大型海藻发酵生产甲烷技术研究

生物甲烷发酵过程中系统工程的研究生物甲烷发酵是一种常见的生物质转化方式，通过微生物生长代谢产生的甲烷可以作为一种可再生能源用于生产电力、热力或者燃料等。

然而，在这种生物转化过程中却涉及到很多复杂的环境因素和微生物反应机制，因此需要进行系统工程的研究。

一、生物甲烷发酵的基本原理生物甲烷发酵是一种针对有机物的微生物生物分解转化方式，主要涉及到以下三个过程：（1）有机物的水解和酸化在水解和酸化过程中，水解细菌分解有机物质成为糖类，中性和烷基酸等化合物，并且随着酸度的增加，产生大量的气体如CO2、H2等。

（2）乙酸型双歧杆菌的产酸和乙酸转化随着酸度的升高，乙酸型双歧杆菌产酸转化有机物成为甲酸、乙酸以及氢气，其中乙酸是最主要的产物，质量分数可达50%-70%。

同时，乙酸型双歧杆菌将乙酸转化成为氢气和CO2。

（3）甲酸型厌氧菌的产甲烷和氧化亚硫酸盐由甲酸型厌氧菌通过产生甲烷和氧化亚硫酸盐来转化乙酸，其中甲烷是最主要的产物。

生物借此过程产生的气体，包括甲烷和CO2，是从生物柴油里被分离出来的可再生能源。

以上三个过程共同涉及到了微生物的生长、代谢以及基因表达等复杂机制，因此需要进行系统性的工程研究。

二、生物甲烷发酵过程中的系统工程研究为了提高生物甲烷发酵过程的效率和稳定性，需要进行以下两个方面的系统工程研究。

（1）反应设备和系统设计为了实现生物甲烷发酵过程的正常运行，需要考虑到反应设备的合理设计，如反应器的结构、工作方式、气体进出口以及控制系统等方面。

同时，反应系统的连接设计以及气体处理设计也十分重要，要确保气体的稳定和高纯度，以免产生不良效果。

（2）微生物菌群调控为了实现微生物的生长、代谢和基因表达等复杂机制的优化，需要对微生物菌群进行调控。

这种调控可以使用预处理技术、菌群筛选、调控介质等方式实现，并且可以通过微生物群落分析、响应面分析、路径分析等方式进行综合评估和预测，以提高微生物菌群调控的效率和可行性。

三、结论生物甲烷发酵是一种可再生能源的重要来源，但是这种转化过程涉及到较为复杂的微生物生长、代谢和基因表达等机制，因此需要借助系统工程的研究和设计来优化反应系统的运行和微生物菌群的调控。

废弃物微藻厌氧消化产氢气和甲烷的优化研究原林虎;原雨桐【摘要】本文探究了影响微藻厌氧消化的因素(有机负荷、酶预处理、温度)并优化了工艺参数.结果表明:微藻生物质的最佳有机负荷为10.0 g/L,相应的氢气最大产量为18.8 mL/g(以单位挥发性有机质计算),挥发性脂肪酸最大产量为789 mg/L.蛋白酶预处理能够强化微藻水解酸化,且蛋白酶最佳剂量为1.0 g/L,氢气最大产量为20.5 mL/g,pH最低值为5.4.最后在产甲烷相中优化微藻厌氧消化的温度,35℃是产甲烷相最佳温度,甲烷的最大产量为238.9 mL/g,高温环境产生的过程产物反馈抑制了产甲烷菌的活性从而导致甲烷产量下降.【期刊名称】《工业安全与环保》【年(卷),期】2018(044)011【总页数】4页(P80-83)【关键词】微藻;两段式发酵;水解;酸化;氢气【作者】原林虎;原雨桐【作者单位】太原城市职业技术学院城建系太原030027;上海应用技术大学鲁班书院上海201418【正文语种】中文0 引言微藻含有丰富的有机质(碳水化合物4%～57%，蛋白质8%～71%和脂类2%～40%)，是厌氧消化产氢气和甲烷的理想原料[1]。

然而在实际工程中多种因素共同作用导致微藻厌氧消化获取的氢气和甲烷远低于理论计算值[2]。

近年来，应用两相厌氧消化系统处理生物质废物受到广泛关注，两段式厌氧消化将水解酸化相和产甲烷相分离开，从而控制每个阶段中微生物处于优势动态[3]；此外，与单一相消化系统相比还解除了挥发性脂肪酸(VFA)迅速积累或过度酸化引起的pH值下降而导致产甲烷过程终止的现象[4]。

