06 免疫组化常用方法

免疫组化操作方法（SP法、Elivison二步法、ABC法）一、Elivison二步法1、石蜡切片置于67℃烘箱中，烘片2小时，脱蜡至水，用pH7.4的PBS冲洗三次，每次3分钟（3×3’）。

2、取一定量pH=6.0柠檬酸盐缓冲液，加入微波盒中，微波加热至沸腾，将脱蜡水化后的组织切片置于耐高温塑料切片架上，放入已沸腾的缓冲液中，中档微波处理10分钟，取出微波盒流水自然泠却，从缓冲液中取出玻片，先用蒸馏水冲洗两次，之后用PBS 冲洗2×3’。

（注：不是所有的抗体都需要微波修复的，视具体情况而定）3、每张切片加1滴3%H2O2，室温下孵育10分钟，以阻断内源性过氧化物酶的活性。

PBS冲洗3×3’。

4、除去PBS液，每张切片加1滴相应的第一抗体（相应稀释倍数），室温下孵育2小时。

5、PBS冲洗3×5’。

除去PBS液，每张切片加1滴聚合物增强剂，室温下孵育20分钟。

PBS冲洗3×3’。

6、除去PBS液，每张切片加1滴酶标抗鼠/兔聚合物，室温下孵育30分钟。

PBS冲洗3×5’。

7、除去PBS液，每张切片加1滴新鲜配制的DAB液（二氨基联苯胺），显微镜下观察5分钟。

8、苏木素复染，0.1%HCl分化，自来水冲洗，蓝化，切片经梯度酒精脱水干燥，二甲苯透明，中性树胶封固，晾干后观察。

二、SP法SP（streptavidin-perosidase）法，即链霉菌抗生物素蛋白-过氧化物酶连结法。

按标记物质的种类，如荧光染料、放射性同位素、酶（主要有辣根过氧化物酶和碱性磷酸酶）、铁蛋白、胶体金等，可分为免疫荧光法、放射免疫法、酶标法和免疫金银法等。

按染色步骤可分为直接法（又称一步法）和间接法（二步、三步或多步法）；按结合方式可分为抗原-抗体结合，如过氧化物酶-抗过氧化物酶（PAP）法和亲和连接，如卵白素-生物素-过氧化物酶复合物（ABC）法、链霉菌抗生物素蛋白-过氧化物酶连结（SP）法等，其中SP法是最常使用的方法。

免疫组化操作方法、原理、步骤以及常见问题处理大总结免疫组化操作方法、原理、步骤以及常见问题处理大总结1、方法操作不难，最大的难处是出现异常结果时如何解决？这就需要掌握免疫组化实验原理，每一步知道为什么这样做，这样你才敢大胆地改革先前的不对的方法步骤。

如抗体孵育条件主要是抗体浓度、温度、时间，这三者一般是相互成反比的（相对），其中浓度是最重要的先决条件，温度决定反应的速度、时间决定反应的量。

就拿温度来说，可以有4 度、室温、37度，我推荐4度最佳，反应最温和，背景较浅；而37度反应速度较快，时间较短；室温我不太提倡，除非你每次都把环境温度控制在一定的范围，否则，尽量选择前两者。

