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免疫组化实验报告一、仪器与试剂1.仪器：包理机：KD-BM 生物组织包埋机，浙江省金华市科迪仪器设备有限公司；切片机：LEICA2016，德国；水浴锅：SHA-C，江苏金坛市荣华仪器制造有限公司；图像采集:采用OLYMPUS BX-41荧光显微镜及NIKON DIGITAL SIGHT 彩色CCD；数据分析软件:Image Pro Plus6.0 (Media Cybernetics公司；2.试剂：免疫组化染色试剂盒: Histostain-Plus Mouse Primary (Cat. No. 85-6643, Invitrogen, USA)Histostain-Plus Rabbit Primary(Cat. No. 85-6743, Invitrogen, USA)试剂A （蓝色液体）：封闭用正常山羊血清工作液试剂B （黄色液体）：生物素化二抗工作液试剂C （橙色液体）：辣根酶标记链霉卵白素工作液DAB Kit (Cat. No. 00-2014, Invitrogen, USA)二、石蜡包埋法1.组织浸入石蜡后，包埋前将组织移入包埋用石蜡杯内。
从恒温箱取出置于三角架上，其下点燃酒精灯，以保持石蜡的溶解状态。
2.准备好包埋框，将包埋用的镊子在酒精灯上加温（防止镊子粘蜡）后，左手持蜡杯，右手把加温的镊子放在蜡口（直立状）倒蜡时让石蜡沿镊子注入包埋框内。
3.迅速镊取组织块放入包埋框石蜡内，切面朝下放正置入框底并轻轻压平，以保证不再有气泡。
4.待石蜡表面凝固前将标签贴于其上，需注意勿使标签与标本混淆，当蜡块冷至蜡面有一层透明蜡膜时，浸入冷水中迅速使其冷却，否则蜡内常形成结晶。
5.蜡块完全硬固后除去铜框，以保证蜡彻底凝固，立即修切，准备制成切片或储藏备用。
二．石蜡包埋的注意事项1: 取材和固定：根据客户要求将切取3mm大小的组织块。
3：浸蜡和包埋：浸蜡：将透明的组织放入蜡杯（Ⅰ）→蜡杯（Ⅱ）→蜡杯（Ⅲ），一般总的浸蜡时间为２－４小时左右。
免疫组化实验实验原理：应用免疫学基本原理——抗原抗体反应，即抗原与抗体特异性结合的原理，通过化学反应使酶标记的抗体与显色剂进行显色反应，生成有色的不溶性产物，来确定组织细胞内抗原（多肽和蛋白质），对其进行定位、定性及相对定量。
实验目的：通过染色结果强弱，对所研究蛋白在组织水平的表达进行判断比较。
（干净的背景会使结果判断的更加准确）。
在实验室实验时遇到的难题：染色强度不够，背景较深，染色对比不够明显。
实验效果不好的可能原因：一抗效果不够好，脱蜡水化后有机溶剂冲洗的不够干净，抗原修复的程度不够，二抗效果不够好，DAB染色时间过久。
修改后的protocol：1.烘片：IHC白片，60度或70度烘箱，烘片40min。
2.脱蜡：二甲苯分别浸泡两次，10min/次。
（脱蜡时间可以适当延长，不需严格遵守10min时间，脱蜡脱得越干净越好）3.水化：依次放入100%酒精，95%酒精，80%酒精，各2min。
4.自来水冲洗：水化后在自来水流水下冲洗。
（水流不能太急，务必将有机溶剂完全冲洗干净，否则会影响后续实验效果）5.抗原修复：将片子浸没在抗原修复液中，高压锅20min，高温修复。
**实验室中可用小电饭锅或者微波炉替代，若在微波炉中操作，要保证液体在咕噜噜冒泡煮沸状态下煮20min，不然可能抗原修复力度不够。
**关于抗原修复液的选择：选用酸性柠檬酸缓冲液或碱性EDTA，最好根据抗体购买时说明书上推荐使用的缓冲液。
6.冷却：浸泡在修复液中冷却，时间充裕可放在室温下慢慢冷却；也可直接在室温冷却10min后，用自来水流水冲洗冷却，但不可直接在自来水下冲洗冷却。
7.封闭：3% H2O2中浸泡10min，去除内源性的过氧化氢酶。
8.冲洗：清水冲洗，PBST清洗两次，摇床上3min/次。
（摇床可以清洗的更干净）9.封闭：封闭液（3% FBS或3% BSA或10%山羊血清）室温下封闭1h。
10.冲洗：PBST清洗三次，摇床上3min/次。
免疫组化实验步骤免疫组化是一种常用的实验技术，用于检测蛋白质的存在和定位。
其步骤包括样本制备、抗原去原、阻断试验、一次抗体处理、二次抗体处理、显色和镜检。
下面将详细介绍每个步骤：1.样本制备：收集需要检测的样本，可以是细胞、组织或体液。
