮固定，偶做过，效果不错的。

免疫荧光双染

用两个不同的物种的原始抗体的双免疫荧光染色基本方案

1) 冰冻切片，晾干，4%多聚甲醛固定 10～15min。（细胞爬片固定后，以下步骤一样）

2) 漂洗和稀释：在10 mM磷酸钠缓冲液，pH7.5，150mM NaCl（PBS）中漂洗切片，3×5分钟。PBS液是用来漂洗和稀释的。其他缓冲液如Tris缓冲碱（TBS）也可用。 如有你有帮助，请购买下载，谢谢！

2页 3) 在细胞爬片上加0.03%-1% Triton X-100溶液处理15min。（若是要检测的抗原表达于胞膜，此步可考虑省略），PBS液洗3×5分钟

4) 阻断步骤：用含5%的正常二度抗体物种来源血清的PBS孵化切片60分钟。（37℃） （一抗前不洗，只甩干）

1、酶免疫组化的关键环节

1）标本固定：固定的目的是①防止标本从玻片上脱落；②除去防碍抗原-抗体结合的类脂，使抗原抗体结合物易于获得良好的染色结果；③固定的标本易于保存。固定剂的选择一般用4%多聚甲醛，但睾丸组织、眼可能要选用Bouin’s液或mDF液效果较好。

2）脱水、石蜡包埋和制片：脱水用梯度乙醇（由低到高）充分脱水、对组织要完全浸蜡、切片时刀片要干净和锋利。否则，容易裂片和脱片等。

3）脱蜡和水化：这是为了后面的抗体等试剂能够充分与组织中抗原等结合反应。脱蜡可以先60度20min，然后立即二甲苯1-3分别10min（这个时间是由二甲苯新鲜程度和室温等综合决定的），但当天制好的切片一般先60度3-4h。水化用梯度乙醇（由高到低）。若脱蜡和水化不全易出现局灶性反应和浸洗不全，而产生非特异性背景着色。

4）抗原修复：由于组织中部分抗原在甲醛或多聚甲醛固定过程中，发生了蛋白之间交联及醛基的封闭作用，从而失去抗原性；通过抗原修复，使得细胞内抗原决定族重新暴露，提高抗原检测率。常用的修复方法从强到弱一般分为三种，高压修复、微波修复、胰酶修复。修复液也分为若干种（具体的可以查阅相关资料，大量的：中性的、高pH的等）。我们实验室一般用微波修复中火6min*4次，效果不错。注意微波修复后自然冷却30min左右（只要你觉得修复液的温度达室温即可）。

5）细胞通透：目的是使抗体能够充分地进入胞内进行结合反应。一般用Triton X-100、蛋白酶k等通透液。如Triton X-100可以溶解细胞膜、细胞核膜、细胞器膜上的脂质而使抗体及大分子结构的物质进入胞浆和胞核内，故在细胞免疫组化时尤为推荐使用，这样抗体就能顺利进入胞内与相应抗原结合。在免疫组织化学（>10um厚切片） 和免疫细胞化学中一般用Triton X-100 作为细胞通透剂，在膜上打孔。同时也是一种去污剂，一般在PBS中加入后终浓度是0.05%即可，而前者终浓度是0.5%-1%。石蜡切片4um左右可以不通透，因为细胞已经被切开了。

精品文档

。 1欢迎下载 免疫组化原理步骤及试剂

原理

抗原抗体反应，即抗原与抗体特异性结合的原理，通过化学反应使标记抗体的显色剂 (荧光素、酶、金属离子、同位素) 显色来确定组织细胞内抗原(多肽和蛋白质)，对其进行定位、定性及定量的研究。