因此，生物质两段式厌氧消化产氢气和甲烷得到越来越多的研究。

生物质厌氧消化制取甲烷主要包含4个连续的生化过程：水解、酸化、同型产乙酸和甲烷化[5]。

在水解过程中，难降解的有机物在特定功能的转性厌氧或兼性厌氧微生物分泌水解酶的作用下水解为溶解性或大分子有机物。

水解过程是有机物厌氧消化的限速步骤，预处理常用于提高有机物的水解速率[6]。

海藻能源的生物质燃烧与能源转换技术研究随着全球对可再生能源需求的增加和对传统能源排放的关注，海藻能源作为一种绿色、可持续的能源选择引起了广泛的关注和研究。

海藻能源的燃烧与能源转换技术研究是探索开发海藻能源潜力的重要方面，为达到清洁能源转型的目标提供了新的希望。

海藻是一种富含蛋白质、矿物质和糖类的海洋生物，其广泛分布于世界各大洋。

海藻在生物地球化学循环中扮演着重要的角色，能够吸收和储存大量的二氧化碳，并释放出氧气。

因此，利用海藻能源不仅可以减缓温室气体的排放，还有助于改善海洋环境和生态系统。

海藻能源的燃烧与能源转换技术是将海藻转化为燃料并进行能源转换的过程。

常用的海藻能源转化技术包括燃烧、气化和发酵等。

其中，燃烧是最为常见和广泛应用的海藻能源转化技术之一。

海藻燃烧技术是指将海藻制成干燥燃料，然后通过燃烧反应释放能量。

海藻燃料具有高碳含量、低灰分和硫含量的特点，因此可以作为代替煤和油的清洁能源。

海藻的燃烧通常需先经过干燥、研磨和压缩等工艺以提高燃烧效率和能量密度，然后进行燃烧过程。

燃烧过程中，海藻释放出的热量可以用来产生蒸汽驱动发电机以产生电力。

海藻燃烧技术的主要优势在于其低碳排放和可再生性。

由于海藻在生长过程中吸收了大量的二氧化碳，其燃烧过程只释放出等于或略高于所吸收的二氧化碳量，从而实现零净排放。

与化石燃料相比，海藻燃料的燃烧过程没有硫、氮等污染物的排放，减少了空气污染和酸雨的形成。

此外，海藻可持续种植和丰富的海洋资源使得海藻能源在能源供应方面具有更高的安全性和稳定性。

然而，海藻能源的燃烧与能源转换技术也存在一些挑战和问题。

首先，海藻种植和收获的成本较高，技术难度较大，需要依赖于适宜的海域和水质条件。

其次，由于海藻本身的含水率较高，其干燥和燃烧效率仍然是一个亟待解决的问题。

此外，海藻燃烧过程产生的灰渣处理和废弃物管理也需要进一步研究和改进。

为了克服这些挑战和问题，研究人员积极努力开发新的海藻能源燃烧与能源转换技术。

大型海藻厌氧发酵特性研究张毅;孔晓英;孙永明;王忠铭;李连华;杨立贵;任守军;袁振宏【摘要】文章采用中温批式厌氧发酵工艺,研究清洗及未清洗海带在不同接种率下,盐度对厌氧发酵特性的影响.研究结果表明:相同底物浓度发酵时,未清洗海带的产气性能要优于清洗海带,无机盐对产气率提高约13％～25％.未清洗海带组在盐度为12.96 g·L-1时的产气性能最佳,产气率和产甲烷率分别为464.4±0.39和288.28±0.24 mL CH4·g-1VSadded,比相同条件下清洗海带的产甲烷率提高29.56％,此时发酵液中主要金属离子浓度K+4780 mg·L-1,Mg2+ 250 mg·L-1,Ca2+ 130 mg·L-1和Na+ 1600mg·L-1,表明适宜浓度的无机盐有利于厌氧发酵的产气性能.【期刊名称】《中国沼气》【年(卷),期】2016(034)003【总页数】6页(P3-8)【关键词】海带;接种率;盐度;厌氧发酵;甲烷【作者】张毅;孔晓英;孙永明;王忠铭;李连华;杨立贵;任守军;袁振宏【作者单位】中国科学院广州能源研究所中国科学院可再生能源重点实验室,广东广州 510640;中国科学院大学,北京 100049;中国科学院广州能源研究所中国科学院可再生能源重点实验室,广东广州 510640;中国科学院广州能源研究所中国科学院可再生能源重点实验室,广东广州 510640;中国科学院广州能源研究所中国科学院可再生能源重点实验室,广东广州 510640;中国科学院广州能源研究所中国科学院可再生能源重点实验室,广东广州 510640;中国科学院广州能源研究所中国科学院可再生能源重点实验室,广东广州 510640;中国科学院大学,北京 100049;兰州理工大学西部能源与环境研究中心,甘肃兰州 730050;中国科学院广州能源研究所中国科学院可再生能源重点实验室,广东广州 510640【正文语种】中文【中图分类】S216.4生物质能因清洁低碳、可再生和原料丰富等特点受到越来越多国家的关注，但以高粱玉米等粮食作物为代表的第一代能源作物和以纤维素类为原料的第二代能源作物因其占用大量耕地肥料等限制了其发展前景，而藻类作为第三代的生物质能，具有不与“粮”争地、生长迅速、单位面积产量高和资源量丰富等优点[1]，正成为未来生物能源的研究焦点。