样本收集后，需要进行固定和切片处理，以保持细胞和组织结构的完整性。
2.抗原去原：蛋白质在组织中可能会被结构和其他因素影响，使其在免疫组化实验中难以被检测到。
因此，需要进行抗原去原处理。
常用的方法有热处理、酸碱处理、酶解处理等。
3.阻断试验：细胞和组织常常会存在非特异性结合位点，会使得后续的免疫反应变得模糊不清。
为了减少这种非特异性结合，需要进行阻断试验。
常用的阻断试验方法有牛血清白蛋白（BSA）、动物血清等。
4.一次抗体处理：在一次抗体处理步骤中，需要准备与目标蛋白质特异性结合的一次抗体。
将制备好的一次抗体加入样本中，使其与目标蛋白质发生反应，并形成抗原抗体复合物。
5.二次抗体处理：一次抗体只能与抗原结合，无法提供光学信号。
因此需要加入与一次抗体结合的二次抗体，该二次抗体与荧光物质或酶偶联，可以提供可视化信号。
常见的二次抗体有HRP（辣根过氧化物酶）、荧光染料等。
6.显色：通过加入合适的显色底物，可以使得与二次抗体结合的酶产生可见的颜色反应。
常用的显色底物有DAB（3,3'-二氨基联苯），其在酶的作用下会产生棕色的显色产物。
7.镜检：最后一步是使用光学显微镜对样本进行观察和分析。
通过镜检可以确定抗原存在的位置和分布情况，并对结果进行定量分析。
总结：免疫组化是一种确定蛋白质存在和分布的重要实验技术。
通过以上步骤的顺序操作，可以获得可靠的结果。
实验人员需要熟悉每个步骤的操作方法，并根据实验样本的要求进行调整和优化，以获得准确和可重复的结果。
免疫组化免疫组织化学的概念：免疫组化是利用抗原与抗体特异性结合的原理，通过化学反应使标记抗体的显色剂(荧光素、酶、金属离子、同位素) 显色来确定组织细胞内抗原(多肽和蛋白质)，对其进行定位、定性及定量的研究，称为免疫组织化学。
免疫组化实验所用的组织和细胞标本：实验所用主要为组织标本和细胞标本两大类，前者包括石蜡切片（病理大片和组织芯片）和冰冻切片，后者包括组织印片、细胞爬片和细胞涂片。
其中石蜡切片是制作组织标本最常用、最基本的方法，对于组织形态保存好，且能作连续切片，有利于各种染色对照观察；还能长期存档，供回顾性研究；石蜡切片制作过程对组织内抗原暴露有一定的影响，但可进行抗原修复，是免疫组化中首选的组织标本制作方法抗原修复——原因：常规的石蜡切片标本均用甲醛固定，结果使得：-抗原性物质形成醛键、羧甲键而被封闭了部分抗原决定簇；-蛋白之间发生交联而使抗原决定簇隐蔽。
*要求：在染色时，需要先进行抗原修复或暴露，即将固定时分子之间所形成的交联破坏，而恢复抗原的原有空间形态。
进行抗原暴露和修复的原则：1、寻找抗体说明的有关信息2、如无信息可先不经处理做免疫组化3、如染色结果呈阴性或阳性结果不理想，可用酶消化4、如还不理想用高温办法处理5、如再不理想可用酶和高温相结合处理6、如仍然是阴性结果，可能该抗体质量有问题。
常用的抗原修复方法：微波修复法，高压加热法，酶消化法，水煮加热法1．柠檬酸缓冲液高温高压抗原修复法（1）适用范围：适用于大量中性福尔马林固定、石蜡包埋组织切片的抗原修复，其效果优于微波修复法和直接煮沸修复法。
（2）仪器设备：普通家用压力锅、电炉、不锈钢或耐高温塑料切片架。
（3）试剂：0.01M 柠檬酸型缓冲液，pH6.0。
（3）操作步骤：①常规组织切片经二甲苯脱蜡、梯度酒精水化至水，待用；②取一定量0.01M柠檬酸盐缓冲液pH6.0（800～1000ml）于压力锅中，加热直至沸腾；将脱蜡水化后的组织切片置于不锈钢或耐高温塑料切片架上，放入已沸腾的缓冲液中，盖上锅盖，扣上压力阀，继续加热至喷气，开始计时1－2分钟后，压力锅离开热源，冷却至室温（稍冷后，可在自来水龙头下加速冷却），取出切片，先用蒸馏水冲洗两次，之后用PBS（pH7.2－7.4）冲洗两次，每次3分钟。
简述免疫组化实验流程及注意事项下载温馨提示:该文档是我店铺精心编制而成，希望大家下载以后，能够帮助大家解决实际的问题。
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(四) 注意事项1. 正式试验时，应分别以阳性对照与阴性对照控制试验条件，待检样品应作一式二份，以保证实验结果的准确性。
有时本底较高，说明有非特异性反应，可采用羊血清、兔血清或B SA等封闭。