2、免疫组化最大的优势是定位和定性。

相比于其他蛋白检测方法，免疫组化具有定性灵敏度高、定位较直接准确，是定位检测分析首选方法。

尤其对于有些因子的转位研究十分有用。

3、免疫组化结果定量分析的前提是高质量的染色切片。

免疫组化结果也能定量分析，但必须是背景染色浅而特异性染色较深的情况下，分析最为准确，这种原则可能也是我们日常审稿时判定研究结果的必备条件。

4、免疫组化实验一定要设置阳性对照和阴性对照。

阳性对照一般是用肯定表达这种抗原的切片来做；阴性对照一般是用PBS或非一抗替代一抗来进行反应，其余步骤均一致。

前者是排除方法和实验系统有无问题；后者是排除有无一抗外的非特异性染色。

5、免疫组化的应用广泛，是当前实验研究的最重要方法之一。

如今发SCI论文时，明显感觉仅靠量化的数据来发文章很难，加一些形态学数据或图片，老外十分欢迎，可能是怕你学术造假吧。

当然也不能做假阳性或假阴性结果。

6、免疫组化技术掌握与否的鉴定标准是同一切片或不同切片中不同抗原均从摸索浓度或条件而做出优良的染色切片。

我在平时带教中就发现许多研究生把我已经摸索很成熟的反应条件、浓度、方法步骤，重复运用于同一性质的切片和同一种抗体，做出来后就觉得自己已经掌握了免疫组化方法，更换一种抗体后，居然连二抗的种属来源都拿错了。