众所周知，抗体与抗原之间的结合具有高度的特异性。免疫组化正是利用这一特性，即先将组织或细胞中的某些化学物质提取出来，以其作为抗原或半抗原去免疫实验动物，制备特异性抗体，再用这种抗体（第一抗体）作为抗原去免疫动物制备第二抗体，并用某种酶（常用辣根过氧化物酶）或生物素等处理后再与前述抗原成分结合，形成抗原 - 一抗 - 二抗复合物，将抗原放大，由于抗体与抗原结合后形成的免疫复合物是无色的，因此，还必须借助于组织化学方法将抗原抗体反应部位显示出来（常用显色剂DAB显示为棕黄色颗粒）。通过抗原抗体反应及呈色反应，显示细胞或组织中的化学成分，在显微镜下可清晰看见细胞内发生的抗原抗体反应产物，从而能够在细胞或组织原位确定某些化学成分的分布、含量。组织或细胞中凡是能作抗原或半抗原的物质，如蛋白质、多肽、氨基酸、多糖、磷脂、受体、酶、激素、核酸及病原体等都可用相应的特异性抗体进行检测。

分类（常用）

1、免疫荧光方法

最早建立的免疫组织化学技术。它利用抗原抗体特异性结合的原理，先将已知抗体标上荧光素，以此作为探针检查细胞或组织内的相应抗原，在荧光显微镜下观察。当抗原抗体复合物中的荧光素受激发光的照射后即会发出一定波长的荧光，从而可确定组织中某种抗原的定位，进而还可进行定量分析。由于免疫荧光技术特异性强、灵敏度高、快速简便，所以在临床病理诊断、检验中应用比较广。

2、免疫酶标方法

免疫酶标方法是继免疫荧光后，于60年代发展起来的技术。基本原理是先以酶标记的抗体与组织或细胞作用，然后加入酶的底物，生成有色的不溶性产物或具有一定电子密度的颗粒，通过光镜或电镜，对细胞表面和细胞内的各种抗原成分进行定位研究。免疫酶标技术是目前定位准确、对比度好、染色标本可长期保存，适合于光、电镜研究等。免疫酶标方法的发展非常迅速，已经衍生出了多种标记方法，目前在病理诊断中广为使用的当属PAP法（过氧化物酶-抗过氧化物酶）、ABC法（卵白素-生物素-过氧化物酶复合物）、SP法（链霉菌抗生物素蛋白-过氧化物酶）、即用型二步法（聚合物链接）等。

第 1 页 共 5 页 多色免疫荧光染色试剂盒使用说明

多色免疫荧光染色试剂盒使用说明

酪酰胺信号放大(TSA，Tyramide signal amplification)技术是一类利用辣根过氧化酶(HRP)对靶蛋白进行标记的酶学检测方法，类似常规免疫组化的DAB显色方法 ，TSA技术同样采纳HRP标记的二抗，同样有对应的“显色”步骤(HRP催化加入反应体系的酪胺荧光素底物，产生活化荧光底物，活化底物可与抗原上的酪氨酸等残基共价结合，使样品上稳定的共价结合酪胺荧光素。之后用热修复法洗去非共价结合的一抗-二抗-HRP复合物，重复下一种一抗-hrp二抗来其次轮孵育，换另一种酪胺荧光素底物，如此往复就可实现多重标记。