2. 在ELISA中，进行各项实验条件的选择是很重要的，其中包括:(1) 固相载体的选择：许多物质可作为固相载体，如聚氯乙烯、聚苯乙烯、聚丙酰胺和纤维素等。
其形式可以是凹孔平板、试管、珠粒等。
目前常用的是40孔聚苯乙烯凹孔板。
不管何种载体，在使用前均可进行筛选：用等量抗原包被，在同一实验条件下进行反应，观察其显色反应是否均一性，据此判明其吸附性能是否良好。
（2) 包被抗体(或抗原)的选择：将抗体(或抗原)吸附在固相载体表面时，要求纯度要好,吸附时一般要求PH在9.0～9.6之间。
吸附温度，时间及其蛋白量也有一定影响,一般多采用4℃18～24小时。
蛋白质包被的最适浓度需进行滴定：即用不同的蛋白质浓度(0.1、1.0和10μg／ml等)进行包被后，在其它试验条件相同时，观察阳性标本的OD值。
选择OD值最大而蛋白量最少的浓度。
对于多数蛋白质来说通常为1～10μg／ml。
(3) 酶标记抗体工作浓度的选择：首先用直接ELISA法进行初步效价的滴定(见酶标记抗体部份)。
然后再固定其它条件或采取“方阵法”(包被物、待检样品的参考品及酶标记抗体分别为不同的稀释度)在正式实验系统里准确地滴定其工作浓度。
(4) 酶的底物及供氢体的选择：对供氢体的选择要求是价廉、安全、有明显地显色反应，而本身无色。
有些供氢体(如OPD等)有潜在的致癌作用，应注意防护。
有条件者应使用不致癌、灵敏度高的供氢体，如TMB和ABTS是目前较为满意的供氢体。
底物作用一段时间后，应加入强酸或强碱以终止反应。
通常底物作用时间，以10-30分钟为宜。
底物使用液必须新鲜配制，尤其是H2O2在临用前加入。
常见问题处理：免疫组化常见问题的处理当免疫组化染色没有出现预期结果时，应系统地查找原因，而每一次只能排除一种可能的原因。
免疫组化实验安全操作及保养规程免疫组化实验是一种常见的生物实验方法，适用于研究细胞、组织和生物分子中的蛋白质、抗原、受体等成分。
由于实验过程中使用的试剂和仪器具有一定危险性，因此必须遵守严格的操作规程，保证实验过程的安全性。
实验前的准备工作在进行免疫组化实验之前，需要对操作环境和实验材料进行准备工作，以保证实验结果的可靠性和安全性。
1. 操作环境准备实验操作室应该保持干净、整洁，照明充足，通风良好，避免有光、霉、水等因素影响实验。
实验室的桌面、器皿、设备和工具等应当进行彻底清洁和消毒，以避免杂质和污染对实验结果的影响。
2. 实验材料准备实验中需要使用的试剂、仪器和材料等应当选择高质量、纯度高、新鲜的。
对于已经开启的试剂或精制纯化的试剂，需要进行贴标签、标注到访日期及有效期等细节行政工作，并存储在恰当的环境中。
对于易燃、危险、腐蚀性等试剂，应当按照标签上的提示来使用和储存。
实验操作规程1. 实验前的准备工作在进行实验的过程中，需要进行一些准备工作，以确保实验操作的安全性和效果。
1.1 确认工作计划。
在进行实验之前，需要准确确认各项工作任务及操作步骤，制定完备的计划；1.2 了解操作材料。
事先应该对实验所用材料进行充分的了解，确认试剂品牌、浓度、储存条件等；1.3 安全措施准备。
事先做好实验操作中可能出现的事故应急预案，并准备好包括防护手套、防护面罩、实验室长袍、安全鞋等安全防护设备；1.4 操作台面准备。
在操作过程中，准备好所需的实验器皿（包括台盘、离心管等）、显微镜镜片、吸管等等。
2. 操作注意事项在进行免疫组化实验过程中，需要注意如下事项：2.1 严格保持操作技能的标准. 实验人员应当具备一定的实验操作技能，并开展专业工作前进行技能测评；2.2 实验室的基本卫生防护：实验人员每日早晚必须进行体温检测，佩戴口罩，严格按照个人防护要求操作。
实验器材的消毒和洗涤。
对于特殊实验室要求的实验操作，需要进行进一步的防护措施；2.3 操作前的试剂准备. 在进行实验之前，需要先将需要使用的试剂进行准备、调配、稀释等操作，并严格遵守生物实验室规定的标准操作；2.4 仪器的维护。
dab显色原理DAB显色原理。
DAB（3,3'-二氨基联苯）是一种常用的组织化学显色试剂，广泛应用于免疫组织化学染色中。
DAB显色原理是指在酶标记的免疫组化试剂中，酶与底物作用，产生显色反应，使得目标蛋白的位置呈现出棕色或棕黄色。
下面将详细介绍DAB显色原理及其相关内容。
DAB显色原理的基本过程是，首先，酶标记的抗体与目标抗原结合形成抗原-抗体复合物；其次，将组织切片或细胞涂片放入DAB显色液中，DAB显色液中的底物与酶催化剂发生反应，生成棕色的终产物，从而实现目标蛋白的显色。
