(整理)免疫荧光非特异性染色的消除方法
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免疫荧光实验出现的问题及处理方案
免疫荧光实验出现的问题及处理方案一、引言免疫荧光实验是一种重要的实验方法，广泛应用于生物医学研究中。
然而，在实验过程中，我们时常会遇到一些问题，如背景信号过高、染色效果不理想等。
本文将针对这些常见问题进行分析，并提供相应的处理方案。
二、问题及处理方案2.1背景信号过高在免疫荧光实验中，背景信号过高是常见的问题之一，它会影响到我们对目标物质的检测和分析。
以下是一些可能导致背景信号过高的原因及相应的处理方案：非特异性结合1.：在实验中，可能存在一些非特异性抗体或试剂与样品中的其他成分结合，导致背景信号增大。
解决该问题的方法是使用合适的阴性对照，如对照抗体、缺乏特定抗原的样品等。
未充分洗涤 2.：洗涤步骤不充分可能导致残留的非特异性结合物增多，进而使背景信号过高。
解决该问题的方法是增加洗涤次数，并使用足够的缓冲液来洗涤样品。
荧光染料问题3.：某些荧光染料本身可能存在背景信号较高的情况。
在选择荧光染料时，应注意避免选择背景信号较高的染料。
在实验中，可以尝试不同的荧光染料以减少背景信号。
2.2染色效果不理想除了背景信号过高外，染色效果不理想也是在免疫荧光实验中常见的问题。
以下是一些可能导致染色效果不理想的原因及相应的处理方案：抗体不合适1.：选择不合适的抗体可能导致染色效果不理想。
在实验中，应根据样品的特点选择适当的抗体，并进行充分的优化。
如果抗体来源有问题，应尝试使用其他来源的抗体。
染色条件不合适2.：染色条件的温度、时间等因素对染色效果有重要影响。
如果染色效果不理想，可以尝试调整染色条件，如改变温度、延长或缩短染色时间等。
样品制备问题 3.：样品制备不当可能导致染色效果不理想。
在实验前，应充分准备样品，并采用合适的固定方法和处理步骤，以确保样品的完整性和稳定性。
三、其他问题及处理方案除了背景信号过高和染色效果不理想外，免疫荧光实验还可能存在其他问题，如溶液配制错误、仪器故障等。
以下是一些可能出现的问题及相应的处理方案：溶液配制错误1.：如果实验溶液配制错误，可能会对实验结果产生不利影响。
免疫荧光非特异性染色的消除方法
免疫荧光非特异性染色的消除方法免疫荧光非特异性染色是在进行免疫荧光染色实验时常常出现的一种问题。
它指的是在一些情况下，由于实验操作不当或试剂配制不当等原因，导致荧光信号出现在与目标分子无关的细胞或组织区域上。
这种非特异性染色会严重影响实验结果的准确性和可解释性。
因此，为了得到可靠和准确的免疫荧光染色结果，研究人员需要采取措施来消除免疫荧光非特异性染色。
以下是一些常用的消除免疫荧光非特异性染色的方法：1.优化抗体浓度和孵育时间：非特异性染色常常与抗体过多或过长的孵育时间有关。
因此，在进行免疫染色实验前，应该对抗体的浓度和孵育时间进行严格的优化。
一般来说，应该根据厂家提供的建议，进行初步的实验，然后根据实验结果调整抗体浓度和孵育时间。
2.阻断非特异性结合位点：有些细胞或组织可能存在一定程度的非特异性结合位点，导致非特异性染色。
在这种情况下，可以使用特异性抗体前处理样本，以阻断非特异性结合位点。
常用的前处理方法包括用1%牛血清白蛋白（BSA）或非特异性抗血清预处理样本等。
3.优化固定条件：样本处理过程中的不恰当固定条件也可能导致非特异性染色。
所以，在固定样本的时候，应该选择适当的固定剂和固定时间，并避免过度固定。
4.混合多种报告物质：对于存在非特异性染色的样本，可以尝试混合多种报告物质来进行染色，以提高特异性。
常用的报告物质包括荧光标记的二抗、荧光标记的标记物等。
5.设置适当的阴性对照：在进行免疫染色实验时，应该设置适当的阴性对照来排除非特异性染色的可能性。
阴性对照是使用与目标分子无关的抗体或未激光的样品，可以通过对比阴性对照和实验样品的染色结果来判断是否存在非特异性染色。
总之，在进行免疫荧光染色实验时，消除非特异性染色是至关重要的。
