免疫组织化学染色过程中出现问题及对策

科技信息2008年第27期SCIENCE&TECHNOLOGYINFORMATION

1941年coons首先用荧光素标记抗体,检测肺组织内的肺炎双球菌获得成功,从而创建了免疫组织化学技术。经过60余年的不断发展,由最初的直接免疫荧光标记法,逐渐发展出现了间接法,免疫酶法,免疫胶体金法,酶标记复合法等等。该方法的敏感性和特异性不断得到提高,使其成为医学和生命科学领域中研究组织形态、功能和代谢的一项有力工具[1—3]。随着该技术应用的普及和深入,免疫组织化学(免疫组化)染色技术作为病理诊断的主要辅助手段,各种新技术的引入以及新抗体相继问世,使免疫组织化学技术得到了更广泛的推广和应用,为临床病理诊断、肿瘤性质的判定、预后的估测等提供了重要依据。但是,由于影响其操作的因素较多,免疫组化质量不稳定常常困扰着免疫组化工作人员。本文举出了一些染色过程中出现的问题,并分析其中可能原因。1.阴性反应染色结束后,切片中见不到任何阳性信号。排除掉组织或细胞中确实不表达与抗体相关的抗原的原因外,还可能是染色过程中的某一或某些环节出了问题,出现了假阴性结果。可能原因如下:1.1操作失误有的组织必须经过抗原修复才能检测抗原表达,却未进行抗原修复[1,2];或选用了只能用于冰冻组织而不能用于石蜡包埋组织的抗体;或一抗失效,也可见于染色过程中漏掉了某一环节;还可能是所选用的检测系统与一抗不匹配,如选用的一抗是兔源性抗体,二抗错选了抗鼠源性抗体。解决办法:在三抗孵育结束时,将切片上的三抗滴在一张白纸上,再将配制好的DAB滴在白纸的三抗上,观察是否出现棕色。如果出现了,证明三抗和DAB的配制过程正确。如果不出现棕色反应,则三抗或DAB的配制过程有误。1.2假阴性造成假阴性结果的因素一般来自三方面:1.组织处理不当,抗原损失过多或被遮蔽;2.抗体(包括特异性一抗和标记抗体)失活,效价过低或稀释度不合适;3.染色步骤的差错或其他试剂的问题,如显色剂、缓冲液的离子强度及ph值[3]。解决阴性染色的问题,需要设立“阳性对照”和“阴性对照”。阳性对照包括两种,一种称为“自身对照”,对照和测试组织或细胞都在同一张切片中,都处于相同的试验条件下,结果更可靠也更具有可比性。另一种是在测试组织之外设置的阳性对照,称为“外部对照”。但在实际工作中如果每一种抗体都要选不同的阳性对照,工作量会很大,可以将多种不同组织集成在一起,制成多组织切片,组织芯片等切片待用。若阳性对照有表达,说明染色的全过程和所有试剂都无误。若测试片仍为阴性,便是真实的阴性,说明组织或细胞没有相应的抗原表达;反之则表明染色过程中某个步骤或试剂出了问题。阴性对照也分为“阴性组织对照”和“阴性试剂对照”,指利用不含靶抗原或缺少免疫试剂的同步处理和标记染色的免疫组化染色对照。若阴性对照试验结果为阴性,而测试片有结果,则应结合阳性对照分析其结果;若阴性对照为阳性,则染色过程中某个步骤或试剂出了问题。2.“杂音”染色免疫组化除正常的真实的阳性信号外常常会遇到不正常的背景着色,这些非正常的着色称为“杂音”染色。“杂音”染色种类繁多,主要可归纳如下。2.1边缘着色切片边缘着色也是一种常见的现象,这种现象称为边缘效应。产生的原因1.组织边缘与玻片粘贴不牢,边缘组织漂浮在液体中,每次清洗不易将切片下的试剂洗尽所致。应结合实际切出合适厚薄的切片,同时要看玻片上胶量是否合适。2.切片上滴加的试剂未充分覆盖组织,孵育时边缘的试剂容易变干,浓度较中心组织高而致染色深。解决办法:试剂要充分覆盖组织,应超出组织边缘。2.2片状着色切片中着色区东一块西一块,呈片状分布,出现这种问题的原因有:1.操作过程中出现失误,如孵育时,湿盒放置不稳;展片时气泡吸附到标本上;烤片时水未排尽;这些都可在标本局部形成气泡使组织突起,染色时试剂渗入后不易洗尽,显色过深所致。解决办法是,漂片盒里的,晾片台不能平放,应有45°左右的斜度,利于水流走和蒸发,同时滴加试剂时手法要轻,有气泡时用牙签捅破。2.组织坏死后细胞破坏、酶的释放、蛋白游离、分解,复杂的肽链残段(如Fc段)可能与一抗或/和二抗结合,此外游离出的过氧化物酶可被组织细胞吸附,导致最终着色不均。解决办法是在选择染色切片时应避免选择坏死组织较多的切片[3]。3.制作APES胶片时,胶的浓度太高,干燥后在玻片上留下白色小点,显色时白色小点着色。解决办法是按照标准的制备方法进行,因丙酮逐渐挥发而使胶变浓,应不断加入一些丙酮[4,5]。3.非特异性染色非特异性染色是指非靶性抗原或抗体的呈色,是一种常见的染色“失败”现象。3.1非特异性背景染色观察到整个切片全都染上了颜色,背景出现大面积阳性反应,着色的强度可深可浅,但阳性和阴性区域不明朗。3.2非特定部位着色非特定部位着色是指染色部位不是该抗原所在位置。3.2.1间质着色抗原应在胞内,却显示间质着色。组织固定不好,导致细胞破裂,内容物大量进入间质,是导致间质着色的主要原因;此外抗体与组织中的蛋白质因蛋白疏水基团相互作用形成非特异性的结合,而导致间质着色。抗体不纯或抗体被污染也可出现间质着色。3.2.2细胞核着色不适当的标本处理可导致细胞核着色,如组织在二甲苯、缓冲液中浸泡时间太长、组织变干、微波修复液的pH值和修复时间不当或修复过程中修复液留下得太少,未覆盖组织等。除去组织处理及孵育过程不当外,造成非特异性染色的原因有:1.内源性成分的影响:如组织的自发荧光和诱发荧光,可采用伊文斯蓝衬染、组织干粉吸收、胰蛋白酶消化等方法处理;而一些血红蛋白(红细胞)、过氧化氢酶(肝、肾)等内源性过氧化物酶,可以采用H2O2处理复水后的标本来阻断;肝、胰、肾,尤其是新鲜未固定的组织有丰富的内源性生物素,或者组织经福尔马林固定、石蜡包埋后生物素被封闭,抗原修复后造成内源性生物素暴露,可在加一抗前,用血清封闭来避免该非特异性结合。此外非生物素检测系统Polymer两步法(EliVision、EnVision)可避免生物素干扰[3,6]。2.抗体的影响:一抗变质、或者采用了质量差的多克隆抗体;抗体孵育时间过长或温度较高,要多做预备试验根据染色结果进行调整;此外还应区分抗体是IG还是IM型,IG的受体广泛存在于组织内,它与IG的结合不受种属限制,近系动物之间,尤其(下转第35页)免疫组织化学染色过程中出现问题及对策万安(安庆师范学院安徽安庆246000)【摘要】免疫组织化学法由最初的直接免疫荧光标记法,逐渐发展出现了多种方法。其敏感性和特异性不断得到提高,该方法具有技术统一,定性可靠,定位精确和定量准确等优点,但由于其步骤繁多,影响因素众多。本文列举了在该技术应用过程中存在的一些常见问题,并分析其中可能的原因。实验者应系统地分析和查找染色过程中原因,以便找到有效的解决方法,更要严格操作步骤,减少人为失误造成的干扰。【关键词】免疫组织化学;阴性反应;杂音染色;非特异性染色○高校讲坛○