TSA具体原理是利用酪胺Tyramide的过氧化物酶反应(酪胺盐在HRP催化H202下形成共价键结合位点)，产生大量的酶促产物，该产物能与四周的蛋白残基(包括色氨酸、组氨酸和酪氨酸残基)结合，这样在抗原-抗体结合部位就有大量的荧光素沉积，结果使其检测信号得到10-100倍增加。简洁来说，用这种方法做多重免疫荧光是利用二抗上带有的HRP(而不是直接偶联荧光素)，来催化后续添加入体系的非活性荧光素。荧光素在HRP和过氧化氢的作用下被活化，跟接近蛋白的酪氨酸残基共价偶联，使得蛋白样品与荧光素稳定结合。然后微波或煮沸或者水浴等热修复处理，前一轮非共价结合的抗体被洗掉，共价结合的荧光素稳定共价结合在样本切片蛋白上。再换个一抗来其次轮孵育，周而复始。等到全部抗体孵育结束， 第 2 页 共 5 页 荧光素都结合好后，最终去检测结果。由于每次体系中都只有单一抗体孵育，因此无需担忧抗体交叉反应，以及一抗二抗种属匹配问题，大大削减了试验设计时不同种属抗体选择匹配的限制。也就是说，假如用TSA技术，同一张片子上全部的靶标都可以选用特异性高的兔单克隆抗体。搭配同一支抗兔的HRP二抗就可以进行试验，而且信号放大的倍数大大增加。茹创生物开发的试剂盒详细酪胺荧光染料为以下其中一种或者多种：TYR-480，TYR-520，TYR-570，TYR-620，TYR-690，TYR-780。此试剂盒中的荧光染料可单独或协作使用。可以实现单标、双标、三标以及更多重荧光放大/多重同源抗体荧光标记等功能，丰富了此试剂盒的内涵。

免疫组化的分类

免疫组织化学技术按照标记物的种类可分为免疫荧光法、免疫酶法、免

疫铁蛋白法、免疫金法及放射免疫自显影法等。

编辑本段免疫组化实验所用的组织和细胞标本

实验所用主要为组织标本和细胞标本两大类，前者包括石蜡切片（病理

切片和组织芯片）和冰冻切片，后者包括组织印片、细胞爬片和细胞涂片。 其中石蜡切片是制作组织标本最常用、最基本的方法，对于组织形态保

存好，且能作连续切片，有利于各种染色对照观察；还能长期存档，供回顾

性研究；石蜡切片制作过程对组织内抗原暴露有一定的影响，但可进行抗原

修复，是免疫组化中首选的组织标本制作方法。

编辑本段免疫组化实验所用的抗体

免疫组化实验中常用的抗体为单克隆抗体和多克隆抗体。单克隆抗体是

一个B淋巴细胞克隆分泌的抗体，应用细胞融合杂交瘤技术免疫动物制备。

多克隆抗体是将纯化后的抗原直接免疫动物后，从动物血中所获得的免疫血

清，是多个B淋巴细胞克隆所产生的抗体混合物。

编辑本段免疫组化常用的染色方法

根据标记物的不同分为免疫荧光法，免疫酶标法，亲和组织化学法，后

者是以一种物质对某种组织成分具有高度亲合力为基础的检测方法。这种方

法敏感性更高，有利于微量抗原(抗体)在细胞或亚细胞水平的定位，其中生

物素—抗生物素染色法最常用

免疫组化操作步骤

一 免疫组化（ LP 法）操作步骤

1． 切片常规脱蜡至水。如需抗原修复，可在此步后进行

2. 缓冲液洗 3min/2 次。 3. 为了降低内源性过氧化物酶造成的非特异性背景染色 , 将切片放

在 Hydrogen Peroxide Block 中孵育 10-15 分钟。

4. 缓冲液洗 5min/2 次。 5. 滴加 Ultra V Block ， 在室温下孵育 5 分钟以封闭非特异性的背

景染色。

（注：孵育不要超过 10 分钟，否则会导致特异性染色降低。如果一抗

的稀释液中含有 5 － 10% 正常羊血清，这一步可以省略。） 6. 缓冲液洗 5min/2 次。

- 1 - 免疫组化解读

免疫组化是一种重要的实验技术，用于检测细胞或组织中的分子。这种方法基于抗体与其特异性抗原之间的结合，使用特定的标记来确定其位置和数量。免疫组化在生物医学研究中广泛应用，可以识别和定位细胞或组织中的特定蛋白质或其他分子，从而提供关于细胞或组织的详细信息。