通过优化抗体浓度和孵育时间、阻断非特异性结合位点、优化固定条件、混合多种报告物质和设置适当的阴性对照等方法，可以有效地消除免疫荧光非特异性染色，从而获得准确、可靠的实验结果。
消除肝组织免疫组化中非特异性显色的探讨
消除肝组织免疫组化中非特异性显色的探讨侯巧燕; 陈罡; 张美艳【期刊名称】《《华夏医学》》【年(卷),期】2005(018)001【摘要】目的 :初步研究加热抗原修复对内源性抗生物素蛋白结合物 (EABA)的影响 ,探讨蛋清液在封闭肝组织 EABA、消除非特异性显色中的作用。
方法 :采用免疫组化 SP法及蛋清液封闭法 ,对甲醛固定石蜡包埋的 30例肝细胞癌组织 ,30例门脉性肝硬化组织 ,10例肝脏海绵状血管瘤之周围正常肝组织进行 EABA检查。
结果 :1经甲醛固定石蜡包埋后肝组织中的 EABA被封闭。
2加热抗原修复可造成EABA暴露。
3EABA在正常肝组织、肝硬化组织及肝癌组织中都有分布 ,主要以颗粒状形式存在于胞质中 ,造成非特异性显色。
4 2 0 %蛋清液可封闭肝组织中的EABA,消除它对正常染色的干扰。
结论 :加热修复可使甲醛固定石蜡包埋组织中的EABA重新暴露 ,暴露的 EABA见于人体正常肝组织、肝硬化组织和肝癌组织中 ,因而对正常免疫组化染色可造成干扰 ;暴露的 EABA可被蛋清液封闭 ,以蛋清液消除肝组织中非特异性显色的方法经济便捷 ,效果良好。
【总页数】3页(P6-8)【作者】侯巧燕; 陈罡; 张美艳【作者单位】广西桂林临床病理诊断中心桂林医学院病理学教研室广西桂林541001【正文语种】中文【中图分类】R392.32; R392.33【相关文献】1.慢性乙型肝炎患者血清HBV DNA水平与肝组织病理及免疫组化关系探讨 [J], 郭西萍;冯红萍;李国军;钟基大;张继红;曹启军2.消除免疫组化非特异性染色方法研究(附60例分析) [J], 黄燕英;李燕辉;陈小岩3.快速消除胆色素在肝组织免疫组化检测中的应用 [J], 韩永;杨敏;李树林;周会芹;余琦4.免疫组化非特异性背景着色因素及其消除措施 [J], 齐新永5.乙肝血清HBVM与肝组织免疫组化关系探讨 [J], 罗光汉;周桂英;吴继周;江建宁;梁小明因版权原因，仅展示原文概要，查看原文内容请购买。
免疫荧光染色步骤
免疫荧光染色步骤
免疫荧光染色是一种常用的免疫组化技术，用于检测特定抗原在细胞或组织中的表达和定位。
以下是免疫荧光染色的基本步骤：
1. 取得标本：获取需要检测的组织或细胞样本，可以是固定的组织切片或涂片，或者是固定的细胞。
2. 抗原解发：如果样本中的抗原被掩盖或结合得过于紧密，需要进行抗原解发。
可以使用酶解方法或热解方法来解发抗原。
3. 阻断非特异性结合：使用非特异性结合抑制剂，如动物血清、牛血清白蛋白或BSA，来阻止未特异性抗体结合到样本上。
4. 抗体染色：加入特异性一抗，即针对目标抗原的初级抗体。
留样本在4°C或室温下与一抗孵育一段时间，充分结合。
5. 洗涤：用缓冲盐溶液或PBS洗涤样本，以去除未结合的初
级抗体。
6. 加入荧光标记的二抗：使用经荧光标记的二抗，即反应在初级抗体上的特异性抗体。
留样本在4°C或室温下与二抗孵育
一段时间，充分结合。
7. 洗涤：再次用缓冲盐溶液或PBS洗涤样本，以去除未结合
的二抗。
8. 盖玻片和封片：将样本转移到载玻片上并加盖玻片，可以加入抗褪色剂来保护荧光信号。
9. 观察与记录：使用荧光显微镜观察标本，并记录所观察到的荧光信号的位置和强度。
以上是免疫荧光染色的基本步骤，具体步骤可能会因实验目的和设备的不同而有所变化。
免疫组化非特异性染色太深怎么办？
免疫组化非特异性染色太深怎么办？本人从事免疫组化实验做了好多年了，刚开始做这方面实验，出现了不少问题，最让人头疼的就是非特异性背景染色问题。
经过多年的摸索和亲身实验，摸索出问题的症结所在，针对免疫组化中存在最常见的非特异性背景染色问题，给予一些本人的见解和经验总结，希望对做科研的工作者们一些帮助和指导，也希望各位专业人士能给予批评指正。