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●石门揭煤中过煤层段容易掉顶冒落,一直是个不好解决的难题,其危害有三:一是顶板管理安全威胁大;二是减慢巷道施工进度,降低工效;三是易引起瓦斯超限或诱导煤与瓦斯的突出事故。为了有效解决这些问题,我们在-720m东翼新增进风石门掘进揭13-1煤施工中在顶板管理上进行了深入的探索。l.揭煤巷道的基本状况1)-720m东翼新增进风石门是-720m辅助水平的一条主要进风巷,巷道设计长为1302m。该进风石门将穿越煤与瓦斯突出煤层13-1煤,13-1煤层厚度4.6～6米,煤层产状为185～195°∠10～15°,原巷道已于巷道顶板距离13-1煤底板法距3米位置停头打钻抽排瓦斯近一年。2)巷道为直墙半圆拱,设计断面尺寸B*H=5.2m×4.1m,锚网喷(注)支护,过煤层、地质异常带采用架U29型刚性棚支护,棚间距0.6m。采用爆破法施工,揭煤期间采用侧装机进行出货。3)由于是新水平东部首次过突出煤层,过煤层时严格按揭煤程序进行,采取全断面一次爆破。2.施工中出现的问题施工新增进风石门过程中,在揭13-1煤层前,巷道刚见煤就发生了小规模的炮后掉顶,最大掉顶高度在1～2.5m,正常架棚的前探梁配超前锚杆控制超前掉顶效果较差。由于大量顶板的超前掉落,放炮后出现瓦斯涌出量异常回风瓦斯浓度最高达0.70%。针对出现的问题,通过分析,主要存在以下几个问题:一是超前锚杆护顶时锚杆间距布置的比较稀,由于前期排瓦斯卸压围岩已经松动,所以在炮后破碎的煤岩从较大的锚杆间隙中掉落;二是护顶距还是短,除了锚杆后端搭在最前一棚棚梁上,炮后由于松动煤岩体的滑落使得前端也露出,当顶板一来劲时前端下沉弯曲。针对这种情形,对施工工艺进行了改进:一是超前锚杆间距由原来的300～400mm缩小到100mm,密集均布;二是超前锚杆眼深由原来的1500～1700mm增加到2000～2200mm。采用了加强超前支护的方案。在巷道继续向前掘进时迎头顶部超前锚杆,每个眼距控制在100mm、眼深2.0～2.2m,沿巷道周围轮廓均匀布置。打好后,每孔内穿1根￠25×2500mm锚杆进行超前护顶。超前锚杆在支护好后再从原孔中拔出进行下一循环的使用,每茬炮前进行一次,超前锚杆在使用中规定,炮后锚杆留入岩体的深度不得小于500mm,见图。采用加强超前支护后超前锚杆由原来的15～20根增加到40根左右使得顶板支护有明显好转。采用了加强超前锚杆支护后顶板控制的相当稳定,在这基础上进尺由原来的小循环0.6m改为了正常循环1.2米。采用这种做法进行揭煤时的顶板安全管理,再未发生超前掉顶、冒顶事故。3.结束语巷道顶板掉顶、冒顶问题不处理好,将是安全最大的隐患,特别是石门揭煤过程中尤为重要。发生掉顶、冒顶事故,不仅在自然发火、瓦斯管理方面留下隐患,还将直接影响掘进工效,同时又会造成大量人力物力的投入,增加成本。通过超前支护的使用及改进,有效地解决了石门揭煤过程中煤层掉顶的安全问题,同时节省了人工及材料,加快了掘进速度(由原来的小循环0.6m增加到1.2米)。但超前锚杆打眼的控制等还需进一步提高,同时对极破碎煤层的使用效果还不太好,可以考虑采取过煤层超前注浆然后掘进的办法。作者简介:潘忠信,男,1963年生,1985年毕业于陕西煤校采煤专业,1994年毕业于淮南矿业学院采矿工程专业。现任淮南矿业(集团)公司谢桥煤矿生产技术科副科长。曾获省科技成果2项,集团公司成果奖8项。[责任编辑:韩铭]超前锚杆在石门揭煤中的应用潘忠信(淮南矿业集团谢桥矿生产技术科安徽淮南232000)【摘要】本文介绍了石门揭穿厚煤层过程中,沿巷道顶上部及周边打超前锚杆进行超前支护顶煤的方法,达到了防止顶煤掉落或冒顶的效果。这种方法简单可行,有很好的实用价值。【关键词】超前锚杆;石门揭煤;方法;效果