免疫组化常用的对照方法
免疫组化（immunohistochemistry，IHC）是一种用于检测组织或细胞中特定蛋白质表达的技术。

在进行免疫组化实验时，对照组是非常重要的，它可以帮助确定实验结果的准确性和可靠性。

以下是免疫组化常用的对照方法：
1. 阴性对照，阴性对照是使用不含目标蛋白的组织样本或细胞作为对照。

这可以帮助排除假阳性结果，即实验结果中出现的信号并非由于目标蛋白的存在所致。

2. 正性对照，正性对照是使用已知含有目标蛋白的组织样本或细胞作为对照。

这可以确保实验条件下目标蛋白的免疫反应性，并验证实验方法的可靠性。

3. 内部对照，内部对照是在同一组织样本或细胞中使用与目标蛋白不同但稳定表达的蛋白作为对照。

这有助于纠正实验中可能存在的变异性，如组织处理、染色效果等。

4. 同型对照，同型对照是使用与目标蛋白相同种属来源的免疫球蛋白（IgG）作为对照。

这可以帮助排除实验中可能存在的非特异
性结合或交叉反应。

以上是免疫组化常用的对照方法，正确选择和使用对照可以有效地确保免疫组化实验结果的准确性和可靠性，为科研工作提供有力的支持。

免疫组化操作方法免疫组化是一种常用的实验方法，用于检测和定位细胞或组织中特定蛋白质的表达。

它结合了免疫学和生化学的原则和技术，可以提供对细胞或组织中不同蛋白质的分子特征、活动状态和相互作用的信息。

本文将详细介绍免疫组化的操作方法，包括材料和试剂的准备、标本的制备和固定、抗原检测和可视化等步骤。

材料和试剂的准备1.活体或固定的细胞或组织标本。

2.组织培养基和适当的培养器具。

3.PBS(磷酸缓冲盐溶液)或其他细胞/组织冲洗缓冲溶液。

4.组织切片刀、显微刀片、显微镊子、镊子等操作工具。

5.细胞/组织固定剂，如乙醛、甲醛、乙酸乙酯等。

6.可溶性和固相抗原检测试剂，如抗体、蛋白质等。

7.染色试剂，如荧光染料、酶底物等。

8.实验室耗材和设备。

标本的制备和固定1.如果使用活体标本，如细胞培养物，应先将其转移到无菌培养器皿中，并在适当的培养条件下培养至合适的生长期。

2.对于组织标本，可以通过切片或切块的方式进行制备。

切片时要求切片薄而均匀，一般为5-10μm。

切块时要求尽量保持组织完整性。

3.制备好的细胞或组织标本需要尽快进行固定，以保持其形态和蛋白质的天然状态。

常用的细胞/组织固定剂有乙醛、甲醛和乙酸乙酯。

不同的固定剂选用方法有一定差异，具体应根据实验要求和文献建议进行选择。

抗原检测和可视化1.固定后的标本需要进行脱水和透明化处理，以便于抗原检测的进行。

可以使用乙醇或队列进行脱水处理，然后用透明化溶剂进行透明化处理。

2.抗原检测需要使用抗体识别目标蛋白质。

对于免疫组织化学，常用的抗体类型包括一抗和二抗。

一抗为直接与目标抗原反应的抗体，二抗为与一抗结合并由可视化标记物进行信号产生的抗体。

一抗和二抗的选择应根据目标抗原和实验要求进行合理选择。

3.免疫染色前，可进行一些前处理步骤以增强染色效果，如抗体预处理、抗原修复、背景消除等。

4.免疫染色操作中，需要逐层进行抗体处理、洗涤和可视化标记物处理。

一般步骤包括：一抗与标本结合、一次洗涤、二抗与一抗结合、二次洗涤、可视化标记物与二抗结合、最终洗涤。

免疫组化方法
免疫组化是一种常用的实验技术，用于检测组织或细胞中特定蛋白质
的表达和定位。

其基本原理是利用特异性抗体与目标蛋白质结合，再通过