高浓度有机废水厌氧发酵连续产氢产甲烷的试验研究的开题报告一、研究背景随着我国经济发展与工业化进程的加速，有机废水的高浓度排放已成为环境污染的一个主要来源。

同时，能源危机、全球温室气体排放问题等也需要开发出清洁能源替代化石燃料。

因此，开发有机废水资源，利用其产生清洁能源成为了当前的一个热点研究方向。

产氢和产甲烷是两种重要的清洁能源，通过有机废水的厌氧发酵可同时进行产氢和产甲烷的过程。

因此，该研究能够开发出清洁能源的同时减轻有机废水对环境的污染。

二、研究内容本次研究将采用高浓度有机废水为原料，在适宜的温度和厌氧环境下，利用菌群的代谢作用产生氢气和甲烷。

主要包括以下内容：1. 选择合适的菌种和培养条件，确定实验参数，包括初始pH值、温度、有机物浓度、厌氧时间等。

2. 通过气相色谱仪分析发酵液中产出的氢气和甲烷的含量、气相时间和气体比例等参数。

3. 研究产氢产甲烷的连续性，通过在不同的发酵时间内取样分析气体产出情况，确定其产气和产甲烷的连续性和稳定性。

4. 研究厌氧发酵产生的污泥的性质和特点，通过显微镜和扫描电镜等手段观察污泥的形态、大小和菌群成分等。

三、研究意义1. 通过利用有机废水生产清洁能源，达到废物资源化的目的，为环境保护和可持续发展做出贡献。

2. 研究不同有机废水的处理方式对产氢产甲烷的影响，为有机废水处理提供技术参考。

3. 在技术层面，优化发酵条件，增加产氢和产甲烷的效率和稳定性，推动清洁能源的开发和利用。

四、研究方法1. 实验室试验：在实验室内进行试验，选用高浓度有机废水作为原料，采用倒置式发酵罐进行厌氧发酵，通过气相色谱仪等手段分析气体成分及含量。

2. 文献调研：对厌氧发酵产氢产甲烷的机理、影响因素等方面进行文献调研，为研究工作提供理论基础。

3. 数据处理：对实验获得的数据进行处理、分析和比较，得出结论并进行解释。

五、预期成果1. 牔种训练：确定适合厌氧发酵的菌种，增加产氢和产甲烷的产量。

生物甲烷发酵技术及其应用研究生物甲烷发酵技术是一种利用微生物代谢产生甲烷的过程，也称为生物甲烷化。

它不仅具有经济效益，而且在环境保护方面也有积极作用。

本文将分别介绍生物甲烷发酵技术的基本原理、影响因素和应用情况。

一、生物甲烷发酵技术的基本原理生物甲烷发酵技术的基本原理是通过微生物代谢作用将有机废弃物转化成甲烷和二氧化碳。

该过程可以分为4个阶段：厌氧条件下的水解、酸化、乙酸型反应和甲烷型反应。

其中，厌氧菌通过分解有机物来产生氢、二氧化碳和短链有机酸，如乙酸、丙酸等，然后乙酸菌将这些短链有机酸进一步转化为氢和二氧化碳，甲烷菌最后利用氢和二氧化碳来合成甲烷。