免疫组化实验通常涉及以下步骤：样本固定、抗体选择、抗体标记、抗体特异性验证、样本染色和结果解释。在这些步骤中，选择正确的抗体并正确标记是至关重要的，因为不同的抗体可以识别不同的抗原，并且标记的方式可以影响结果的可靠性和解释。

免疫组化可以用于多种应用，例如确定细胞或组织中的特定蛋白质或其他分子，研究细胞或组织的功能和疾病状态，以及评估药物治疗效果。对于疾病研究和治疗，免疫组化可以用于诊断和分层病理学，从而帮助医生更好地了解疾病的本质和治疗方法。

总之，免疫组化是一种重要的实验技术，可以提供有关细胞和组织的详细信息，对生物医学研究和临床应用具有重要意义。在进行免疫组化实验时，需要注意正确选择抗体和标记方式，并进行验证，以确保可靠的结果和解释。

cd31免疫荧光染色原理

CD31免疫荧光染色的原理是基于抗原与抗体的特异性结合。首先，需要准备组织切片样本，可以是石蜡包埋的组织切片或冰冻切片。然后，将切片进行脱蜡和抗原修复处理，以保证抗原的暴露和恢复其免疫原性。接下来，将切片与特异性的CD31抗体孵育，抗体会与组织中的CD31结合形成抗原-抗体复合物。为了可视化CD31的表达情况，可以使用不同的检测方法，如酶标法（如辣根过氧化物酶）或荧光标记方法。在酶标法中，可以使用辣根过氧化物酶（HRP）标记的二抗与CD31抗体结合，形成二抗-抗原-抗体复合物。然后，加入辣根过氧化物酶底物，如DAB（二氨基联苯胺），底物与HRP反应后会产生棕色沉淀物，标记出CD31的位置。通过显微镜观察切片，可以看到棕色的细胞或组织结构，这些结构即为CD31阳性的区域。荧光标记方法利用荧光标记的二抗与CD31抗体结合，形成二抗-抗原-抗体复合物。然后，在荧光显微镜下，激发荧光染料(如荧光素、荧光素同工素、荧光素异硫氰酸铵等)，荧光染料会发出特定波长的荧光信号，标记出CD31的位置。通过显微镜观察切片，可以看到荧光信号亮点，这些亮点即为CD31阳性的区域。

脑片免疫荧光和免疫组化实验步骤

一、脑片免疫荧光实验步骤

1. 选择适当的脑片：根据实验目的，选择适当的脑组织样本，并将其切片，厚度通常为20-50微米。

2. 取样品：将脑片放置在玻璃载玻片上，用磨刀机或刮片仪取出样品。将脑片固定在载玻片上，并确保其平整。

3. 抗体处理：用适当的抗体针对感兴趣的分子进行标记。可以使用一种或多种特异性抗体来检测不同的分子。

4. 渗透：将抗体溶液加入载玻片上的脑片样品上，并确保完全渗透。根据实验需要，可以进行不同时间的渗透，通常为1-2小时。

5. 洗涤：用洗涤缓冲液洗涤样品，去除未结合的抗体。洗涤次数和时间根据实验需求而定，通常进行3-5次洗涤，每次洗涤5-10分钟。

6. 荧光染色：加入适当的荧光染料，与抗体结合的目标分子将发出荧光信号。根据荧光染料的性质和实验需求，可以选择单一染色或多重染色。

7. 透明化：使用适当的透明化剂，如甘油或聚乙烯醇，使样品透明，以利于观察和成像。

8. 成像和分析：将样品放置在荧光显微镜下进行观察和成像。可以使用适当的成像软件对图像进行分析和处理，以获取所需的数据。

二、脑片免疫组化实验步骤

1. 取样品：选择适当的脑组织样本，并将其切片，厚度通常为20-50微米。将脑片放置在载玻片上。

2. 固定：用适当的固定剂固定脑片样本，以便后续的处理。常用的固定剂包括乙醇、甲醛等。

3. 脱脂和脱水：将脑片样本依次浸入不同浓度的醇溶液中，使其逐渐脱脂和脱水。常用的醇溶液包括乙醇和丙酮。

4. 抗体处理：用适当的抗体针对感兴趣的分子进行标记。可以使用一种或多种特异性抗体来检测不同的分子。

5. 渗透和洗涤：将抗体溶液加入载玻片上的脑片样品上，并确保完全渗透。根据实验需要，可以进行不同时间的渗透，通常为1-2小时。然后用洗涤缓冲液洗涤样品，去除未结合的抗体。