染色或荧光标记等方法来检测抗体与蛋白质的结合情况。

免疫组化方法主
要包括以下几个步骤：1.样品制备：将组织或细胞样品固定、切片或涂片
等处理，以便于后续的抗体结合和检测。

2.抗原修复：对于某些抗原易于
失活或难以检测的样品，需要进行抗原修复处理，如加热、酶解等，以恢
复抗原的结构和活性。

3.抗体结合：将特异性抗体加入样品中，与目标蛋
白质结合形成免疫复合物。

抗体可以是单克隆或多克隆，也可以是直接标
记或间接标记的。

4.洗涤：用缓冲液洗涤样品，去除未结合的抗体和杂质，以减少假阳性的干扰。

5.检测标记：将荧光标记、酶标记或金标记等标记
物加入样品中，与免疫复合物结合，以便于检测和定位。

6.显色或荧光：
通过染色或荧光显微镜等设备，观察样品中的免疫复合物的分布和定位，
以确定目标蛋白质的表达和定位情况。

总之，免疫组化方法是一种高灵敏度、高特异性的实验技术，广泛应用于生物医学研究、临床诊断和药物开
发等领域。

常用免疫组化染色方法(一)、ABC法：(注，下面各种方法，均为手工操作，如没特别说明，均在室温下进行)1.切片经二甲苯Ⅰ 5分钟。

2.切片经二甲苯Ⅱ 5分钟。

3. 无水酒精Ⅰ 30秒。

4. 无水酒精Ⅱ 30秒。

5. 95%酒精Ⅰ 30秒。

6. 95%酒精Ⅱ 30秒。

7. 90%酒精 30秒。

8.80%酒精 30秒。

9. 70%酒精 30秒。

10.自来水洗。

(后面的切片脱蜡至水一般都是1-10)11.0.3%H2O2甲醇处理切片10-20分钟。

12.水洗。

13.抗原修复。

14.PBS洗3次，1分钟/次。

15.加入血清孵育20分钟。

16.摔干血清，加入一抗60分钟。

17.PBS洗3次，2分钟/次。

18.加入二抗孵育30分钟。

19.PBS洗3次，2分钟/次。

20.加入ABC复合物，孵育30分钟。

21. PBS洗3次，2分钟/次。

22.DAB-H2O2孵育切片5-10分钟。

23.PBS洗，水洗。

24.Harris苏木素染核5-10分钟。

25.水洗，分化，蓝化，脱水，透明并封固。

(二)、LSAB法。

(SP法)(Labelled streptavidim biotln)1.切片脱蜡至水。

2.0.3%H2O2甲醇处理切片10-20分钟。

3.水洗。

4.抗原修复。

5.PBS洗3次，1分钟/次。

6.加入血清孵育10分钟。

7.摔去血清，加入一抗孵育30-60分钟。

8.PBS洗3次，每次2分钟。

加入二抗，孵育20分钟。

9.PBS洗3次，每次2分钟。

10.加入SP复合物孵育20-30分钟。

11.PBS洗3次，每次2分钟。

12.DAB-H2O2孵育5-10分钟。

13.PBS洗，水洗。

14.Harris苏木素染核5-10分钟。

15.水洗，分化，蓝化，脱水，透明并封固。

(三)真空负压LSAB法1.切片脱蜡至水。

2. 0.3%H2O2甲醇真空负压处理5min.3. 水洗。

4.如果需要，可进行抗原修复。

5.PBS洗3次，每次1分钟。

免疫组化方法和步骤免疫组化是一种常用的实验技术，用于检测细胞或组织中特定蛋白质的表达水平，以及研究细胞或组织中的蛋白质定位和相互作用。

免疫组化方法涉及一系列步骤，包括样本固定、抗原检测与标记、抗体与抗原结合、可视化和结果分析。

