排雷攻略：一文教会你免疫组化、免疫荧光如何制片看片

排雷攻略：⼀⽂教会你免疫组化、免疫荧光如何制⽚看⽚

最近带着新进门的研⼀师妹做实验，师妹问了三个问题：1、免疫组化和免疫荧光的区别？2、

这两种实验该在什么情况下选择？3、组织是不是只能做免疫组化，细胞是不是只能做免疫荧

光？4、免疫荧光为什么要做DAPI染⾊？我听完之后笑了，这种思考的态度是好的，但其实，

师妹问的这⼏个问题就是⼀个问题。归根结底，涉及到“免疫”⼆字总是离不开抗原抗体反应的，

⼆者都属于免疫检测技术⼿段，⽽免疫组化和免疫荧光两项技术都可以应⽤在组织和细胞⽅

⾯，前者采⽤的是化学发光的⽅法，后者是荧光。因为我们在⽂献中看到的，很多⼈都会选择

做组织的免疫组化、细胞的免疫荧光，所以这就给初⼊实验室的新⼿们带来了误区。

其实⽹上已经有很多详细的操作步骤，所以⼩六⼉今天想为各位新⼿朋友们总结⼀下我认为的

免疫组化和免疫荧光制⽚看⽚的⼩技巧，帮助⼤家排雷区，同时也提出⾃⼰的⼀些疑问，希望

能得到解答（因为本⼈只做过组织的免疫组化和细胞的免疫荧光，以下内容以这两⽅⾯为主，

内容若有⽋缺，欢迎⼤家补充）。

免疫组化

1、 取材时要尽量去除⾎液的⼲扰：⼩⿏⿇醉后，从左⼼⽿插⼊针头，⼼尖处剪开⼀个⼩⼝，

然后将PBS缓慢打⼊⼼脏中，缓慢跳动的⼼脏会将PBS运送⾄全⾝。50ml的PBS⽤量对于Balb/c或昆明⼩⿏的体积⽽⾔就已⾜够，这⼀步骤对于像肺、肝和脾脏这样⾎管丰富的脏器取材

极为重要。2、 取材时要尽量做到表⾯积⼤、厚度⼩：理想的取材厚度是2mm，这样的尺⼨可以让后续的

固定、脱⽔等操作达到理想的效果。器材选择上，⼿术⼑和超市购买的⼑⽚都可以，只要⼑⽚

锋利即可，切勿反复切割揉搓组织。因为脏器的表⾯都是弧形，并且质地很软，如果你直接取

材，第⼀是不好切，第⼆是弧形的⼀⾯肯定是厚度超标，所以这⾥建议各位将组织置于碎冰上

后，沿着长轴在横切⾯处再切⼀⼑取材（针对实质性器官，且不要求取材部位）。3、 取材后的组织需⽴即固定：固定不仅是要保留组织原有的形态，也是在保留组织中的抗

原。组织离体取材后需⽴即固定，尽量不要超过20分钟。固定液的量⼀般为组织的5-10倍。4、 抗原修复的条件极为重要：抗原修复是为了挽救在固定过程中被掩盖的⼀部分抗原特性，