当然这些经验总结和问题的，离不开丁香园、小木虫、中华病理网以及舜百公司专业病理人员的指导和帮助，是这些网站以及专业公司的帮助下，让我受益颇多。
免疫组织化学技术是应用免疫学基本原理——抗原抗体反应，对组织或细胞内抗原或抗体物质定性和定位的组织化学技术。
组织的非特异性染色的机理很复杂,所以控制非特异性背景染色也不容易,现简单介绍一下：一、非特异性染色的识别：常出现在组织边缘、胶原纤维及血浆渗出处，坏死组织及固定不良的组织中心处。
表现为弥漫性，均匀性的背景染色。
也可以是随机分布的阳性反应产物点、团或块状。
二、非特异性染色的原因及避免方法：1. 静电吸附抗体是一种带负电荷的球蛋白，容易和带正电荷的组织相结合在用第一抗体前加制备第二抗体动物之非免疫血清封闭组织上的带电荷基团，从而除去与第一抗体的非特异性结合。
此法为最有效的方法。
如果还不可以的话可能蛋白质封闭不够或所用血清溶血。
2.内源性过氧化物酶红细胞，粒细胞的含量尤其高，镜下可以识别，不要将其当成阳性结果。
石蜡切片3%双氧水-甲醇溶液处理切片；3. 洗涤不彻底保证各步骤的PBS或TBS冲洗的时间和量，方法要得当，最好可以把切片放在装满洗液的染色盒内浸泡一段时间以确保充分清洗。
有一些人鉴于实验经费紧张，那吸管滴加标本上冲洗，这样很难保证冲洗的干净与否。
这实际是千里之堤，溃于蚁穴。
4. DAB显色反应时间过长最好是在显微镜下时时观察一避免显色回见过长而引起的非特异性染色背景5.一抗稀释液，可以在一抗稀释液内适当添加1%BSA或合适浓度的二抗来源的血清。
石蜡切片免疫组化染色步骤
石蜡切片免疫组化染色步骤 1、载玻片的处理： 抗原修复过程中，由于高温、高压、辐射等诸多因素的影响，极 易造成脱片。为保证试验的正常进行，可选用我公司提供的 ZLI-9001 APES、ZLI-9003 HistogripTM 或 ZLI-9005 Poly-L-Lysine 等几种试剂，对 已清洗的载玻片进行处理。具体方法如下： 1.1 APES： 现用现配。 将洗净的玻片放入以 1:50 比例丙酮稀释的 APES 中，停留 20~30 秒钟，取出稍停片刻，再入纯丙酮溶液或蒸馏水中涮 去未结合的 APES，置通风橱中晾干即可。用此载玻片捞片时应注意 组织要一步到位，并尽量减少气泡的存在，以免影响染色结果。 1.2 HistogripTM：将洗净的玻片放入以 1:50 比例丙酮稀释的 Histogrip 液中， 停留 1~2 分钟， 然后用双蒸水快速清洗三次， 室温干燥或 60oC 烤箱烘烤一小时，装盒备用。 1.3 Poly-L-Lysine：将洗净、干燥的载玻片放入以 1:10 比例去离子水稀 释的多聚赖氨酸溶液中，浸泡 5 分钟，60oC 烤箱烘烤一小时或室温 过夜干燥。装盒备用。试验中使用的器具均为非玻璃制品。 2、常用酶消化： 2.1 胰蛋白酶： 一般使用浓度为 0.05%~0.1%， 消化时间为 37℃、 10~40 分钟，主要用于细胞内抗原的显示。 2.2 胃蛋白酶：一般使用浓度为 0.4%，消化时间为 37℃、30~180 分 钟， 主要用于细胞间质抗原的显示， 如： Laminin （层粘蛋白） ， Collagen IV（IV 型胶原）等。
加入洗脱液一定量后，荧光抗体即向下移行，逐渐与存留于上端的游 离荧光素之间拉开明显的界线，随着大量洗脱液的不断加入，二者分 离距离越来越大，荧光抗体最先流出，分前、中、后三部分收集，测 F/P 比值，合格者合并，浓缩，分装。洗脱液用 20%磺基水杨酸测定 蛋白（发生沉淀反应） ，继续洗脱，游离荧光素则相继被洗脱下来， 至洗脱液中无蛋白和荧光素后，此层析柱即可再用。 若用以除去荧光抗体中的游离荧光素和硫酸铵等盐类， 可先在过 柱前透析一夜， 否则， NH4+太浓， 在蛋白未完全洗脱时即出现 NH4+， 因而影响提纯与回收蛋白，一般待洗脱液出现蛋白时，即进行收集， 之后出现 SO4++ （用 1%BaCl2 检查发生白色沉淀） 。 最后是 NH4+， （用 纳氏试剂检查呈黄棕色沉淀） ，待洗脱液无 SO4++及 NH4+后可再用。 