二、影响生物甲烷发酵技术的因素生物甲烷化过程受到多种因素的影响，如温度、PH值、废弃物浓度、营养盐和微生物群落等。

其中，温度是控制生物甲烷化反应速率和反应容易性的重要因素，一般情况下，生物甲烷化反应在20-60℃之间都能进行，但较为适宜的温度为35-40℃。

另外，PH值也是影响生物甲烷化反应的关键因素之一。

大多数甲烷菌的适宜PH值为6.5-8.5，但低PH值能够抑制厌氧消化过程，高PH值则会导致废弃物中铵离子转化为氨并对生物菌群产生极大的影响。

三、生物甲烷发酵技术的应用情况生物甲烷发酵技术的应用非常广泛，特别是用于市政污水处理和发电。

以市政府污水处理为例，通过将污水和其他有机质废弃物置于一定条件下，可以利用生物能源产生电力和热能。

此外，废弃物甲烷化是另一项典型的应用，它可以将各种有机浓缩物料如废弃食品、家禽养殖粪便、食品加工废水等转化为一种可再利用的能源。

这一项技术在解决一些环境污染问题的同时，还能够产生经济效益。

总结生物甲烷发酵技术作为一项环保技术，已经在多个领域得到应用。

目前，随着技术的不断进步和人们对环保的重视，该技术得到了广泛的关注。

当我们利用生物甲烷发酵技术来处理废弃物时，不仅可以减少废弃物对环境的污染，而且还能产生质量高、节能、环保的生物能源，很好地解决了废弃物处理和能源缺乏两大难题。

中国环境科学 2017,37(2)：702~710 China Environmental Science 水体中蓝藻水华分解产甲烷动态过程研究胡万婷1,2,唐千2,3,孙伟2,4,朱立峰1,邢鹏2*(1.南京师范大学生命科学学院,江苏南京 210046；2.中国科学院南京地理与湖泊研究所湖泊与环境国家重点实验室,江苏南京 210008；3.中国科学院大学,北京 100039；4.南京信息工程大学应用气象学院,江苏南京 210044)摘要：在巢湖开展蓝藻分解的原位围隔实验,实验期间测定围隔中层水体溶解性甲烷浓度和主要理化因子,通过定量PCR的方法测定产甲烷菌mcrA基因拷贝数以及细菌和古菌16S rRNA基因拷贝数随时间的变化情况.结果显示:随着蓝藻有机质分解,水体产甲烷菌数量逐渐增加,溶解性甲烷浓度最高达到2.94mg/L;产甲烷菌mcrA基因拷贝数与甲烷浓度具有显著的正相关关系;同时还发现水体中的亚铁离子(Fe2+)含量与产甲烷菌的数量具有显著的正相关关系.上述结果支持蓝藻水华爆发导致水体也成为甲烷生物合成热点区域的观点.本研究获得的结果有助于进一步分析不同产甲烷热点区域(水体和沉积物)对湖泊甲烷总体释放量的贡献情况.关键词：甲烷；产甲烷菌；蓝藻水华；厌氧分解；巢湖中图分类号：X524 文献标识码：A 文章编号：1000-6923(2017)02-0702-09Dissolved methane dynamics during the degradation of organic matter derived from cyanobacterial bloom. HU Wan-ting1,2, TANG Qian2,3, SUN Wei2,4, ZHU Li-feng1, XING P eng2* (1.College of Life Sciences, Nanjing Normal University, Nanjing 210046, China；2.State Key Laboratory of Lake and Environment, Nanjing Institute of Geography Limnology, Chinese Academy of Sciences, Nanjing 210008, China；3.University of Chinese Academy of Sciences, Beijing 100039, China；4.Applied Meteorological Institute, Nanjing University of Information Science and Technology, Nanjing 210044, China). China Environmental Science, 2017,37(2)：702~710Abstract：In shallow eutrophic lakes, methane production during the decomposition of organic matter derived from cyanobacterial blooms and associated factors for the whole process in the water column remain poorly understood. In this work, in situ mesocosms experiment in Lake Chaohu were carried out to stimulate the Cyanobacteria anaerobic decomposition. During the process, dissolved methane concentration and the main environmental factors were measured at the water bottom. Quantitative real-time PCR method was applied to analyze the abundance of mcrA gene as well as the bacterial and archaeal 16S rRNA genes in each sample. Results showed that with the biomass decomposition, the amount of methanogens increased gradually in accordance with the accumulation of dissolved methane in the water column (maximum concentration 2.94mg/L). A significantly positive correlation was detected between mcrA gene abundance and the dissolved methane concentration. Furthermore, there was also a significantly positive correlation between ferrous ions (Fe2+) concentration and the methanogen mcrA abundance. Our results support for the notion that water column can be a hot spot for the biosynthesis of methane due to the outbreak of cyanobacterial bloom. This study helps to compare the relative contribution of methane production between water column and surface sediments during the cyanobacterial blooms degradation.Key words：methane；methanogens；cyanobacterial bloom；anaerobic decomposition；Lake Chaohu甲烷是大气中辐射强度仅次于二氧化碳的温室气体,其单分子增温效应是二氧化碳的25倍[1].大气中甲烷浓度的持续增长是由其源汇平衡的改变引起的.