科●(上接第217页)是未固定的样本中更易出现这种非特异性染色;建议每次使用新抗体前应当对其工作浓度进行测试,使每一抗体个体化,找到适合自己实验室的理想工作浓度,不能只简单的按说明书进行染色[3]。3.DAB变质和显色时间太长:DAB现用现配,如有沉渣应进行过滤后再用。显色最好在显微镜下监控,达到理想的染色程度时立即终止,避免显色时间过长[5]。4.组织的吸附:胶原、脂肪等结缔组织与免疫球蛋白有吸附作用,可以用胰蛋白酶消化以及用正常动物血清处理切片可以减少非特异性染色[3]。总之,凡是组织细胞内具有抗原性的物质,如肽类、激素、神经递质、细胞因子、受体、表面抗原等均可用免疫组织化学方法显示,可以对所研究的大分子物质进行定位、定性与定量,进而深人研究其功能,综合分析其作用机理。使免疫细胞化学得到广泛应用,但由于其步骤繁多,哪一步出错,都将影响染色结果[5]。病理检验工作者应该严格操作步骤,减少人为因素造成的干扰。当免疫组化染色没有出现预期的效果时,应系统地分析和查找原因,以便找到有效的解决方法,使实验结果更可靠。【参考文献】[1]蒋金芳,高静,王兆平.《免疫组化技术的改进》.农垦医学,2001,23(6):392一393.[2]田野,张伟,周永梅等.《影响免疫组化染色结果的几点体会》诊断病理学杂志,2003,10(3):185.[3]戴益民.《免疫组织化学结果的分析和判断》.见:倪灿荣,马大烈,戴益民.《免疫组织化学实验技术及应用》北京:化学工业出版社2006:128—140.[4]杨秀静,陈书媛.《免疫组织化学胶片制作方法的改进》.临床和实验医学杂志,2006,5(6):805.[5]刘华庆,欧阳旭红.《免疫组织化学的标准化》.贵州医药,2001,25(8):754-755.[6]周小鸽,王鹏,陆鸣等.《加热抗原修复对内源性抗生物素蛋白结合物的影响及其对策》.中华病理学杂志,2002,31(6):491.作者简介:万安,男,硕士,助理研究员,研究方向:神经生物学。[责任编辑张艳芳]科

●○矿业天地○

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