以下是免疫组化方法及步骤的详细介绍。

一、样本固定免疫组化实验的第一步是固定样本，通常使用福尔马林或乙醛等化学物质进行固定。

固定的目的是保持细胞和组织的形态结构，并防止蛋白质的降解。

固定过程中，需要将样本固定在载玻片或膜上，以便之后的实验操作。

可使用刷子或杆状工具将样本涂布在载玻片上，或者使用离心管和离心机将细胞沉淀在载膜上。

二、抗原检测与标记样本固定后，下一步是检测和标记目标抗原。

有两种常用的方法供选择：直接法和间接法。

1.直接法：直接法在一个步骤中同时检测和标记抗原。

直接法可以快速获得结果，但受到抗体的特异性和标记物的可用性的限制。

2.间接法：间接法需要两个步骤，先使用特异性初级抗体与抗原结合，再使用标记有染料或标记物的二级抗体与初级抗体结合。

间接法具有较高的灵敏度和特异性，可以用于多重标记和检测多个蛋白质。

三、抗体与抗原结合蛋白质和抗体结合是免疫组化的关键步骤。

待检样本上固定的抗原与抗体结合可以直接检测或通过信号增强来检测。

抗体与抗原结合的时间和温度取决于抗体的亲和力和特异性，通常需要在较低的温度下进行孵育，并在孵育过程中提供充分的抗体与抗原接触时间。

四、可视化可视化是将抗原抗体结合信号转化为可见光信号的过程。

最常见的可视化方法之一是使用酶标测定法。

酶标测定法将酶（如辣根过氧化物酶）结合到标记物（如荧光素黄标记的二级抗体）上，然后通过加入底物（如DAB）产生可见的色素反应。

除了酶标测定法外，还有其他可视化方法，如免疫荧光技术和原位杂交。

免疫荧光技术使用标记的荧光染料标记一级或二级抗体，然后通过荧光显微镜观察样本。

原位杂交使用与DNA序列互补的标记探针识别特定的DNA序列，并通过可视化标记（如荧光）来检测靶标。

常用免疫组织化学染色方法免疫组织化学染色是通过将抗原与抗体结合来检测组织中特定蛋白质的染色方法。

它是现代生物医学中常用的一种技术，可以用于研究分子生物学、细胞生物学、病理学等领域。

以下是一些常用的免疫组织化学染色方法介绍：1. 免疫组化染色(Immunohistochemistry, IHC)：免疫组化染色是免疫组织化学中最常用的方法之一、其基本原理是使用一种与目标抗原特异性结合的抗体，将抗原与抗体结合，然后通过染色方法将表达该抗原的细胞或组织可视化。

常用的染色剂包括多聚酶、酶标、荧光素和放射性同位素。

IHC可以用于检测细胞表面抗原、细胞器中的抗原以及胞内蛋白质的定位。

2. 免疫荧光染色(Immunofluorescence, IF)：免疫荧光染色利用荧光标记的抗体来检测特定抗原。

它可以提供高度特异性和灵敏度的探测，可以用于研究蛋白质的亚细胞定位、蛋白质相互作用等。

利用该方法可以用于检测多种类型的标记（单标记、双标记、复合标记等），从而实现多重染色或共定位染色。

3. 免疫电镜染色(Immunoelectron microscopy, IEM)：免疫电镜染色是一种将金粒标记的抗体用于电子显微镜下观察并定位特定抗原的方法。

通过将金粒结合到抗原-抗体复合物上，可以在电子显微镜下清晰地观察到抗原的位置和分布。

这种方法具有高分辨率和高特异性的优点，广泛应用于超微结构的研究。

4. 免疫酶标染色(Immunoenzyme staining, IES)：免疫酶标染色是使用酶作为标记物，通过化学反应将抗原与酶标记的抗体结合，从而显示出特定抗原的位置和分布。