土壤、湿地和湖泊等生境中微生物分解有机质的产甲烷过程对全球甲烷产量有着巨大的贡献.据估计淡水湖泊对于自然界甲烷释放量贡献率为6%~16%[2-4],尤其是藻源性有收稿日期：2016-06-16基金项目：国家“863”项目(2014AA06A509);国家自然科学基金资助目(31370508);中国科学院青年创新促进会(2014273);湖泊与环境国家重点实验室开放研究基金(2012SKL005).* 责任作者, 副研究员, pxing@2期胡万婷等：水体中蓝藻水华分解产甲烷动态过程研究 703机质丰富的富营养化湖泊,更有利于甲烷的生成[5],这些湖泊对局域乃至全球温室效应的贡献亟待定量分析和评估.巢湖是我国污染最重的三大淡水湖泊之一[6],水体富营养化导致蓝藻水华持续爆发,8月水华爆发频度达到最大[7].微囊藻(Microcystis spp.)是巢湖夏季蓝藻的优势种[8],其柔软的细胞壁由复杂的糖类和蛋白质构成[9],容易被破坏和消化.大量微囊藻生物质的积累和分解会消耗水体中的溶解氧[10],造成局部湖区出现缺氧,甚至厌氧条件.溶氧条件是决定有机物分解途径和生成产物的关键因素[11].局部区域的缺氧会提高厌氧微生物尤其是产甲烷菌的活性.目前在巢湖还尚未开展过有关微生物驱动的产甲烷过程和机制的相关研究.传统观念认为,富营养化湖泊沉积物才是甲烷产生的热点区域[12-13],然而水体中是否有甲烷产生、其产生机制以及参与的微生物类群尚不清楚.此外,湖泊主要理化环境因子对水体产甲烷过程存在何种影响尚不明确.本研究采用气相色谱结合荧光定量PCR(qPCR)技术,通过比较不同蓝藻添加水平下,无底和有底围隔下层水柱的溶解性甲烷浓度,分析水体细菌、古菌以及产甲烷菌甲基辅酶M还原酶A(mcrA)基因拷贝数的动态变化,试图揭示水体中甲烷浓度动态变化的影响机制,为深入认识富营养化浅水湖泊碳循环和湖泊甲烷释放提供野外数据支持.1方法1.1原位围隔设置和样品采集2015年7月底在巢湖(北纬N31°31′49.01″东经E117°32′56.12″)岸带设置6个围隔,围隔尺寸为5.0m(长)×5.0m(宽)×3.5m(深).将围隔平分成有底围隔(底部密闭)和无底围隔(底部与沉积物和周围水体联通)2组,目的是探索在没有沉积物参与的情况下水柱中是否存在甲烷产生所需的环境条件.蓝藻直接从巢湖水面打捞富集.每组3个围隔分别设不添加蓝藻(Low),添加50L新鲜蓝藻(Middle)以及添加150L新鲜蓝藻(High).初始蓝藻生物量以叶绿素a (Chla)浓度表示,测定结果分别为15822.57,18131.60,22336.79μg/L.实验开始于2015年8月6日(第0d),而后于第2,5, 7,9,11,12d采集围隔中心水深2.0m处水样.1.1.1溶解性甲烷样品的采集用5L量程的Niskin 采水器采集围隔下层湖水,通过乳胶管将水样从釆水器缓慢注入100mL的玻璃顶空瓶底,避免气泡和涡旋产生,并使水样溢出约瓶容积的一半时,慢慢抽出乳胶管.立刻用带聚四氟乙烯内衬的丁基橡胶塞和铝盖将瓶口迅速密封,并用锡箔纸包住样品瓶身,放到黑暗的保温箱里,低温避光保存,尽快运到实验室,4℃冷藏室保存,用作溶解性甲烷的测定.1.1.2水体理化因子分析样品采集现场采用水质分析仪(YSI6920,美国)测定下层水柱的溶解氧(DO)、水温和pH.采水器里剩余的水样用洁净的棕色瓶子保存,用于下层水Chla、溶解性有机碳(DOC)和一些理化因子,包括总氮(TN)、总磷(TP)、硝酸根(NO3--N),亚硝酸根(NO2--N)、亚铁离子(Fe2+)的测定.将下层水样过滤到孔径为0.22μm的聚碳酸酯滤膜(GTTP04700, Millipore,美国)上,用于后续对产甲烷菌、古菌和细菌DNA 的qPCR定量分析.1.2样品理化因子测定TN、TP、NO3--N、NO2--N使用紫外分光光度计(UV-2450, Shimadzu公司,日本)测定. DOC分析运用总有机碳分析仪(TOC-V CPN, Shimad-Zu公司,日本).Chla采用丙酮提取法和紫外-可见光分光光度计(HP8452,Agilent Technologies公司,美国)测定.1.3甲烷测定溶解性甲烷采用气相色谱(GC7900,天美公司,上海)的FID检测器测定,进样口温度160℃;柱温90℃;FID检测器220℃.首先取固定的水样50mL置于120mL的顶空瓶中,水浴50℃振荡平衡40min.用气密性针抽取顶空上方的气体500μL,注入色谱进样口,点击开始进行测样.根据甲烷分压-峰面积标准曲线(R2>0.999)计算样品甲烷浓度,结果转化为单位体积水样含有甲烷的质量.计算公式[14]如下:704 中 国 环 境 科 学 37卷TC =55.5(p /H )(1000M )+(M /22.4)(T /273 )(pV 1/V 2) (1) 式中:TC 为溶解性甲烷浓度,mg/L ;p 为甲烷分压, mol/mol ;H 为甲烷亨利定律常数;M 为甲烷相对分子质量,g/mol ;T 为样品温度,°K ;V 1为顶空气体体积,mL ;V 2为水样体积,L . 1.4 水样基因组DNA 提取 将过滤水样的滤膜剪碎,浸没于TES lysis buffer(20mmol/L EDTA, 100mmol/L Tris, 0.8%SDS, pH 8.12),采用酚/氯仿/异戊醇方法提取DNA,将DNA 溶解在30μL 无菌水中备用.具体的DNA 提取步骤参见文献[15].1.5 qPCR 测定 1.5.1 标准品的制备方法 将提取的DNA 分别进行细菌16SrRNA 基因、古菌16SrRNA 基因和mcrA 基因的PCR 扩增,引物序列和退火温度见表1.PCR 反应体系为50μL,其中TAKARA Premix 25μL,前向和反向引物各2μL,模板DNA 1μL,无菌双蒸水20μL.PCR 反应程序:95℃预变性5min,95℃变性45s,退火30s,72℃延伸1min,共进行30个循环,72℃延伸10min,4℃保存.PCR 产物分别用1.2%琼脂糖凝胶电泳,运用胶回收试剂盒(DNA Fragment Purification Kit, TaKaRa 公司,日本)将目的基因片段割胶回收纯化.标准品运用DNA 浓度计(NanoDrop 2000c, Thermo Scientific 公司,美国)进行DNA 浓度测定.结果A 260nm /A 280nm 为1.8~2.0,表明标准品DNA 纯度可以用于qPCR.根据3种标准品DNA 浓度分别计算它们的基因拷贝数.换算公式如下: DNA(copies/μL)=6.02×1023 ×10-9×C /(DNAlength×660)[16] (2) 式中:C 为标准品浓度,ng/μL.将母液分别做梯度稀释,制成108~104copies/μL 一系列梯度浓度标准品分装冻存备用.表1 细菌16SrRNA,古菌16SrRNA 和产甲烷菌mcrA 基因qPCR 引物Table 1 qPCR primers for bacterial 16SrRNA, archaeal16SrRNA and mcrA gene of methanogen目标基因 引物序列退火温度(℃)目标片段长(bp)参考文献细菌16SrRNA 341F (5’-CCTACGGGAGGCAGCAG -3') 534R (5'-ATTACCGCGGCTGCTGG - 3') 56 193 [17] 古菌16SrRNA ARCH349F (5’-GYGCASCAGKCGMGAAW -3’) ARCH806R (5’-GGACTACVSGGGTATCTAAT -3’) 55 457 [18] 产甲烷菌mcrAmlas (5’-GGTGGTGTMGGDTTCACMCARTA -3’) mcrA -rev (5’-CGTTCATBGCGTAGTTVGGRTAGT -3’)55 409 [19]1.5.2 样品qPCR 检测 将3种标准品分别运用到qPCR 的样品检测中.