如仅用小量荧光抗体， 可用 1×20cm 的柱层析柱， 取 2g Sephadex G-50 装柱，即可过滤 2～3.5ml 荧光抗体。 （四）DEAE 纤维素柱层析法 标记过多或过少荧光素的抗体分子可用 DEAE-纤维素柱层析法除 去。方法如下： DEAE-纤维素柱的装柱，洗脱、再生方法等与提纯 IgG 方法相同。 装柱所需 DEAE-纤维素量以干重每克交换 20～50mg 标记蛋白量为宜。 常用梯度洗脱法如下： （1）层析柱用 0.01mol/L、pH7.2PB 平衡，标记物上柱后，先用 0.01mol/L、pH7.2PB 洗脱，洗出无色或淡绿色液体，洗脱液量（根据 床体积大小每梯度乘 3） ，然后依下列各种离子强度洗脱液，分别洗
加入洗脱液一定量后，荧光抗体即向下移行，逐渐与存留于上端的游 离荧光素之间拉开明显的界线，随着大量洗脱液的不断加入，二者分 离距离越来越大，荧光抗体最先流出，分前、中、后三部分收集，测 F/P 比值，合格者合并，浓缩，分装。洗脱液用 20%磺基水杨酸测定 蛋白（发生沉淀反应） ，继续洗脱，游离荧光素则相继被洗脱下来， 至洗脱液中无蛋白和荧光素后，此层析柱即可再用。 若用以除去荧光抗体中的游离荧光素和硫酸铵等盐类， 可先在过 柱前透析一夜， 否则， NH4+太浓， 在蛋白未完全洗脱时即出现 NH4+， 因而影响提纯与回收蛋白，一般待洗脱液出现蛋白时，即进行收集， 之后出现 SO4++ （用 1%BaCl2 检查发生白色沉淀） 。 最后是 NH4+， （用 纳氏试剂检查呈黄棕色沉淀） ，待洗脱液无 SO4++及 NH4+后可再用。 如仅用小量荧光抗体， 可用 1×20cm 的柱层析柱， 取 2g Sephadex G-50 装柱，即可过滤 2～3.5ml 荧光抗体。 （四）DEAE 纤维素柱层析法 标记过多或过少荧光素的抗体分子可用 DEAE-纤维素柱层析法除 去。方法如下： DEAE-纤维素柱的装柱，洗脱、再生方法等与提纯 IgG 方法相同。 装柱所需 DEAE-纤维素量以干重每克交换 20～50mg 标记蛋白量为宜。 常用梯度洗脱法如下： （1）层析柱用 0.01mol/L、pH7.2PB 平衡，标记物上柱后，先用 0.01mol/L、pH7.2PB 洗脱，洗出无色或淡绿色液体，洗脱液量（根据 床体积大小每梯度乘 3） ，然后依下列各种离子强度洗脱液，分别洗
免疫荧光非特异性染色的消除方法
免疫荧光非特异性染色的消除方法免疫荧光染色是一种常用的方法，用于检测和定量分析细胞或组织中的特定蛋白质或其他分子。
然而，在进行免疫荧光染色时，可能会出现非特异性染色的问题，即染色结果显示的信号不仅出现在目标结构上，还出现在其他非目标结构上。
这种非特异性染色不仅会影响结果的准确性和可靠性，还会增加解释数据的困难程度。
因此，消除非特异性染色是进行免疫荧光染色时非常重要的问题之一在免疫荧光染色中，非特异性染色通常是由于两个主要因素导致的：非特异性结合和背景信号。
首先，非特异性结合是指抗体在非目标结构上出现的结合。
这可能是由于抗体的高亲和力或低选择性所致。
为了减少非特异性结合，可以采取以下几种方法：1.直接比较不同供应商的抗体根据个人实验室的具体需求，尝试不同供应商的抗体，并选择亲和力高、选择性好的抗体进行实验。
2.优化抗体的工作浓度和孵育时间降低抗体的浓度，孵育时间，或者使用浓度较低的抗体，可以减少非特异性结合。
3.使用相应的阴性对照组在每一次实验中，保留一个只有二级抗体的阴性对照组，以用于排除非特异结合引起的信号。
其次，背景信号主要由于试剂和样品中存在的非特异性荧光引起。
以下是几个可以采取的方法来降低背景信号：1.优化荧光标记物的浓度和孵育时间使用合适的荧光标记物，并对其浓度和孵育时间进行优化。
一般来说，信号的增强可以通过增加荧光标记物的浓度和/或延长孵育时间来实现，但合理的优化要使背景信号降到最低。
2.使用荧光抑制剂荧光染料抑制剂可以用于减少背景信号。
选择合适的抑制剂，并按照厂家提供的建议浓度进行使用。