常用的标记物包括辣根过氧化物酶(HRP)、碱性磷酸酶(ALP)等。

在检测抗原时，标记物可以与染色底物产生反应生成可见色素，形成染色，以显示抗原的位置和分布。

5. 免疫组织化学原位杂交(Immunohistochemical in situ hybridization, IHC-IS)：免疫组化原位杂交技术是一种结合了原位杂交和免疫组化技术的方法。

免疫组化实验方法免疫组化（Immunohistochemistry，简称IHC）是一种利用特异性抗体与组织或细胞特定抗原结合的方法，以此可以检测细胞或组织中蛋白质的表达和分布情况。

IHC技术已广泛应用于病理学、癌症诊断、生物医学研究等领域。

以下是免疫组化实验的常用方法：1.样本处理：通常以石蜡包埋切片作为实验样本。

首先，从固定的组织或细胞中取得标本，然后进行脱水、透明化和浸蜡等处理。

接下来，使用切片机将组织或细胞切割成厚度为3-5μm的切片。

2.抗原恢复：由于样本的固定和包埋可能导致抗原的损伤，因此需要对切片进行抗原恢复处理。

常见的抗原恢复方法包括热处理、酶解法和酸性水解法。

热处理是将切片置于缓冲液中，在高温下进行退火。

酶解法是使用胰蛋白酶等酶对切片进行消化。

酸性水解法则使用盐酸或酶进行酸性处理。

3.抗体结合：选择特异性的一抗体与目标抗原结合。

一抗体可以是单克隆抗体或多克隆抗体，可以经商业采购或自家制备。

将一抗体加入待检测切片上，让其与目标抗原结合。

4. 第二抗体结合：待检测切片上结合了一抗体的抗原后，需要添加第二抗体与一抗体结合。

第二抗体通常是反相应物免疫球蛋白（Secondary Antibody），如反人IgG，反兔IgG等。

第二抗体上常会标记有发光物质、酶标记物或荧光染料，用于可视化结果。

5.可视化和显色：根据选择的第二抗体，可以选择显色方法。

例如，辣根过氧化物酶（HRP）结合的第二抗体可以使用3,3'-二氨基联苯思（DAB）作为底物，呈棕色或棕黄色；荧光标记的第二抗体可以用荧光显微镜进行观察。

6.伪染色：为了辅助观察和识别目标组织或细胞，可以进行伪染色。

常见的伪染色方法有对比染色、核染色和细胞质染色等。

7.阴性对照和阳性对照：为了确保实验结果的准确性和可靠性，同时进行阴性对照和阳性对照实验。

阴性对照是在实验中将第一抗体替换为非特异性抗体或缺少抗体的处理组织或细胞组织；阳性对照是在实验中使用已知表达目标蛋白的组织或细胞进行处理。

免疫组化的检查方法
免疫组化（Immunohistochemistry，IHC）是一种常用的生物医学分析方法，用于检测组织或细胞中特定蛋白质的表达情况。

以下是免疫组化的检查方法流程：
1. 取得组织样本：通常使用组织切片、细胞涂片或细胞悬液作为检测样本。

2. 固定样本：将样本用适当的固定剂进行固定，以保持细胞或组织的形态结构。

3. 抗原修复：修复固定后的样本中的蛋白质，以恢复其免疫反应性。

这一步通常需要使用热解修复（如煮沸法）或酶解修复（如蛋白酶K处理）。

4. 抑制内源性酶活性：使用过氧化物酶抑制剂等化学物质，以抑制组织或细胞中的内源性酶活性，以避免假阳性结果。

5. 孵育抗体：将特异性抗体加入到样本中，并进行适当的孵育条件下，使抗体与目标蛋白质结合。

6. 洗涤：使用缓冲液对样本进行多次洗涤，以去除未结合的抗体。

7. 标记二抗：加入适量的与抗体标记的二抗（如辣根过氧化物酶（HRP）标记的兔抗小鼠IgG）与上一步已结合的一抗结合。

8. 再洗涤：使用缓冲液对样本进行多次洗涤，以去除未结合的二抗。

9. 染色和可视化：加入合适的底物（如DAB）使其与HRP反应生成可见色素，形成免疫染色，以显示阳性表达的位置。

10. 目视观察：使用显微镜观察样本，并根据染色强度和分布位置来评估阳性的免疫反应。

免疫组化是一种常用的分子生物学技术，可用于研究细胞和组织的分子标志物、蛋白质表达水平及其分布情况，它已广泛应用于生物医学研究、临床诊断和治疗评估等领域。

免疫组化操作方法、原理、步骤以及常见问题处理大总结１、方法操作不难,最大得难处就是出现异常结果时如何解决？这就需要掌握免疫组化实验原理,每一步知道为什么这样做,这样您才敢大胆地改革先前得不对得方法步骤。

如抗体孵育条件主要就是抗体浓度、温度、时间,这三者一般就是相互成反比得(相对),其中浓度就是最重要得先决条件,温度决定反应得速度、时间决定反应得量。

就拿温度来说,可以有4度、室温、37度,我推荐4度最佳,反应最温与,背景较浅;而３７度反应速度较快,时间较短;室温我不太提倡,除非您每次都把环境温度控制在一定得范围,否则,尽量选择前两者。

２、免疫组化最大得优势就是定位与定性。

相比于其她蛋白检测方法,免疫组化具有定性灵敏度高、定位较直接准确,就是定位检测分析首选方法、尤其对于有些因子得转位研究十分有用。

３、免疫组化结果定量分析得前提就是高质量得染色切片。

免疫组化结果也能定量分析,但必须就是背景染色浅而特异性染色较深得情况下,分析最为准确,这种原则可能也4、免疫组化实验一定要设置阳就是我们日常审稿时判定研究结果得必备条件。

ﻫ性对照与阴性对照。

阳性对照一般就是用肯定表达这种抗原得切片来做;阴性对照一般就是用ＰＢS或非一抗替代一抗来进行反应,其余步骤均一致。

前者就是排除方法与实验系统有无问题;后者就是排除有无一抗外得非特异性染色、5、免疫组化得应用广泛,就是当前实验研究得最重要方法之一、如今发SCI论文时,明显感觉仅靠量化得数据来发文章很难,加一些形态学数据或图片,老外十分欢迎,可能就是怕您学术造假吧、当然也不能做假阳性或假阴性结果。

6、免疫组化技术掌握与否得鉴定标准就是同一切片或不同切片中不同抗原均从摸索浓度或条件而做出优良得染色切片、我在平时带教中就发现许多研究生把我已经摸索很成熟得反应条件、浓度、方法步骤,重复运用于同一性质得切片与同一种抗体,做出来后就觉得自己已经掌握了免疫组化方法,更换一种抗体后,居然连二抗得种属来源都拿错了。

蛋白实验技术——免疫组化实验步骤免疫组化（immunohistochemistry，IHC）是一种常用的分子生物学研究手段，用于检测和定位特定蛋白质在组织或细胞中的表达和分布情况。