DAB显色原理的主要步骤包括，准备试样、固定组织或细胞、脱水、透明化、抗原修复、封闭非特异结合、孵育一抗、孵育二抗、显色、脱水、封片。
其中，显色过程是DAB显色原理的关键步骤，也是最终实现目标蛋白显色的关键环节。
DAB显色原理在免疫组织化学染色中的应用非常广泛，其优点主要包括，显色产物稳定、颜色清晰、对比度高、可视化效果好。
因此，DAB显色原理成为了免疫组织化学染色中最常用的显色方法之一。
在进行DAB显色实验时，需要注意以下几点，首先，严格按照实验步骤进行，避免操作失误；其次，控制好显色时间，避免显色过度或显色不足；最后，对显色后的样品进行封片处理，保证显色效果的稳定性和持久性。
总的来说，DAB显色原理是一种简单、稳定、可靠的免疫组织化学显色方法，广泛应用于科研和临床实验中。
掌握DAB显色原理，能够帮助研究人员准确、清晰地观察和分析目标蛋白的表达情况，为科研工作提供有力的支持。
希望本文对DAB显色原理有所帮助，同时也希望读者在实际操作中能够注意相关细节，确保实验结果的准确性和可靠性。
现成组织芯片进行免疫组化的方法学一、前言免疫组织化学（IHC）是一种用于在组织水平检测特定蛋白质的方法，它对于许多生物医学研究领域，包括肿瘤学、神经科学和免疫学等，具有重要意义。
本方法提供了现成组织芯片的免疫组织化学处理步骤，旨在帮助研究人员更有效地分析组织样本中的蛋白质表达。
二、材料和试剂1. 组织芯片2. 抗体（根据需要选择适当的抗体）3. 生物素化二抗4. 辣根过氧化物酶标记的链霉亲和素5. DAB显色试剂盒6. 苏木精染液（用于复染细胞）7. 柠檬酸抗原修复液8. 封闭液（如血清或BSA）9. 显微镜10. 图像分析软件（如ImageJ）三、方法步骤1. 抗原修复：将组织芯片标本进行抗原修复，常用的方法有高温高压法或柠檬酸缓冲液法。
2. 血清或BSA封闭：在抗体孵育之前，使用封闭液覆盖组织芯片标本，以减少非特异性背景染色。
3. 抗体孵育：将适当抗体的生物素化二抗与特异性抗体结合，并进行孵育。
注意选择与抗体最佳比例的二抗浓度。
4. 链霉亲和素-HRP复合物的孵育：使用辣根过氧化物酶标记的链霉亲和素与已与抗体结合的生物素化二抗结合，并进行孵育。
5. DAB显色：使用DAB显色试剂盒进行显色反应，通常在显微镜下观察并确定适当的显色时间。
6. 苏木精复染：使用苏木精染液进行细胞核的复染。
7. 透明和封片：将标本进行透明和封片，以便进行观察和分析。
8. 图像分析：使用适当的图像分析软件对组织芯片进行图像分析，以确定特定蛋白质的表达情况。
四、结果解释与讨论1. 结果解释：通过观察和分析免疫组织化学染色结果，可以确定特定蛋白质在组织中的表达情况。
注意区分特异性染色和背景染色，并比较不同组织和/或不同病例之间的表达差异。
2. 讨论：讨论结果的统计学意义、临床意义和应用前景。
同时，还可以讨论可能存在的局限性，如样本选择、抗体性能和实验条件等因素的影响。
五、注意事项与实验条件调整1. 注意事项：在进行免疫组织化学实验时，应注意避免污染、确保严格的实验室卫生标准，以及妥善处理实验废弃物。
免疫组化入门实验操作1.一、实验目的:2.了解免疫组化基本原理。
3.了解免疫组化实验操作及注意事项。
4.免疫组化结果判定。
通过实验, 让学生熟悉免疫组化操作流程及注意事项, 对抗原抗体结合、抗原修复和酶催化底物显色进行研究。
要求学生通过查阅文献, 在归纳、对比、总结的基础上对免疫组化有进一步的了解。
二、实验原理:三、实验材料:一抗: CD5.CK8、Ki671.二抗: MaxVision32.其它：柠檬酸抗原修复液、过氧化物酶阻断剂、PBS缓冲液、DAB.孵育盒、染色架、苏木素、盖玻片、冲洗瓶、中性树胶, 孵育盒。
3.四、实验步骤:4.脱蜡水化5.二甲苯5min, 二甲苯5min, 二甲苯5min, 无水乙醇2min, 无水乙醇2min, 95%酒精2min, 85%酒精2min, 自来水冲洗。
6.抗原修复7.高压锅中加入1200mL柠檬酸修复液, 电磁炉煮沸后放入切片, 扣紧锅盖,功率调至800W, 至压力阀均匀喷气后计时 1.5min, 移开高压锅室温冷却10min, 自来水冷却。