3.避免非特异性荧光基质尽量避免使用荧光基质，如组织石蜡切片。
选择非荧光或低自动荧光的材料。
此外，以下是一些通用的建议1.确保良好的样品固定和处理使用适当的固定方法和缓冲液对样品进行固定和处理，以确保目标结构能够保持其形态和结构。
2.优化孵育条件通过优化温度、湿度和孵育时间等孵育条件，可以帮助提高染色的特异性和信号/背景比。
免疫荧光染色实验步骤
免疫荧光染色实验步骤1.标本固定：将所需分析的细胞、组织或细胞培养物固定在载玻片上，常用的固定方法有：乙醛、甲醛、乙酸醋酸洗等。
固定时间视具体对象而定，一般为10-30分钟。
2.细胞透膜处理：对于细胞，需进行细胞透膜处理，常用方法有：冷冻切片、石蜡包埋切片、异丙醇造液切片等。
其中，冷冻切片方法操作简单，适用于原代组织、生物样品等。
3.抗原解膜：将标本解膜以增强抗原表面表达，使其易于与抗体结合。
常用方法有：酸性解膜（如：使用0.01M蛋白酶K）、热解膜（如：使用高温蒸气）等。
解膜时间和条件因抗原种类、标本类型而异。
4.阻断非特异性蛋白质结合：使用蛋白质阻断剂（如：牛血清白蛋白、小鼠胶原蛋白等）对标本进行阻断，以防止非特异性蛋白质与抗体结合。
阻断剂的浓度和时间视实验要求而定，一般为30分钟。
5.抗体结合：将与目标抗原相关的特异性一抗加入到试管中，与待检样本中的抗原结合。
一抗的浓度和孵育时间需进行优化，一般为1-2小时。
6.清洗：使用缓冲液对载玻片或试管中的非结合抗体进行清洗，以去除非特异性、非结合的一抗。
常用的缓冲液有：PBS、TBS等。
7.二抗结合：加入特异性的荧光标记的二抗（如：荧光染料标记的抗小鼠IgG）与一抗结合。
二抗的浓度和孵育时间需进行优化，通常与一抗相同。
8.清洗：重复第6步骤，去除非结合的二抗。
9.盖玻片：将载玻片或切片用透明胶带盖住，以防止样本干燥。
10.显微镜观察：用荧光显微镜观察载玻片，记录目标抗原的荧光信号分布。
除了以上的步骤，还有一些增强免疫信号的步骤可选用，如增强素方法，例如亲和素-酶联生物素-生物素-(酶)染色。
总结：免疫荧光染色实验步骤齐全且繁多，每一步骤的条件、孵育时间和浓度等都需进行优化和调整。
实验者应根据实验目的、所用抗体和标本的特性，进行合理的实验设计和优化操作，确保得到准确可靠的实验结果。
免疫组化方法
（五）、S-P法（LSAB）：
采用生物素标记的第二抗体与链霉素生物素蛋 白连接的过氧化物酶及基质素（底物）混合液来测 定细胞和组织中的抗原。
（六）、EnvisionⅠ法（二步法）：
原理：第二抗体上标记有多聚物酶（HRP or AP）复合物与第一抗体结合。二抗上的多聚物可 结合许多的HRP分子，使信号有显著提高，敏感 性较PAP法，ABC法高出几十倍，背景因多聚物葡 聚糖是人体内不存在，无非特异性干扰，尤其是 多聚物酶分子结合的第二抗体孵育时间短，该方 法更省时，简便。
免疫组织化学理论及技术
一、 免疫组织化学的基本概念：
组织化学：
免疫组织化学：是组织化学的一个分支即组 成部分，它以免疫学的抗原抗体反应基本原理为 其特点，同时还具备组织化学的一般特征。是指 应用免疫学原理，通过特异的抗原抗体反应，附 一可见的标志物，在组织原位显示抗原成分的方 法。
肿瘤及各种疾病的病理学研究概括起来主要 在基因和蛋白水平上进行的研究。
3）、合适的抗体稀释度： 过高，过低均会导致阴性结果。 即用型抗体； 浓缩型。
4、减少or 消除非特异性染色的方法： 非特异性染色： 原因： 方法：
5、对照： 阳性对照： 阴性对照：
6、免疫组化结果的判断： 特异性染色与非特异性染色鉴别点：
①特异性反应产物常分布于特定的部位， 具有结构性。 ②在同一切片上呈现不同程度的阳性染色结
ACTH, GH, PRL, LH, TSH 主要用于垂体腺瘤的功能分类。 降钙素（Calcitotin, CT）： 甲状腺旁细胞（C细胞）分泌。
以上抗体及标记物主要的作用和意义：
Keratin＋
Vimentin－
上皮性肿瘤
Keratin＋ Vimentin＋
免疫组化非特异性染色原因及解决方法
免疫组化非特异性染色原因及解决方法