以提取的微生物DNA 作为模板.qPCR 反应体系20μL:SYBR® Premix Ex Taq™(Takara,日本)10μL,引物各0.5μL,模板DNA 1μL,无菌双蒸水8μL.qPCR 反应在荧光定量仪(CFX96Touch, BI O -RAD, 美国)上完成.所有反应都设置两个平行,以及阴性对照(以无菌水为模板).3种目标基因定量都采用3步法.细菌16SrRNA 基因定量:95℃预变性2min,95℃变性15s,56℃退火30s,72℃延伸30s,35个循环(荧光信号在该处采集);熔解曲线分析,温度以1℃/30s 的速度从60℃上升到95℃.古菌16SrRNA 基因和mcrA 基因都遵循:95℃预变性2min,95℃变性15s,53℃退火30s,72℃延伸30s,35个循环;熔解曲线分析,温度以1℃/30s 的速度从60℃上升到95℃.3种标准曲线回归方程相关系数R 2>0.999,扩增效率在92%~105%之间,说明qPCR 达到了良好的扩增效果.根据样品的Ct 值计算样品的基因拷贝数,并将单位转化成copies/mL. 1.6 统计分析运用SPSS20.0软件进行统计分析.分析围隔的有无底以及蓝藻添加量的多少对各种环境因子和甲烷产量以及3种基因拷贝数的显著性影响.对按无底围隔和有底围隔归类、并且符合方差齐性的所有变量进行配对T 检验,对不合方差齐性的变量进行2个相关样本非参数检验;运用2期 胡万婷等：水体中蓝藻水华分解产甲烷动态过程研究 705Pearson 相关方法分析溶解性甲烷浓度与环境因子,如营养盐、金属离子、底物(Chla,有机碳)以及微生物数量(产甲烷菌,细菌,古菌基因拷贝数)的相关性.运用线性回归模拟甲烷产量和产甲烷菌数量的函数关系. 2 结果2.1 不同蓝藻添加量对产甲烷浓度的影响0 2 5 7911 12时间(d)溶解性甲烷浓度(m g /L )0 2 5 791112时间(d)溶解性甲烷浓度(m g /L )图1 不同蓝藻添加量围隔中层水柱溶解性甲烷浓度动态变化趋势Fig.1 Dissolved methane dynamics in mesocosms with different amount of Microcystis spp. biomass addition实验期间围隔中水温为19.9~21.5℃,pH 值为6.69~7.51.湖泊环境中溶氧条件是决定有机物分解途径和生成产物的关键因素.实验开始后6个围隔DO 浓度始终均为0mg/L,指示围隔体系中一直维持缺氧的状态.6个围隔中水体Chla 浓度均先增加,而从第7d 都大幅度减少,至第12d 各围隔Chla 平均浓度为479.15μg/L(最小浓度低于166.96μg/L),仅为初始浓度的0.75%.Chla 浓度的变化一定程度上反映了围隔中藻类的消亡过程,甲烷生成的底物可能大部分来自于蓝藻分解产生的有机质.如图1所示,大部分围隔下层水柱中的甲烷浓度在初期都很低,随着时间推移增加,最高可达2.94mg/L.围隔的有无底对甲烷的产量具有显著影响(P <0.05,图2).有底围隔的水柱中甲烷浓度高于无底围隔,尤其是当添加High 水平的蓝藻时,有底围隔中的甲烷浓度一直处于最高.蓝藻添加量对下层水柱甲烷产量的影响因围隔有无底而存在差异.添加不同蓝藻量的无底围隔之间,甲烷产量差异并不显著;而在有底围隔中,蓝藻不同添加量组间差异显著(P <0.05).在有底围隔中,蓝藻添加量越多,甲烷浓度越高,表明水柱中蓝藻赋存量会影响甲烷产量.0.00.20.40.60.81.01.21.41.6Low Middle High蓝藻添加量溶解性甲烷浓度(m g /L )图2 不同蓝藻添加量在无底和有底围隔中溶解性甲烷浓度比较Fig.2 Comparison of dissolved methane concentrationbetween mesocosms with and without bottoms2.2 蓝藻水华分解过程中细菌、古菌和产甲烷菌数量变化细菌和古菌16SrRNA 基因拷贝数总体上具有一致的变化趋势(图3).在厌氧分解初期,6个围隔的水柱中细菌和古菌16SrRNA 基因拷贝数均随时间推移而增多,几乎都在第5d 达到峰值.细菌16SrRNA 基因拷贝数最高6.85×109copies /mL,古菌的16SrRNA 基因拷贝数最高也有8.22× 108copies/mL.各个围隔的产甲烷菌mcrA 基因拷贝数呈现逐步增多的趋势,几乎均在第11d 达到峰值.其中添加High 水平的有底围隔下层水mcrA 拷贝数最高可达2.15×108copies/mL,增加幅度约为初始浓度的93倍.706中 国 环 境 科 学 37卷0 2 5 791112时间(d)l o g (基因拷贝数)456789101102579 11 12时间(d)l o g (基因拷贝数)45 6 7 8 9 0 2 5 791112时间(d)l o g (基因拷贝数)d. 蓝藻添加量为High 的无底围隔 4567891002579 11 12时间(d)l o g (基因拷贝数)45 6 7 8 9 10 11 0 2 5791112时间(d)l o g (基因拷贝数)4567891002579 11 12时间(d)l o g (基因拷贝数)图3 不同蓝藻添加量围隔细菌和古菌16SrRNA 基因以及产甲烷菌mcrA 基因拷贝数动态变化趋势 Fig.3 Dynamic of bacterial and archaeal 16SrRNA gene and methanogen mcrA gene copy numbers in mesocosms withand without bottoms under different amount of Microcystis spp.细菌16SrRNA 基因古菌16SrRNA 基因产甲烷菌mcrA 基因蓝藻添加量和围隔有无衬底对于细菌、古菌和产甲烷菌数量具有不同的影响.如图4a 所示,在无底围隔中,细菌数量随着蓝藻添加量增多而增多,在无底围隔中结果相反.统计分析显示围隔有无底对细菌16SrRNA 基因拷贝数存在显著影响(P <0.05).图4b 显示,蓝藻添加量在无底围隔中对于古菌数量的作用不明显.但是在有底围隔中,蓝藻添加量越多,古菌数量越多.有底围隔中古菌16SrRNA 基因拷贝数显著高于无底围隔.图4c 表明,在有底围隔中,产甲烷菌数量随着蓝藻添加量的增加而明显增多.蓝藻生物量对产甲烷菌具有重要影响(P <0.05).当蓝藻添加量相同时,尤其是添加蓝藻量都为High 水平,有底围隔中的产甲烷菌数量显著高于无底围隔.2期胡万婷等：水体中蓝藻水华分解产甲烷动态过程研究 7070.0 0.5 1.0 1.5 2.0 2.5 3.0 Low MiddleHigh蓝藻添加量细菌16S r R N A 基因拷(×109拷贝数/m L )蓝藻添加量古菌16S r R N A 基因(×108拷贝数/m L )蓝藻添加量产甲烷菌m c r A 基因 (×107拷贝数/m L )图4 不同蓝藻添加量无底和有底围隔细菌和古菌16SrRNA 基因以及产甲烷菌mcrA 基因拷贝数比较 Fig.4 Comparison of bacterial and archaeal 16SrRNAgene and methanogen mcrA gene copy numbers between mesocosms with and without bottoms under different amount of Microcystis spp.