8.过氧化物酶阻断9.修复结束后, 流水冲洗干净, 除去自来水, 在离组织3mm处用免疫组化油笔画圈或用纸巾擦干组织外残留的液体, 滴加50 μL（一滴）过氧化物酶阻断剂, 室温孵育10min, PBS冲洗3×3min。
10.一抗11.甩去PBS, 纸巾擦干组织3mm外的残留液体, 每张切片加50 μL（一滴）相应一抗, 室温下孵育60分钟, PBS冲洗3×3min。
12.二抗13.甩去PBS, 纸巾擦干组织3mm外的残留液体, 每张切片加50 μL（一滴）MaxVisionTM试剂, 室温下孵育30分钟, PBS冲洗3×3min。
14.DAB15.甩去PBS液, 纸巾擦干组织3mm外的残留液体, 每张切片加50 μL（一滴）新鲜配制的DAB, 显色5分钟, 自来水冲洗。
16.苏木素复染17.每张切片滴加50 μL（一滴）苏木素, 20-30秒后自来水冲洗30s以上, 或浸泡于PBS中30s以上再自来水冲洗。
免疫组化操作步骤（一）、仪器设备1. 18cm不锈钢高压锅或电炉或用微波炉.2. 水浴锅（二）、试剂1. PBS缓冲液（ph7.2―7.4）：NaC137mmol/L，KCl2.7mmol/L ,Na2HPO4 4.3mmol/L, KH2PO4 1.4mmol/L.2．0.01mol/L柠檬酸钠缓冲液（CB,ph6.0,1000ml）：柠檬酸三钠3g,柠檬酸0.4g。
3．0.5mol/L EDTA缓冲液（ph8.0）：700ml水中溶解186.1g EDTA& 8226;2H2O,用10mmol/L NaOH调至ph8.0,加水至1000ml.4. 1mol/L的TBS缓冲液（ph8.0）：在800ml水中溶解121gTris碱，用1N的HCl调至ph8.0, 加水1000ml。
5. 酶消化液：a. 0.1%胰蛋白酶：用0.1%CaCl 12(ph7.8)配制。
b.0.4%胃蛋白酶液：用0.1N的HCl配制。
6. 3%甲醇―H2O2溶液：用30%H2O2和80%甲醇溶液配制7.风裱剂：a. 甘油和0.5mmol/L碳酸盐缓冲液（ph9.0–9.5）等量混合b 油和TBS(PBS)配制8．TBS/PBS PH9.0–9.5,适用于荧光纤维镜标本;ph7.0-7.4适合光学纤维标本（三）、操作流程1、脱蜡和水化：脱蜡前应将组织芯片在室温中放置60分钟或60℃恒温箱中烘烤20分钟。
a 组织芯片置于二甲苯中浸泡10分钟,更换二甲苯后在浸泡10分钟b 无水乙醇中浸泡五分钟c 95%乙醇中浸泡五分钟d 75%乙醇中浸泡五分钟2、抗原修复：用于福尔马林固定的石蜡包埋组织芯片：A 抗原热修复a 高压热修复在沸水中加入EDTA(ph8.0)或0.01m枸橼酸钠缓冲溶液（ph6.0）.盖上不锈钢锅盖，但不能锁定。
将玻片置于金属染色加上，缓慢加压，是玻片在缓冲液中浸泡五分钟，然后将盖子锁定，小阀门将会升起来。
免疫组化实验没学好？来看CST中国为你整理的操作要点免疫组化，简称IHC，是应用抗原与抗体特异性结合的原理，通过化学反应使标记抗体的显色剂（荧光素、酶、金属离子、同位素）显色，对组织细胞内抗原进行定位、定性及相对定量研究的实验方法。
包括石蜡切片的免疫组化技术（IHC-P）和冰冻切片的免疫组化技术（IHC-F），今天主要讲的是IHC-P。
免疫组化操作要点①标本固定——不仅仅是“切一切”和“泡一泡”温柔地取材：大刀阔斧取材的同时，视组织如珍宝，莫挤压组织，轻柔取材和镊取。
尽量避开坏死区域。
太大太厚的组织不利于均匀一致的固定，实质组织取材厚度应小于5mm。
新鲜的固定液：固定液10%中性缓冲福尔马林(NBF) 需新鲜配置，商用型固定液注意其标注的有效期，避免使用过期变质的固定液。
充分及时地固定：固定液要充足，其与组织的体积比最好大于等于20倍；取材后即刻固定。
固定时需将瓶口封住，避免甲醛挥发。
组织的固定时间不宜过长，一般过夜（12-24h）即可。
免疫组化操作要点②修复大法——不仅仅是“煮一煮”微波炉修复：简单易行效果好，CST推荐使用微波炉完成修复。
合适的修复液：根据抗体说明书使用合适的修复液。
用柠檬酸修复后，切片需浸泡在修复液中，自然冷却；而用EDTA修复后，切片可直接从修复缸中取出，直接进行下一步。
注：使用不同的修复方式和不同生产商的抗体检测人肺癌组织中EGFR的表达。