⼩六⼉所在的实验室采⽤的是隔⽔加热的修复⽅法。将盛有修复液的⼴⼝容器放在电磁炉中加

热⾄沸腾，然后将切⽚放⼊其中修复液中加热30分钟，修复液的量要保证完全覆盖切⽚，且不

会蒸发⾄⼲涸，抗原修复过后要让其缓慢降⾄室温。抗原修复液多选择pH6.0的柠檬酸盐修复

液，优点是染⾊背景较清晰，假阳性结果较少。5、 设置对照实验：严谨的实验要求有阳性对照和阴性对照。这⾥的阳性对照和阴性对照和我

们实验中⽐较的加药组和⾮加药组是两个概念，这是新⼿们容易误解的地⽅。我们在⽂献中很

少看到阳性对照和阴性对照的图⽚，所以有很多同学在免疫组化实验中并不做这两组实验，这

⾥还是建议，如果开启⼀个新的研究⽅向，对照组实验还是要做的，并且也有同学在投稿过程

中要免疫组化对照组原始图⽚的情况，其重要性可见⼀斑。6、 结果判读：对于免疫组化结果⽽⾔，最怕的就是不同的⼈看到的结果是不⼀样的。结果判

读看重的主要是两点：a、阳性结果。⾁眼可见的阳性结果就是黄⾊深浅，但并不是说黄⾊就是阳性了。⾸先不排除组

织本⾝⾃带的抗原表达情况，同时也有很⼤程度的假阳性结果的⼲扰，所以黄⾊要结合阳性和

阴性对照⽽⾔，这也就回到上⼀条所说的，设置对照组的重要性！b、阳性部位。蛋⽩的定位可以通过很多⽅式查询，包括⽂献、抗体说明书、专业⽹站（如the

human protein atlas）等。

这⾥⼩六⼉也想提出⼀点疑问，希望看到帖⼦的⼤神给予解答。肿瘤⽅⾯的研究，我们可以将

正常组织和肿瘤组织作为阴性和阳性对照。那么我如果研究的炎症⽅⾯⽽并⾮某⼀种实质性的

病变，是否可以只⽐较实验中的对照组和实验组中棕黄⾊的深浅呢？

如下图所⽰，研究EndMT在炎症中的作⽤，CD31作为⾎管内⽪细胞的标志性蛋⽩，实验组CD31阳性结果明显减弱，重复三次以上实验后，是否就可以证明⾎管内⽪标志性蛋⽩减少？

7、 常见问题处理办法：a)⾮特异性染⾊是最常见的问题，刨除⽬的蛋⽩的定位，其余部位仍

显⽰黄⾊就可以判定⽚⼦出现了⾮特异性染⾊。⾮特异性染⾊出现的原因：EDTA或Tris作为抗

原修复液、⼲⽚、抗体的选⽤以及封闭时间。如果不是特殊的⽬的蛋⽩，建议选⽤柠檬酸盐作

为修复液，在保证制⽚过程中不出现⼲⽚的同时，适当延长封闭时间，并选⽤单克隆抗体。⼲

⽚最容易造成⾮特异性染⾊，同样以CD31为例，主要位于⾎管内⽪细胞的细胞膜上，但是在预

实验的过程中发⽣了⼲⽚，右图所见胞质中仍然呈现浅棕⾊的结果。

b)实验组阳性结果不明显。⼀般情况下，免疫组化实验已经是在前期初步证明成功的选择，所以

实验结果都会符合预期设想，那么如果阳性结果不明显，肯定是出在抗原修复不全、细胞通透

不全或DAB孵育时间过短等操作问题上。

免疫荧光

在之前的分享中，我已经写过⼀些细胞免疫荧光实验过程中的操作技巧和后续的图像处理分析问题，今天这⼀趴主要讲⼀下细胞状态对于结果判定的重要性。

结果判断：免疫荧光的结果判定和免疫组化⼤致相同，细胞状态的好坏，加药处理前和加药处

理后状态的好坏也是影响结果的关键。加药处理前的状态就不⽤说了，⾃⼰的细胞，状态什么

样是最清楚的。如下图圈出的结果，未加药处理的细胞中，PECAM同样作为内⽪细胞标志性蛋

⽩，本应分布在细胞膜上的蛋⽩，但是对⽐DAPI结果发现，右侧细胞核皱缩，左侧细胞核也染

上了红⾊。

那么加药处理后，有些细胞可能在中间就已经发⽣的程序性死亡。我们还是以CD31为例，左图DAPI染⾊可见明显的细胞核皱缩情况。我们想做的是EndMT（内⽪间质转化），即内⽪细胞向

间充质细胞转型的过程，在这个过程中CD31表达减少。但是这张图可见，即便CD31染⾊减

弱，从细胞核状态可见，这已经发⽣细胞程序性死亡，细胞皱缩；从右图可见，细胞形态变

圆，也是程序性死亡的⼀种表现，所以即便染⾊程度减弱，这也是⼀个失败的实验。

所以这就是为什么免疫荧光⼀定要做DAPI染⾊。当然了这不是唯⼀的原因，但却是的它的必要

性之⼀。

以上就是⼩六⼉今天的分享，最近⼀直在补实验，感觉⾝体被掏空，如果内容有什么问题，欢

迎⼤家批评指正！