产甲烷菌mcrA 溶解性甲烷浓度(m g /L )图5 水体溶解性甲烷浓度与产甲烷菌mcrA 基因拷贝数的相关关系Fig.5 The correlation between methane concentration and mcrA gene copy number 产甲烷菌的数量与甲烷产量变化趋势具有一致性,统计分析显示产甲烷菌mcrA 基因拷贝数与甲烷产量显著正相关(Pearson r =0.855, P <0.0001,图5).在分解后期,添加High 水平蓝藻的有底围隔中,产甲烷菌mcrA 基因高拷贝数可能是高浓度甲烷产生的原因.2.3 与产甲烷过程相关的环境因子分析甲烷生成过程可能受到水体理化因子和微生物自身对于底物利用能力的限制.环境因子间的相关分析结果显示,围隔中TN 、TP 浓度彼此密切相关;NO 3--N 浓度与Chl a 浓度呈负相关(r = -0.377,P <0.01),即蓝藻厌氧分解过程中随着Chl a 浓度逐渐下降,NO 3--N 浓度升高.相关性分析还显示许多环境因子对产甲烷菌、细菌和古菌数量都存在潜在的影响.产甲烷菌数量与Chl a 浓度和溶解性有机碳DOC 均显著正相关,蓝藻生物质(以Chl a 表征)分解过程向周围水体释放DOC,可以为产甲烷菌生命活动提供所需底物.此外还发现不论产甲烷菌mcrA 基因拷贝数还是甲烷浓度都与Fe 2+浓度显著正相关.产甲烷菌、细菌和古菌的基因拷贝数变化都与TN 存在显著的正相关关系.水体中溶解性甲烷浓度除了与产甲烷菌数量相关,还与细菌、古菌数量存在正相关性.藻源性有机质降解过程是各种功能微生物共同作用的结果,某些功能菌群将蓝藻有机质大分子分解成小分子量的中间产物才可被产甲烷菌利用生成甲烷. 3 讨论3.1 蓝藻水华分解形成的环境条件有助于甲烷的生物合成产甲烷过程涉及到一系列酶促反应,其代谢过程受到环境因子(如温度、pH 值和金属离子等)的影响.大部分产甲烷菌最适生长温度通常在4~20℃[20],实验过程中围隔中下层水温平均为20.7±0.6℃,适宜产甲烷菌生长繁殖.产甲烷菌最适生长pH 值为近中性环境[21],本实验测得水体pH 平均值为7.45±0.06,符合产甲烷菌对pH 值的需求.研究结果还显示,有底围隔水体Fe 2+浓度为708 中 国 环 境 科 学 37卷0.36~2.9mg/L,显著高于无底围隔(0.19~1.5mg/L).由于微囊藻对铁(包括二价铁和三价铁[22])具有较强的吸收与储存能力[23],分解过程导致细胞内存贮的铁元素释放.而且,低氧化还原电位的缺氧水体也有利于Fe 2+的稳定存在[24].相关分析显示,围隔水体中Fe 2+与甲烷浓度具有极强的正相关性(r=0.764,P <0.001).Fe 2+对甲烷生成可能存在积极影响[25],一方面Fe 2+是厌氧微生物不可缺少的微量元素,而且更是产甲烷菌生存必需元素[26],可以作为产甲烷菌的能量载体[27],另一方面Fe 2+是许多酶的组成成分,还可以降低氧化还原电势[28].我们推测Fe 2+大量存在可能有助于产甲烷的生物合成.关于Fe 2+促进产甲烷过程的生物学机制有待进一步研究.3.2 湖泊厌氧水体中存在剧烈的产甲烷作用有研究报道,产甲烷菌主要存在于湖泊沉积物和具有厌氧环境的颗粒物中[29].本研究设置有底和无底围隔的处理,试图明确在水柱中是否存在藻源性有机质分解产甲烷所需的环境条件,换言之,通过原位模拟实验分析在无沉积物参与的情况下是否能够完成蓝藻有机质生产甲烷的微生物转化过程.关于我国富营养化浅水湖泊水体产甲烷菌数量的报到并不多见.本实验较为系统的研究了水体中甲烷产生的环境条件以及产甲烷过程的动态变化.有底围隔中未添加蓝藻时产甲烷菌mcrA 基因拷贝数就有4.64×104copies/mL,高于淡水湖泊Kivu 水柱中mcrA 基因拷贝数(4.15×102 ~3.35×103copies/mL)[18].添加High 水平蓝藻的有底围隔在厌氧分解后期, mcrA 基因数最高增加到初始浓度的近100倍,高达2.15×108copies /mL.这一数值超过了黑龙江、安徽、山东地区沼气池的沼泥样品发酵后期沼液中产甲烷菌mcrA 基因拷贝数的最高值7.91×105copies/mL (仅比发酵初期的沼液中的产甲烷菌数量增加了2.1倍)[30],更远远高于Kivu 湖夏末底层水柱中的产甲烷菌mcrA 基因拷贝数(2.21×103copies /mL)[18].可见,藻源性有机质厌氧分解会引起产甲烷菌的快速增殖.表2 主要环境因子,细菌16SrRNA 、古菌16SrRNA 和产甲烷菌mcrA 基因之间相关系数Table 2 The correlation coefficient among major environmental factors, bacterial 16SrRNA, archaeal 16SrRNA andmcrA of methanogen参数 TNTPNO 3--N Fe 2+ Chl a DOC CH 4产甲烷菌mcrA细菌16S rRNATP 0.738** NO 3--N 0.325** 0.364* Fe 2+ - - -Chl a0.461**0.412**-0.377* 0.682**DOC 0.557** 0.811** - --CH 4 0.401** 0.659** 0.489** 0.764**- 0.511**产甲烷菌mcrA 0.363** 0.737** 0.492** 0.674** 0.602** 0.497** 0.855**细菌16SrRNA 0.311*-- - - - 0.331* -古菌16SrRNA0.344** 0.518** ---- 0.499** 0.392* 0.501*注:*表示P <0.05水平上显著相关;**表示在P <0.01水平上显著相关;-表示无显著相关关系.围隔水体中溶解性甲烷产量随着藻源性有机质厌氧分解而增多,平均峰值(1.08±0.44)mg/L,远远高于长江下游底层水体中甲烷的平均浓度[(0.88±0.49)×10-3]mg/L 以及鄱阳湖入长江口的甲烷浓度(3.9×10-3)mg/L [31].而其他淡水湖泊,如芬兰南部城市一个富营养化湖泊Vesijärvi 湖的下层缺氧水柱中甲烷平均浓度也只0.23mg/L [32].富营养化Kasumigaura 湖水体溶解性甲烷浓度2期胡万婷等：水体中蓝藻水华分解产甲烷动态过程研究 709在夏末时期最高,但不超过0.056mg/L[33].蓝藻水华形成后的太湖梅梁湾水柱中的甲烷含量仅有0.37~0.67mg/L[29],但水体产甲烷菌数量未见报道.不仅如此,蓝藻水华分解后期水体中溶解性甲烷浓度最高达到2.94mg/L.而且当添加的外源性蓝藻有机质的量越多时,产甲烷菌数量也越多,这表明蓝藻生物量赋存为产甲烷菌提供厌氧环境和丰富的基质.外源有机质的累积刺激甲烷的生成[34].本研究结果表明,蓝藻水华频繁爆发的局部湖区,缺氧水体同样可以成为产甲烷的热点区域,因此,水华严重的湖泊中甲烷的生成绝不仅仅局限于沉积物中的反应过程.4结论4.1水华爆发导致的蓝藻生物质堆积分解,造成水体缺氧或者完全厌氧,显著促进了产甲烷菌的增殖.蓝藻水华不仅为产甲烷菌提供了厌氧环境,还为其提供了丰富的基质.4.2多种环境因子对产甲烷菌的数量和溶解性甲烷浓度存在影响,水体中Fe2+的积累可能是促进甲烷生成的诱因之一.4.3研究证实在缺氧水体中也能发生剧烈的产甲烷过程.藻源性有机碳在湖泊多位点的厌氧分解, 将加速富营养化浅水湖泊的碳循环过程,增加温室气体甲烷释放的风险.参考文献：[1] 陈槐,周舜,吴宁,等.湿地甲烷的产生、氧化及排放通量研究进展 [J]. 应用与环境生物学报, 2006,12(5):726-733.[2] Borrel G, Jézéquel D, Biderre-Petit C, et al. 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海藻能源的催化转化与提取技术研究海藻作为一种丰富的生物资源，被广泛应用于食品加工、化妆品和农药等领域。