第一排为CST 的EGF Receptor (D38B1) XP® Rabbit mAb（#4267），EDTA的修复方式明显优于柠檬酸盐及胃蛋白酶，故在该抗体说明书中，标注了使用EDTA修复进行免疫组化实验。
免疫组化操作要点③对的抗体，对的使用——不仅仅是“买买买和加加加”种属和应用范围：确定该抗体可检测所需种属（Reactivity）的石蜡切片上完成组化实验（Application：IHC-P）。
稀释液和稀释比：查看抗体说明书，使用正确的一抗稀释液和稀释比。
避免化学技术使用中的样品污染与交叉污染为了确保化学实验和研究的准确性和可靠性，避免样品污染与交叉污染是至关重要的。
样品污染和交叉污染会导致数据失真、实验结果无法复制，甚至对实验室的人员和环境造成危害。
本文将讨论一些可以采取的措施，以减少样品污染和交叉污染的发生。
首先，在进行实验之前，实验人员应该充分了解和掌握实验所需的装备、仪器的使用方法及其相关特性。
特别是对于常用的荧光染料、酶标记等试剂，实验人员应该了解其适用范围和储存要求。
只有这样，才能针对不同的实验需求选择合适的试剂和材料。
其次，实验人员应该注意在操作时，尽量避免直接接触样品或试剂。
不仅可以减少人工带来的污染，还可以避免可能存在的交叉污染情况。
在操作过程中，应尽量使用无菌技术，例如佩戴手套、使用无菌器具等，以减少外源性微生物污染。
此外，实验人员应该在每个实验步骤之间进行适当的清洁和消毒。
这包括清洗仪器和玻璃器皿，更换实验台面或使用消毒剂擦拭，以防止交叉污染。
不同实验之间，应尽量避免重复使用同一批试剂和样品，或者事先对其进行充分的消毒处理。
另外，对于涉及RNA、DNA等核酸材料的实验，更需要格外小心。
由于核酸的异常增长会导致实验结果的不准确性，所以在样品采集、保存、提取和PCR扩增过程中，必须严格遵守相应的操作规程。
在RNA和DNA操作中应使用无菌管、无菌枪、无菌操作间等防止交叉污染的装备。
此外，实验室内部的管理也是减少污染的重要环节。
实验室应建立严格的进货和验收制度，确保所使用的试剂和材料符合质量要求。
同时，应定期清理实验室环境，保持实验区域的整洁和卫生。
定期检查和维护实验设备，确保其正常运转，防止设备本身的污染影响样品。
最后，重要的一点是建立有效的记录和文档管理系统。
实验人员应及时记录并维护实验所用的试剂批次、产地以及相关使用信息。
这不仅有利于追溯实验结果的原因，还可以帮助人员更好地了解试剂的性能及使用情况，并及时更新或更换可能存在问题的试剂。
免疫组化步骤和注意事项免疫组化是一种重要的实验技术，用于鉴定细胞、组织或生物样本中特定抗原的分布和表达情况。
它可以通过对特定抗原与抗体的特异性结合来检测目标分子的存在和定位。
下面将介绍免疫组化的步骤和注意事项。
免疫组化的主要步骤包括抗原脱蜡、抗体反应、显色和染色。
1. 抗原脱蜡：免疫组化的第一步是将组织样本或细胞脱脂、脱蜡和重水化，以去除蜡质，并使抗体更容易与目标抗原反应。
2. 抗体反应：将脱蜡的组织样本或细胞块通过抗原修复处理，以恢复抗原的免疫反应性。
然后，将免疫抗体与待检测的抗原反应，形成免疫复合物。
免疫抗体可以是单克隆抗体或多克隆抗体，可以与组织或细胞中的特定抗原高度特异性地结合。
3. 显色：免疫复合物形成后，可以使用标记有酶（如辣根过氧化物酶或碱性磷酸酶）或荧光标记的二抗来检测免疫复合物。
在酶法中，可添加草酰胺基苯酸（DAB）或硫代硝基羟基苯并啶（NBT/BCIP）等底物以产生可见的色素沉积。
在荧光法中，免疫复合物被激光器或荧光灯激发后，会发出特定颜色的荧光信号。
4. 染色：完成显色后，可以通过核染色（如用伊红、伊红和伊蓝）来观察细胞核的形态特征，以配合免疫标记物的定位。
虽然免疫组化是一种有价值的技术，但在实施过程中也需要注意一些问题：1. 选择合适的抗体：在进行免疫组化实验时，选择特异性高、效价好的一抗抗体非常重要。
一抗抗体的选择应基于抗原的特异性和病变的病理生理特性。
2. 优化抗体浓度：免疫组化实验中，抗体浓度的选择是关键因素。
过高的抗体浓度会导致非特异性的染色，而过低的浓度则无法检测到目标抗原。
3. 优化抗原修复处理：抗原修复处理对于免疫组化的成功非常重要。
选择合适的抗原修复方法可以增强组织或细胞中的抗原的免疫反应性。
4. 阴性对照和阳性对照：为了验证实验的可靠性，每次免疫组化实验都应包括阴性对照和阳性对照。
阴性对照不包含待检测的抗原，而阳性对照则确保抗体和显色试剂的正常工作。