杨旭;檀艳丽;方川;李红莲
【期刊名称】《医学研究与教育》
【年(卷),期】2005(022)002
【摘要】免疫组化除正常的真实的阳性信号外常常会遇到不正常的背景着色，这些非正常的着色称为“杂音”染色，又称非特异性染色。
非特异性染色常出现在组织边缘、胶原纤维及血浆渗出处、坏死组织及固定不良的组织中心处，非特异性染色常见的有间质着色、全片着色、切片边缘着色、着色区灶状分布等，表现为弥漫性，均匀性的背景染色，也可以是随机分布的阳性反应产物点、团或块状。
【总页数】2页(P11-12)
【作者】杨旭;檀艳丽;方川;李红莲
【作者单位】河北省职工医学院,实验中心形态实验室,河北,保定,071000;河北省职工医学院,实验中心形态实验室,河北,保定,071000;河北省职工医学院附属医院,河北,保定,071000;河北省职工医学院,实验中心形态实验室,河北,保定,071000
【正文语种】中文
【中图分类】R392-33
【相关文献】
1.制备HE染色切片易出现的问题、原因及解决方法 [J], 节妍;
2.中医科研中应用免疫组化减少非特异性染色的方法 [J], 张雪静;李清
3.消除免疫组化非特异性染色方法研究(附60例分析) [J], 黄燕英;李燕辉;陈小岩
4.全自动免疫组化染色仪染色失败的常见原因及改进措施 [J], 周建云;何松;刘玉山;赵斌
5.自动免疫组化染色仪在免疫组化染色中的应用 [J], 陈萍倩;张蓉;陆敏华;印永祥因版权原因，仅展示原文概要，查看原文内容请购买。
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免疫荧光非特异性染色的消除方法一、非特异性染色的主要因素组织的非特异性染色的机理很复杂，其产生的原因主要可分为以下几点：（1）一部分荧光素未与蛋白质结合，形成了聚合物和衍化物，而不能被透析除去。
（2）抗体以外的血清蛋白与荧光素结合形成荧光素脲蛋白，可与组织成分结合。
（3）除去检查的抗原以外，组织中还可能存在类属抗原（如Forssman氏抗原），可与组织中特异性抗原以外之之相应抗体结合。
（4）从组织中难于提纯抗原性物质，所以制备的免疫血清中往往混杂一些抗其他组织成分的抗体，以致容易混淆。
（5）抗体分子上标记的荧光素分子太多，这种过量标记的抗体分子带过多的阴离子，可吸附于正常组织上而呈现非特异性染色。
（6）荧光素不纯，标本固定不当等。
二、消除非特异性染色的方法消除荧光抗体非特异性染色的方法应根据产生的原因采取适当的方法，常用的方法有以下几种：（一）动物脏器粉末吸收法常用肝粉（猪、大白鼠或小白鼠），其次是骨髓粉、鼠脑粉和鸡胚粉等。
每毫升荧光抗体中加入肝粉50～100mg,在离心管中充分混匀，在室温中振动2h，4℃中过夜，再搅拌10min，高速离心（3000～15000r/min）30min，1～2次后，即可使用其上清液。
吸收一般应在临用前进行，吸收后之荧光抗体保存冰箱中勿超过2周。
染色应作吸收前后之比较，吸收时可先用缓冲盐水将组织干粉浸湿，离心（3000～15000r/min）30min，除去上清液，再加入荧光抗体进行吸收，以免消耗过多的抗体。
肝粉或新鲜细胞吸收是一种非特异性的消除方法，对荧光抗体的荧光色素和蛋白都有吸附作用。
如检查组织中的病毒抗原时，也可用相同的组织干粉或匀浆沉淀物吸收之。
用脏器肝粉吸收对荧光抗体损失较多，如果根据Hiramotos氏等的方法将组织的20%生理盐水匀浆液，用生理盐水洗2～3次，12000r/min 10min离心沉淀，用其沉淀物吸收其荧光抗体即能完全达到目的，京极方久氏认为这样吸收对荧光抗体几乎没有损失，他们常用此法，效果甚佳，吸收后放置一周左右，用时有必要再吸收一次。
【肝粉的制法】（1）将若干只小白鼠或大白鼠放血杀死，取出肝脏，用生理盐水洗2～3次，除去血液，剥掉表面的结缔组织的脂肪。
（2）剪碎，用生理盐水反复洗涤至无血色止，然后再加生理盐水少许，用组织捣碎机或匀浆器作成匀浆。