以下是免疫组化实验的常见步骤：1.材料准备：-组织样本：一般使用福尔马林固定、石蜡包埋的组织切片。

-抗体：根据要检测的蛋白质选择特异性和高亲和力的一抗。

还需选取对该抗体特异性有所了解的阴性对照抗体作为对照。

-二抗：选择特异性与一抗结合的二抗，二抗常标记有荧光素、酶或金颗粒等。

-染色剂：包括染色素、转化底物和显色剂等。

2.样本处理：-脱蜡：将石蜡包埋的组织切片放置在58-60℃热箱中，反复浸泡于甲醇和乙醇中将石蜡脱除。

-抗原修复：使用热蒸汽或酶解剂等方法，将福尔马林固定的组织切片中的抗原开放，以方便抗体与抗原结合。

-除脂：用乙醚或甲醚等化学溶剂洗涤，去除脂肪质的干扰。

3.抗体处理：-阻断剂处理：使用阻断剂（如牛血清蛋白）阻断切片中非特异性结合位点。

-一抗处理：将选择的抗体稀释于阻断液中，加到组织切片上，保持温度和湿度有利于抗原结合。

-二抗处理：根据实验需要，选择将一抗特异性结合的二抗标记，加到组织切片上。

二抗的选择需要根据实验所用的检测方法进行确定。

4.检测与显色：-荧光染色：使用激光产生的特定波长的光源，观察组织中特异性荧光的发光。

-酶联免疫组化：在二抗的标记中常使用辣根过氧化物酶（HRP），添加辣根过氧化氢-二甲基氨基甲酸酯（DAB）进行染色反应。

-光镜观察：使用透射光镜观察染色的结果。

通过比较阳性对照和阴性对照组织切片，可以确定染色结果的特异性。

5.结果分析：-显微镜下观察：根据阳性对照组织切片和实验组织切片的染色情况进行观察和比较。

-计算和分析：可以根据染色结果的强度和程度进行定量研究，使用图像分析软件进行图像处理和数据分析。

此外，免疫组化实验还需要注意以下几点：-尽可能使用正常组织作为阳性对照，使用未加抗体或添加非特异性免疫血清的组织作为阴性对照，以确保实验结果的准确性。

免疫组化方法和步骤免疫组化（Immunohistochemistry，简称IHC）是一种重要的实验技术，通过使用特异性抗体标记目标蛋白质在组织或细胞内的表达，从而实现对相关分子的定位和定量分析。

免疫组化技术适用于各种生物学研究领域，包括分子生物学、细胞生物学、肿瘤学等，成为了生命科学研究中不可或缺的手段之一本文将介绍免疫组化方法和步骤，包括样品制备、抗体选择、抗体标记、免疫染色反应和结果解读等内容。

1.样品制备在进行免疫组化实验之前，首先需要准备和处理适当的样品。

样品可以是组织切片、细胞涂片、细胞悬液等。

常用的样品制备技术包括固定、包埋和切片等步骤。

例如，对于组织切片，可以使用福尔马林进行固定，然后将组织包埋在石蜡中，最后切割成适当的厚度（通常为4-10μm）。

2.抗体选择选择适当的抗体是进行免疫组化实验的关键。

抗体的选择应基于目标蛋白质的特异性和抗体的靶向性。

常用的抗体包括单克隆抗体和多克隆抗体。

单克隆抗体能够提供更高的特异性和一致性，而多克隆抗体的优势在于更好的识别多个蛋白质表位。

3.抗体标记为了能够对目标蛋白质进行可视化，需要将抗体标记。

这一步骤通常是通过将抗体与荧光染料、酶或金属颗粒等标记物结合来实现。

常用的标记物有荧光标记物（如荧光素、荧光蛋白等）、酶标记物（如辣根过氧化物酶、碱性磷酸酶等）和金属颗粒（如金、银等）。

选择合适的标记物应考虑实验目的、设备可用性和信号灵敏度等因素。

4.免疫染色反应免疫染色反应是免疫组化实验的核心步骤。

该步骤包括抗原解层、抗体结合、洗涤和可视化等过程。

-抗原解层：解层是为了暴露目标蛋白质，从而使抗体能够与其结合。

解层的方法可以包括热解层、酶解层和酸解层等。

-抗体结合：在解层后，样品与标记抗体的混合溶液孵育在一起，使抗体能够与目标蛋白质结合。

不同的抗体结合时间和温度可能有所不同，需要根据具体实验进行优化。

-洗涤：为了去除未结合的抗体和其他非特异性结合物，需要对样品进行洗涤。

免疫组化原理及步骤免疫组化操作规程一、实验原理与意义免疫组织化学又称免疫细胞化学,是指带显色剂标记的特异性抗体在组织细胞原位通过抗原抗体反应和组织化学的呈色反应,对相应抗原进行定性、定位、定量测定的一项新技术。