6. 染色：使用适当的染色剂，如DAB（二氨基联苯胺）或HRP（辣根过氧化物酶），与抗体结合的目标分子将呈现棕黑色或其他颜色。

免疫组化原理和步骤

免疫组化（Immunohistochemistry，IHC）是一种广泛应用于组织学和细胞学研究中的实验方法，主要用于检测和定位蛋白质在组织或细胞中的分布和表达水平。它结合了免疫学原理和组织学技术，通过使用特异性的抗体和染色剂来实现对目标蛋白质的检测和可视化。

免疫组化的原理主要是利用抗体的高度特异性与抗原相结合，然后使用染色技术来显示抗原的位置。该技术的基本原理可分为抗原-抗体反应、信号放大和信号显示三个步骤。

第一步：抗原-抗体反应

免疫组化的第一步是选择合适的抗体，通过与目标蛋白质的特异性结合来形成抗原-抗体复合物。抗体可以是单克隆抗体或多克隆抗体。单克隆抗体具有高度特异性，只能结合到特定的抗原上。多克隆抗体具有高度敏感性，可以结合多个位点，从而实现信号放大。

通常，为了提高抗原的可检测性，需要对组织样本进行抗原修复处理。这可以通过热处理（如蒸汽加热、微波加热）或酶切处理来实现。修复可以解除组织样本中抗原与蛋白质结构之间的交联，增加抗体的渗透性和可结合性。

当抗原-抗体反应发生时，可通过一系列化学反应来形成抗原-抗体复合物。例如，可以使用二抗来与抗原-抗体复合物结合，然后使用辣根过氧化物酶（HRP）或碱性磷酸酶（AP）标记的二抗来与二抗结合。该反应可形成稳定的抗体-酶复合物。

第二步：信号放大 由于抗原-抗体复合物的信号很弱，通常需要进行信号放大以便更好地检测到目标蛋白质。放大信号的方法有很多种，其中最常用的是酶免疫标记联合酶放大技术。

酶免疫标记是通过将抗体与酶结合，使其能够催化特定的化学反应来产生荧光、色素或光学信号。常用的酶免疫标记包括辣根过氧化物酶（HRP）和碱性磷酸酶（AP）。这些酶能够催化荧光素、二苯基胺、硝基蓝等底物的氧化还原反应，从而产生可视化的信号。

酶放大技术常用的方法包括：免疫酶化学法（如DAB法）、免疫荧光法和免疫酶学荧光混合法等。这些方法可通过将底物转化为可见的色素或荧光信号来标记抗原-抗体复合物，从而实现目标蛋白质的检测和定位。