（3）将肝匀浆装入离心管内（1/3左右），交换地用2～3倍量生理盐水和丙酮反复洗涤各三次，至上清无血色止，每次完毕先用2000r/min离心沉淀15min后，再除去上清液。
（4）最后用丙酮洗涤肝浆，再用布氏漏斗过滤，或离心沉淀，将沉淀物平铺在洁净的玻璃板上，37℃烤干（过夜）。
（5）在乳钵中充分研磨，用120目铜筛筛选过后，分装，密封，低温干燥保存。
（二）透析法荧光素如FITC分子可以通过半透膜，而蛋白质大分子不能透过，可将未与蛋白结合的荧光素透析除去。
（1）将标记完毕的荧光蛋白液装入一透析袋或玻璃纸袋内，液面稍留空隙，紧扎。
（2）浸入0.02mol/ph 7.1～7.4的PBS中（悬于大于标记物体积约50～100倍的PBS内），在4℃中透析，每日更换3～4次PBS，约5～7天，透析液中无荧即可（在荧光光源照射下）。
（三）葡聚糖凝胶G-50柱层析法除游离荧光素可用2×46cm柱层析法，详细方法参阅第二章。
加入荧光抗体15～18ml （按床体积的5%～10%加样），使其缓慢渗入柱内，待即将全部入柱时，加入PBS少许，关闭下口，停留30～40min ，使游离荧光充分进入细筛孔中，然后再接通洗脱瓶开始滴入洗脱液。
加入洗脱液一定量后，荧光抗体即向下移行，逐渐与存留于上端的游离荧光素之间拉开明显的界线，随着大量洗脱液的不断加入，二者分离距离越来越大，荧光抗体最先流出，分前、中、后三部分收集，测F/P比值，合格者合并，浓缩，分装。
洗脱液用20%磺基水杨酸测定蛋白（发生沉淀反应），继续洗脱，游离荧光素则相继被洗脱下来，至洗脱液中无蛋白和荧光素后，此层析柱即可再用。
若用以除去荧光抗体中的游离荧光素和硫酸铵等盐类，可先在过柱前透析一夜，否则，NH4+太浓，在蛋白未完全洗脱时即出现NH4+，因而影响提纯与回收蛋白，一般待洗脱液出现蛋白时，即进行收集，之后出现SO4++（用1%BaCl2检查发生白色沉淀）。
最后是NH4+，（用纳氏试剂检查呈黄棕色沉淀），待洗脱液无SO4++及NH4+后可再用。
如仅用小量荧光抗体，可用1×20cm的柱层析柱，取2g Sephadex G-50装柱，即可过滤2～3.5ml荧光抗体。
（四）DEAE纤维素柱层析法标记过多或过少荧光素的抗体分子可用DEAE-纤维素柱层析法除去。
方法如下：DEAE-纤维素柱的装柱，洗脱、再生方法等与提纯IgG方法相同。
装柱所需DEAE-纤维素量以干重每克交换20～50mg标记蛋白量为宜。
常用梯度洗脱法如下：（1）层析柱用0.01mol/L、pH7.2PB平衡，标记物上柱后，先用0.01mol/L、pH7.2PB 洗脱，洗出无色或淡绿色液体，洗脱液量（根据床体积大小每梯度乘3），然后依下列各种离子强度洗脱液，分别洗脱和收集：0.01mol/L、pH7.2PBS（0.05mol/l NaCl）……洗脱部分1。
0.01mol/L、pH7.2PBS（0.01mol/l NaCl）……洗脱部分2。
0.01mol/L、pH7.2PBS（0.02mol/l NaCl）……洗脱部分3。
将此三部分收集液（每管5ml）分别测定其F/P比值，0.05mol/l NaCl pH7.2PB洗脱液280nm光密度高峰管合并，浓缩保存备用。
因这部分非特异性染色荧光最少，是比较好的荧光抗体。
其他两部分可以废弃。
（2）柱上吸附的过度标记蛋白可继续增加NaCl的浓度至2.0mol/L洗脱完。
经过DEAE-纤维素层析后的标记抗体，其抗体量一般约损失50%，因此有些要求不太高的抗体，如抗细菌荧光抗体，不一定要这样处理，可用染色效价测定的稀释法除去非特异性染色。
（五）荧光抗体稀释法先测定荧光抗体特异性染色与非特异性染色的效价，若二者效价相差较大，则可将荧光抗体稀释至一临界浓度，使特异性染色呈阳性，而使非特异性染色保持阴性，稀释方法和染色效价测定方法相同。
（六）纯化抗原法用各种方法提纯单一成分的抗原是产生单价特异性抗体的最主要条件。
近代免疫化学技术（免疫吸收法）和柱层析法等提供了很大的可能性，可参考有关专著。
（七）纯化抗体法---免疫吸收法例如抗IgA血清的纯化方法---免疫吸收法。