它把免疫反应的特异性、组织化学的可见性巧妙地结合起来,借助显微镜 (包括荧光显微镜、电子显微镜的显像和放大作用,在细胞、亚细胞水平检测各种抗原物质 (如蛋白质、多肽、酶、激素、病原体以及受体等。

二、实验器材微波炉、吹风机、组化笔、湿盒、烤箱、振荡器、染缸、光学显微镜、纯木浆卫生纸、计时器和通风橱等。

三、试剂配制1. 0.01 M PBS(pH 7.34 :9.0 g NaCl + 50 ml 0.2 M PB 加双蒸水至 1000 ml;1000 ml 0.2M PB (pH 7.4=5.93 g NaH 2 PO 4 ·2H 2 O+58.02 g Na 2 HPO 4 ·12H 2 O in 1000 ml 双蒸水或=190 ml A + 810 ml B(A. 0.2 M NaH 2 PO 4 ·2H 2 O:15.6 g in 500 ml ddH 2 O; B. 0.2M Na 2 HPO 4 ·12H 2 O:71.632 g in1000 ml dH 2 O。

2. Citrate Buffered Saline(0.01 M 柠檬酸缓冲液, PH6.0:28 ml A + 72 ml B + 200 ml ddH 2 O(A.Citrate acid (柠檬酸 :10.5 g 加双蒸水至 1000 ml ; B.Citrate sodium(柠檬酸钠:29.41 g 加双蒸水至 1000 ml。

3. 细胞通透液:由终浓度分别为 0.3%双氧水和 0.3%Triton X-100 混合而成。

配制方法是先用微波加热的 36 ml PBS, 再接着加 120 ul TritonX-100,并加热一儿,冷却至临用前加 0.4 ml30%H 2 O 2 。

免疫组化方法集合免疫组化是一种广泛应用于生物学和医学研究领域的方法，主要用于检测和定位细胞和组织中的特定蛋白质分子。

通过结合抗体和荧光标记或酶标记等物质，可以在细胞和组织中准确地定位目标分子，并提供关于它们的表达和分布的定量信息。

在免疫组化中，抗体是核心的关键因素。

抗体是一种特异性识别分子的蛋白质，能够结合到特定的抗原分子上。

在免疫组化中，我们首先需要选择和优化与目标分子结合的抗体。

传统方法包括动物免疫技术和重组DNA技术。

在动物免疫技术中，通常使用实验动物（如小鼠、兔子等）注射抗原来诱导免疫应答，然后从动物体内收集血清作为抗体源；而在重组DNA技术中，通过克隆目标分子的DNA片段来构建重组抗体或单克隆抗体。

近年来，也出现了一些新的技术，如脱敏化兔子技术、脂质体免疫启动技术等，用于提高抗体的产量和特异性。

抗原检测是免疫组化的重要步骤。

根据不同的需求，可以采用直接或间接法检测抗原。

直接法是指将标记有荧光物质或酶物质的特异性抗体直接与细胞或组织中的目标分子结合，然后通过观察荧光或酶标记的反应来检测目标分子的存在。

间接法则是引入第二抗体来增强检测信号。

第二抗体通常与荧光物质或酶物质标记，可以与第一抗体结合，然后观察荧光或酶标记的反应来间接检测目标分子的存在。

间接法可以增强检测的灵敏度和特异性，但也增加了一些额外的步骤和耗时。

荧光免疫组化是一种常用的免疫组化方法之一、在荧光免疫组化中，常用的荧光标记物包括荧光染料、荧光蛋白质（如绿色荧光蛋白、红色荧光蛋白等）和钙荧光探针等。

通过将这些标记物与特异性抗体结合，可以在细胞和组织中检测和定位目标分子。

荧光免疫组化具有高灵敏度和高分辨率的优点，可以用于观察细胞和组织中特定蛋白质的亚细胞定位和表达水平的定量测量。

酶标免疫组化是另一种常用的免疫组化方法。

在酶标免疫组化中，常用的酶标记物包括辣根过氧化物酶（HRP）和碱性磷酸酶（AP）。

这些酶标记物能够与特异性抗体结合，并在添加特定底物后产生可见的颜色反应或荧光反应。