5. 切片质量：免疫组化实验的结果直接受到切片质量的影响。
免疫组化实验步骤、常见问题及解决方案免疫组化实验虽然看上去非常简单，然而做起来却容易“花样百出”，让实验人员的精神备受摧残。
因此，今天小编在这里跟大家详细介绍一下免疫组化实验的步骤以及常见问题和解决方案，让大家的免疫组化实验更加顺畅。
免疫组化实验主要包括石蜡切片的免疫组化技术(IHC-P)和冰冻切片的免疫组化技术(IHC-F)，今天主要讲的是IHC-P。
实验步骤详解：1，取材颈椎脱臼法处死小鼠，打开腹腔，剪取所需的组织，切取的组织块不宜太大，以利于固定剂穿透。
注意取材动作要迅速，不宜作太久的拖延以免组织细胞的成分、结构等发生变化，切片材料应根据需要观察的部位进行选择，尽可能不要损伤所需要的部分。
2，切片制备(1)固定将切好的组织(<5mm3)用生理盐水组织洗一下，立即投入4%多聚甲醛(PFA)或10%中性福尔马林(NBF)中固定，根据组织大小和松密程度室温4-48h。
若取材是小鼠大脑或神经组织，可以采用灌流的方式进行固定。
(2)洗涤材料经固定后,水或酒精(若采用含有苦味酸的固定剂bouin，就用酒精洗涤)冲洗，数小时或过夜，目的是去除组织内固定液及结晶沉淀。
(3)脱水目的是因为透明剂多是苯类，苯和水不互溶，用到的材料是酒精，将组织依次经70%、80%、90%各级乙醇溶液脱水，各30min，再放入95%、100%各2次，每次20min。
(4)透明由于乙醇与石蜡不相溶，而二甲苯既能溶于乙醇又能溶于石蜡，所以脱水后还要经过二甲苯以过渡。
当组织中全部被二甲苯占有时，光线可以透过，组织呈现出不同程度的透明状态。
一般是用纯酒精、二甲苯等量混合液浸润材料1-2h，再换纯透明剂(二甲苯、苯、氯仿、正丁醇)。
(5)浸蜡和包埋透蜡的目的是除去组织中的透明剂(如二甲苯等)，使石蜡渗浸到组织内部达到饱和程度以便包埋。
先放入二甲苯和石蜡各半的混合液，再放入熔化的石蜡中浸润，透蜡时间根据组织大小而定。
浸蜡之后放入包埋盒用石蜡进行包埋。
免疫组化实验注意事项
免疫组化实验注意事项如下：
1. 样本处理：确保样本的新鲜度，避免长时间的暴露在空气中，以防样本的退化。
同时，样本的切割要尽可能的薄，以便于抗体的渗透。
2. 抗体选择：选择特异性强、质量好的抗体，以保证实验结果的准确性。
同时，要注意抗体的稀释比例，过高或过低的稀释比例都可能影响实验结果。
3. 染色过程：染色过程中要保持湿润，避免干燥。
同时，要避免过度染色，以免背景过深，影响结果的观察。
4. 洗涤过程：洗涤过程要充分，以去除未结合的抗体，减少非特异性染色。
5. 对照设置：实验中应设置阳性对照和阴性对照，以验证抗体的特异性和实验操作的正确性。
6. 结果解读：结果的解读要结合实验设计、样本特点和染色结果，不能仅凭单一指标进行判断。
7. 实验记录：详细记录实验过程和结果，以便于后期的数据分析和问题追溯。
8. 实验室安全：遵守实验室安全规定，正确使用和处理化学试剂，避免可能的安全风险。
手册执行。
如静脉采血时的采血部位、血液的采取顺序、抗凝剂的选择、标本送捡及标本处理等,以保证血液分析结果的准确可靠。
医护人员对标本的采集、储存、处置等应均不发生非常的变质和损坏。
例如在进行血液常规分析时,可能影响测定结果的因素:如标本编错号、标本溶血、用错抗凝剂、形成血肿、血液浓缩等等。
实验室人员在接收标本时应详细记录其状态,对标本有疑问或不符合规定要求时,尽快与临床方面联系或拒收。
3 明确导致检测结果发生差错的原因,是保证检测质量的基础
毫无疑问,饮食、应激、患者准备、锻炼、昼夜变化等诸因素以及某些生理状态如怀孕等,均可影响实验室检查结果,甚至出现其他的生理变化,当患者的生理状态发生改变时,实验室检验结果就可能发生异常,除了这些生理因素(饮食、餐后禁食、应激、患者准备、锻炼、周期性变异、怀孕、药物等)外,与标本留取有关的而易导致实验室结果异常的原因有:患者的标本不具有代表性,其主要与标本的收集技术有关,包括止血带的使用、静脉血污染、抗凝剂和防腐剂的污染等。
标本内的一种或多种物质的浓度可能在收集后发生改变,这些变化主要是由于标本自身的新陈代谢所致。
包括标本的代谢、酶的影响及血液病的影响等,前者以溶血为代表,众所周知,溶血不仅可以释放红细跑的内容物,而且血红蛋白还可以直接干扰许多不同的化学反应,对于电解质的检测如钠和氯,出现称为“假低钠血症”的严重错误等。