免疫组化操作步骤

一免疫组化（LP法）操作步骤：

1. 切片常规脱蜡至水。如需抗原修复，可在此步后进行

2. 缓冲液洗3min/2次。

3. 为了降低内源性过氧化物酶造成的非特异性背景染色，将切片放在 Hydrogen Peroxide Block

中孵育 10-15 分钟。

4. 缓冲液洗5min/2次。

5. 滴加Ultra V Block ,在室温下孵育5分钟以封闭非特异性的背景染色。

（注：孵育不要超过10分钟，否则会导致特异性染色降低。如果一抗的稀释液中含有5 一10%正常羊血活，这一步可以省略。）

6. 缓冲液洗5min/2次。

7. 滴加一抗工作液37 C孵育1 — 2小时。（具体孵育时间和温度由试验者最终决定）

8. 缓冲液洗5min/2次。

9 . 滴加Primary Antibody Enhancer（ 增强子）， 在室温下孵育20分钟。

10 .缓冲液洗5min/2 次。

11 .滴加HRP Polymer（酶标二抗），在室温下孵育30分钟。

（注：HRP Polymer对光敏感，应避免不必要的光暴露并储存在不透明的小瓶中。）

12 .缓冲液洗5min/2 次。

13 .向 1ml DABPlus Substrate （或 AEC Plus Substrate） 中滴加 1-2 滴 DAB Plus Chromogen （或AEC Plus Chromogen ）,混匀后滴加到切片上，孵育 3 — 15 分钟。

（具体时间由染色深浅决定。）

14 .自来水充分冲洗，复染，脱水，透明，封片。

二. 免疫组化（三步法）操作步骤：

（1 ）、石蜡切片脱蜡至水。

（2 ）、3%H 2 O 2室温孵育5-10分钟，以消除内源性过氧化物酶的活性。

（3 ）、蒸僻水冲洗，PBS浸泡5分钟x2 （如需抗原修复，可在此步后进行）。

（4 ）、5-10%正常山羊血活（PBS稀释）封闭，室温孵育10分钟，倾去血活， 勿洗。滴加一抗工作液，37 C孵育1-2小时或4 C过夜。

贴壁细胞的免疫荧光染色方法

Materials:

1. PBS solution

2. 4% Paraformaldehyde (PFA fixative):

Dissolve 4g paraformaldehyde in 100ml PBS solution, stir at 70℃ to dissolve;

3. PBS-T solution: (0.1% Triton X-100 in PBS solution)

4. PBS-B blocking solution: (4% BSA in PBS solution)

5. Primary antibody: Dilute with PBS-B solution, dilution factors should refer to manual, or, test from 1:50~200, should be more concentrate than application in Western blot;

6. Secondary antibody: Dilute with PBS-B solution, dilution factors should refer to manual

Procedure:

1. Cultured cells, let it attach to the coverslips in 6-well plate;

2. Remove medium, rinse with PBS twice;

3. Add 2ml 4% paraformaldehyde, incubate at room temperature for 20 minutes;

4. Rinse with 2ml PBS three times, rinse for 5 minutes every time;

5. Permeabilize cells with 2ml PBS-T solution at 4?C for 10 minutes;

免疫组化

一，免疫组织化学简介

免疫组织化学又称免疫细胞化学，是指带显色剂标记的特异性抗体在组织细胞原位通过抗原抗体反应和组织化学的呈色反应，对相应炕原进行定性、定位、定量测定的一项新技术。它把免疫反应的特异性、组织化学的可见性巧妙地结合起来，借助显微镜(包括荧光显微镜、电子显微镜)的显像和放大作用，在细胞、亚细胞水平检测各种抗原物质(如蛋白质、多肽、酶、激素、病原体以及受体等)。

二，免疫组化技术的基本原理

免疫组化技术是一种综合定性、定位和定量；形态、机能和代谢密切结合为一体的研究和检测技术。在原位检测出病原的同时，还能观察到组织病变与该病原的关系，确认受染细胞类型，从而有助于了解疾病的发病机理和病理过程。

免疫酶组化技术是通过共价键将酶连接在抗体上，制成酶标抗体，再借酶对底物的特异催化作用，生成有色的不溶性产物或具有一定电子密度的颗粒，于普通显微镜或电镜下进行细胞表面及细胞内各种抗原成分的定位，根据酶标记的部位可将其分为直接法（一步法）、间接法（二步法）、桥联法（多步法）等，用于标记的抗体可以是用免疫动物制备的多克隆抗体或特异性单克隆抗体，最好是特异性强的高效价的单克隆抗体。直接法是将酶直接标记在第一抗体上，间接法是将酶标记在第二抗体上，检测组织细胞内的特定抗原物质。目前通常选用免疫酶组化间接染色法。