如分泌型IgA（SIgA）抗原纯度不高，所制的抗血清常与IgG呈交叉反应，为此需要吸收，常采用纯化的人IgG戊二醛聚合物加以吸收纯化。
方法如下：1．人IgG聚合物的制备在5ml含40mg/ml人IgG的0.1mol/l pH7.0磷酸缓冲溶液中，加入2.5%戊二醛溶液1ml，边加边搅，5min即出现混浊，逐现大块胶块，放置30min 后，用研钵将凝胶磨细，继用1.0mol/l pH7.0磷酸缓冲溶液反复洗涤3次，末次加蒸馏水至20ml，即为人IgG聚合物悬液。
2．免疫吸收法将待吸收的抗SIgG血清加入待量IgG聚合物悬液，置室温搅拌60min,离心沉淀，上清液即稀释1倍的纯化抗SIgA血清。
如用IgG聚合物作少量分次吸收，其效果更好。
（八）伊文氏蓝（Evans blue）衬染法用0.01%伊文氏蓝的0.01mol/l pH7.2PBS稀释荧光抗体，可将背景细胞和组织染色，呈红色荧光，与特异性黄绿色荧光形成鲜明的对比，减少了非特异性荧光，宜作常规应用。
伊文氏蓝一般先配成1%溶液，保存于4℃，用前再稀释至0.01%用以和然释荧光抗体。
此外，还可以用胰酶消化组织切片或用10%牛血清蛋白封闭法等消除非特异性染色，提高特异性染色。
免疫荧光非特异性染色的消除方法（一）非特异性染色的主要因素组织的非特异性染色的机理很复杂，其产生的原因主要可分以下几点：1．一部分荧光素未与抗体结合，形成了聚合物和衍化物，而不能被透析除去引起非特异性染色。
2．抗体以外的血清蛋白与荧光素结合形成荧光素脲蛋白，可与组织成分非特异结合。
3．除去检查的抗原以外，组织中还可能存在类属抗原(如Forssman氏抗原)，可与组织中特异性抗原以外的相应抗原结合。
4．从组织中难以提纯抗原性物质，所以制备的免疫血清中往往混杂一些抗其他组织成分的抗体，以致容易混淆。
5．抗体分子上标记的荧光素分子太多，这种过量标记的抗体分子带过多的阴离子，可吸附于正常组织上而呈现非特异性染色。
6．荧光素不纯，标本固定不当等。
（二）消除非特异性染色的方法消除荧光抗体非特异性染色的方法应根据产生的原因采取适当的方法，常用的方法有以下几种：1．透析法荧光素如FITC分子可以通过半透膜，而蛋白质大分子不能透过，可将未与蛋白结合的荧光素透析除去。
（1）将标记完毕的荧光抗体液装入一透析袋或玻璃纸袋内，液面稍留空隙，紧扎。
（2）浸人0.01mol／L pH7.2的PBS中(悬于大于标记物体积约50—100倍的PBS内)，在4℃中透析，每日更换3～4次PBS，透析液中无荧光即可(在荧光光源照射下)。
2．葡聚糖凝胶G-50柱层析法除去游离荧光素可用葡聚糖凝胶G-25或G-50柱层析方法，加入荧光抗体15～18ml(按床体积的5％～10％加样)，使其缓慢渗人柱内，待即将全部入柱时，加入PBS少许，关闭下口，停留30—40min，使游离荧光素充分进入分子筛孔中，然后再接通洗脱瓶开始滴入洗脱液。
加入洗脱液一定量后，荧光抗体即向下移行，逐渐与存留于上端的游离荧光素之间拉开明显的距离界线，随着大量洗脱液的不断加入，二者分离距离越来越大，荧光抗体最先流出，分前、中、后三部分，收集中间部分，测F／P比值，合格者浓缩，分装。
如仅用小量荧光抗体，可用1cm×20cm的层析柱，取2g Sephadex G-50装柱，即可过滤2～3.5ml荧光抗体。
3. 荧光抗体稀释法先测定荧光抗体的特异性染色与非特异性染色效价，若二者效价相差较大，则可将荧光抗体稀释至一临界浓度，使特异性染色呈阳性，而使非特异性染色保持阴性，稀释方法和染色效价测定方法相同。
4. 纯化抗原方法用各种方法提纯单一成分的抗原是产生单价特异性抗体的最主要条件。
现代免疫化学技术(免疫吸收法)和柱层析法等提供了很大的可能性。
5．伊文蓝（Evan blue）衬染色方法用0.01%伊文蓝的0.01mol/L pH7.2 PBS溶液稀释荧光抗体，可将背景细胞和组织染色呈红色荧光，与特异性黄绿色荧光形成鲜明的对比，减少了非特异性荧光，宜作常规应用。
伊文蓝一般配成1%溶液，保存于4℃，用前再稀释至0.01%用以稀释荧光抗体。