后者以标本放置时间过长,导致细胞开始破裂,释放出包括血红蛋白、酶、铁等许多物质,血中葡萄糖和氧的浓度下降,酸性产物及CO2增多等,在临床检验实践中,应尽量避免此类差错的发生,确保检验质量。
总之,检验质量取决于从标本留取到检验报告发出前的每一个细致环节,只有严格遵守上述各个环节,才算是一个完整的质量控制体系,才能保证实验的科学性、准确性,及时为临床提供可靠的诊断依据更好地为医学科学的发展服务。
(收稿日期:2007203217)
免疫组化实验操作中减少DAB污染心得
王 萍,宋 亮
(陕西中医学院,陕西咸阳712046)
[关键词]实验;污染;处理方法
[中图分类号]R446.61 [文献标识码]C [文章编号]167125098(2007)1722332201
Exper ien ce of R educ i n g DAB P ollut ion i n I mm un oh istochem ica l Exper i m en t O pera t ion
WA NG Ping,S ONG L iang
(Sha anxi College of Traditiona l Chinese Medi cine,X ianyang,Shaanxi712046,China)
Key wor d s:Experi ment;Pollute;D is posal me thod
免疫组化主要有三种:免疫荧光细胞化学技术,用荧光素标记抗体,在荧光显微镜下观察;免疫酶细胞化学技术,酶标记抗体加显色底物显色,在光学显微镜下观察;免疫金银及铁标记技术,用胶体金标记抗体,在光镜和电镜下观察。
由于免疫荧光细胞化学技术存在非特异性染色,结果判定的客观性不足,免疫金法操作中注意事项繁琐,所以基础研究以及临床试验一般选择免疫酶细胞化学技术。
显色是免疫酶组化技术中的关键步骤之一,显色剂一般选择DAB(3,32二氨基联苯胺),因为DAB呈色反应产物为棕色,敏感度高,定位清晰,且可以经过梯度酒精脱水二甲苯透明,中性树胶封片,适于长期保存[1]。
但是DAB有致癌潜在可能,所以在实验室操作中应尽量减少DAB的污染。
本文简单介绍实验过程中常用的浓缩型DAB显色剂减少污染的方法。
1 专用操作台以及实验用具
免疫组化显色操作有固定的操作台并且尽量减少操作面积,操作前在工作台上铺好一次性台布,最好是白色塑料台布,这样不容易污染工作台并且易于观察染色过程中颜色的变化,利于及时中止反应。
用一次性EP管配备和混匀DAB,有固定的放置EP管的试管架以及放置移液器的架子。
用显微镜观察DAB显色结果时,滴加DA B较多或调节镜头时D B容易污染镜头,所以应有固定的显微镜。
实验室配有显色专用其他容器如染缸、切片架等。
其他如手套、枪头等为一次性,若有条件的实验室应该配有专用的移液器。
2 严格的实验操作方法
显色前带好手套,穿工作服,在整个操作过程中始终保持一只手是相对干净的。
用相对干净的手拿移液器来拿取、配匀和滴加DAB。
移液器滴加DAB后及时放置于移液器架子。
中止染色时用流水冲洗,将中止的切片放置于染缸中仍然用流水冲洗。
待全部显色,冲洗完毕后一直用流水冲洗水池。
整个实验过程要求仔细迅速,尽量减少DA B接触时间,工作人员与实验台保持一定的距离。
3 污染物的处理
DA B显色完后,及时将所使用的手套、台布、EP导管、枪头等一次性处理污染物包装好放置于容器内,用硫酸加以处理。
对于污染的台面、显微镜、移液器等器械擦洗干净,放置到固定的位置并且注明为污染物,防止污染他人。
4 加大宣传,严格管理
大力宣传D AB的潜在致癌性,并且制定规范的操作方法;实验室由专人负责;凡进行实验的人员定期培训,多交流多学习,不断积累经验,将注意事项放置醒目地方。
参考文献:
[1] 王伯沅.病理学技术[M].北京:人民卫生出版社,2000:3792
458.
(收稿日期2323)作者简介王萍(—),女,陕西大荔人,毕业于西安交通大学。
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32实用医技杂志2007年6月第14卷第17期(旬刊) J P MT,June.2007,Vo l.14,No.17(Issued Every Ten Days)
A:200702
:1979。