三，免疫组化步骤

1，切片，烤片60℃，1h；

2，脱蜡及复水

二甲苯10min，100％乙醇5min，95％乙醇5min，90％乙醇5min，85％乙醇5min，80％乙醇5min， 75％乙醇5min，60％乙醇5min，50％乙醇5min，30％乙醇5min，自来水1min，双氧水1min；

3，1份30％H2O2加10份蒸馏水，室温10min，蒸馏水洗3次，每次3min；

4，微波修复

将切片浸入0.01M枸橼酸缓冲液，微波中最大火力（98℃-100℃）加热至沸腾，冷却（约5-10min），反复两次；

形态学试验常用试剂配置方法

4%多聚甲醛

多聚甲醛4g,加蒸馏水100ml，加热至60C，搅拌并加入1M NaOH数滴,

调pH至7.0,滤纸过滤，现配现用。

0.01MPBS缓冲液

氯化钠(NaCl) 8.50g

磷酸氢二钠(Na2HPO4 12H2O) 3.58g

磷酸二氢钠(NaH2PO4 2H2O) 0.39g

加双蒸水至 1000ml

1M NaOH 调整 pH 至 7.2-7.4, 室温存放。

一袋独立包装的PBS (2000ml)加2000ml蒸馏水溶解

0.01mol/L枸橼酸缓冲液

柠檬酸 0.2g

柠檬酸三钠 1.5g

加双蒸水至 500ml

1M NaOH调整pH至6.0,现用现配。

铬矶明胶液

铬矶 0.5g

明胶 5g

蒸馏水 1000ml

以500-800ml蒸馏水加温溶解明胶，待其完全溶解后加入铬矶，最后加蒸馏 水至1000ml。载玻片事先以酸、碱洗涤剂洗净，蒸馏水洗，烤干，包被时水温 不超过70 C。

DAB试剂的配制(以DAB试剂盒为例)

在1.5mlEP管内加入1-1.5ml蒸馏水，加入一滴试剂 A，混合均匀，然后将 试剂B和试剂C各一滴加入其中，再次混匀。

此溶液必须现配现用，配好后避光保存， 30分钟内使用，剩余的液体应弃 石蜡切片的制备

1. 组织块从固定液中取出，流水冲洗 1-2h

2. 脱水：70%酒精—80%酒精—95%酒精I— 95%酒精U—无水酒精I —

无水酒精U,各级酒精浸泡30min-1h。

3. 透明：彻底脱水后的组织经苯I—苯U,各浸泡 30mim-1h。

4. 浸蜡：完全透明的组织放入56-58E石蜡中2-3h。

5. 包埋：被切面向下包埋于石蜡中,冷却后成蜡块。

6. 切片：旋转式切片机将蜡块切成5-10 ^m薄片，贴在经铬矶明胶处理的载 玻片上。

7. 58-60C烤片2-4小时。

冰冻切片的制备

1. 组织块从固定液中取出或者是刚刚取材的新鲜标本放入 20%的蔗糖溶液 中直至标本沉底（大约需要 12-20 小时）；

免疫组织化学染色诊断

1.什么是免疫组织化学染色

免疫组织化学染色是一种在组织中检测特定分子的方法。它基于

抗体-抗原反应的原理，利用免疫抗原识别的能力快速、定量地确定组

织中特定分子的分布与数量。免疫组织化学染色的主要原理是使用特

异性抗体识别并定位组织中感兴趣的分子。

2.免疫组织化学染色的应用领域

免疫组织化学染色在医学领域中应用广泛。它可用于确定细胞或

组织中某些蛋白质或抗原的存在、缺失或异常表达等。此外，它还可

以帮助诊断和治疗许多疾病，例如癌症、免疫疾病、感染、自身免疫

性疾病等。免疫组织化学染色可用于检测癌细胞、病毒感染等，从而

识别疾病类型、病情严重程度和转移潜力。同时，它还被广泛应用于

生物技术研究和仿生医学领域，如蛋白质研究、药物研发等。

3.免疫组织化学染色的常见方法

目前，常用的免疫组织化学染色方法包括免疫荧光染色、酶测定

法、免疫过氧化物酶染色、碱性磷酸酶染色、酸性磷酸酶染色等。

4.免疫组织化学染色的基本步骤

（1）样本制备：组织样品必须经过切片及染色前的某些处理，如

切片、脱水和透明化等。（2）抗原预处理：为了增强抗体与抗原之间的结合力，必须对组

织样品进行预处理。有许多方法可用于抗原的加热、固定和破裂处

理。

（3）抗体处理：抗体是免疫组织化学染色的关键。它必须与病理

组织中的目标抗原特异性结合。

（4）检测染色：检测染色是用于检测所需分子或细胞在组织中分

布情况的关键步骤。检测染色一般可用荧光染色、酶标记染色、过氧

化物酶染色等技术。

5.免疫组织化学染色与其他组织化学染色方法的比较

相对于传统的组织学和病理学染色方法，免疫组织化学染色具有

以下优点：

（1）稳定性更好：传统组织学染色易受外部因素影响而导致失

真。而免疫组织化学染色具有更好的稳定性和可靠性。

（2）分辨率更高：免疫染色可以通过选择抗体来检测复杂的具有

高度分子异质性的生物标志物分子。

（3）特异性更强：传统组织学染色往往无法区分细胞和组织中的

细微差别，而免疫组织化学染色可以通过选择特异性较强的抗体来识

免疫组化染色步骤

1、 常规脱蜡至水

二甲苯I 20min；二甲苯 II 20min； 100%乙醇 5min；95%乙醇 5min; 80%乙醇 5min；70%乙醇 5min; 蒸馏水5min。

2、 消除内源性过氧化物酶

3%H202处理30min，蒸馏水冲洗5min×2次。

（3%H202配制：30ml的30%的双氧水溶于300ml蒸馏水，搅拌均匀）

3、 微波修复

将切片置于0.01mol/L枸橼酸钠缓冲液中，微波修复至刚刚沸腾，隔5分钟后再一次加热至即将沸腾，重复2-3次，取出后自然冷却。PBS冲洗5min×3次。此步骤很关键，修复时要时刻观察，一沸腾即要关闭微波炉，要不然片子上的组织很容易脱片，而且修复过久容易到时假阳性，即基本是所有的细胞都染色了颜色。

（0.01mol/L柠檬酸钠缓冲液的配制：柠檬酸钠3g，柠檬酸0.4g加入1000ml蒸馏水，最终PH＝6）

4、 封闭非特异性抗原结合位点

用5%BSA滴加到目标组织上，放入湿盒内在37度孵育20min，甩去多于液体。

（5%BSA溶液配制体系为2ML：0.1gBSA溶于2ML的PBS中）

5、 滴加一抗

滴加一抗于目标组织上，放入湿盒内，40C冰箱过夜。

（一抗需要用PBS稀释）

6、 滴加二抗

从40C冰箱取出湿盒，使其自然恢复至室温，PBS冲洗5min×3次，滴加二抗于组织上，37度25min，PBS冲洗5min×3次。

7、 滴加SABC

滴加SABC于组织上，370C放置25min，PBS冲洗5min×3次。

8、 显色

将试剂盒中的ABC三种试剂按顺序依次滴加一滴于1ml蒸馏水中，混匀，滴加到目标组织上。通过观测组织颜色的变化情况来确定显色时间。根据显微镜下的观察决定终止显色的时间一般都在3-10min左右，最常用5min。 自来水冲洗：自来水充分冲洗10-15min,

注意：冲洗的时候要注意水流不要太大，缓慢的冲洗。