近年来，随着对可再生能源的需求不断增加，海藻能源的催化转化与提取技术逐渐引起人们的关注。

本文将探讨海藻能源的催化转化与提取技术的研究进展和应用前景。

海藻催化转化技术是指通过化学反应将海藻中的有机物转化为燃料、化工原料或其他有价值的产物。

常见的催化转化技术包括热解、气化和液相催化等。

热解是利用高温将海藻中的有机物转化为液体或气体燃料的过程。

气化是将海藻在高温和缺氧条件下转化为合成气体（主要是CO和H2），进而用于制备燃料和化工产品。

液相催化是利用催化剂将海藻中的有机物转化为高附加值化学品的过程。

目前，热解和气化技术已经在实际生产中得到了广泛应用，而液相催化技术仍处于研究和发展阶段。

热解技术是将海藻在高温下进行裂解，生成油、气和残渣的过程。

热解技术的优点是操作简单、适用性广，并且可以通过调节热解温度和反应时间来控制产物的分布。

热解产物主要包括生物石油、生物柴油和生物煤等。

生物石油是由大分子有机物组成的一种液体燃料，可以替代石油燃料使用。

生物柴油是一种可再生的燃料，可以与传统柴油混合使用，并且具有较低的排放和环境影响。

生物煤是一种用于火力发电或燃料添加剂的化石燃料替代品。

气化技术是将海藻在高温和缺氧条件下反应，生成合成气体的过程。

合成气体主要由CO和H2组成，在升温厌氧气化反应中可以通过化学反应转化为液体燃料或化学品。

合成气体可以进一步转化为甲醇、乙醇、二甲醚等合成燃料和化学品，或者通过Fischer-Tropsch合成制备石油替代品。

气化技术的优点是能够高效利用海藻中的碳资源，并且产生的合成气体可以替代传统的化石燃料。

液相催化技术是将海藻中的有机物在液体催化剂的作用下转化为高附加值的化学品。

液相催化技术包括酶催化和化学催化两种形式。

酶催化是利用海藻中的酶来催化有机物的转化，具有反应条件温和、产物纯度高等优点。

海洋生物甲烷合成的分子机制海洋生物在海底环境中具有甲烷合成的能力，这种甲烷合成的化学过程是通过一系列化学反应进行的。

甲烷合成的过程涉及到多种微生物和化学反应，其中的复杂性必定需要深入研究。

在此，我们将探讨海洋生物甲烷合成的分子机制。

一、甲烷合成的生物学过程甲烷合成通常发生在海洋海底生态系统中，通过微生物催化酸化反应。

该过程是由甲烷菌引发的，这种微生物有着特定的部位和催化剂来催化此次化学反应。

甲烷菌利用形成于生物栖息地表面的生物膜上的化合物来加速生成甲烷。

在甲烷合成的过程中，一个重要的过程是CO2还原成为CH4，该过程是由多种微生物完成的。

通过厌氧胞外部位上的氧化还原酶进行的，其中甲烷菌的能量来源于硫酸盐还原菌氧化硫化氢分解产生的电子供给甲烷菌的电子传递链。

甲烷合成需要消耗能量，它经常发生在深海和大陆上方的水深处。

这是因为在这些区域中，有一定的温度和压力，甲烷合成的微生物可以在这些环境中生存并进行甲烷合成。

二、甲烷合成的化学反应在海洋生物甲烷合成的化学过程中，碳和氢是主要元素。

该过程还涉及到多种生化反应，其中包括蛋白质分解和二氧化碳浓度上升。

当海洋生物完成对蛋白质的分解时，产生的氮和碳将转移到被称为甲酸酸循环的反应中。

在这个环节中，氮转移到了乙酰-CoA 的羟基上，随后分解为甲酸和氨。

此外还包括反应得到甲酰- CoA 和S- 腺苷甲硫氨酸，这些产物可以用作甲烷合成的其他阶段的反应物。

在甲酸酸循环中，已经生成了N-甲基四氢叶酸。

这种烷基化剂可以催化CO2还原为CH4。

N-甲基四氢叶酸还可以合成异岩醇和二甲醚，这两个化合物都可以作为甲烷合成的最终产物。

在N-甲基四氢叶酸的作用下，甲酸酸循环还包括蛋白质分解产生的一些反应。

该过程发生在硫化氢生成的过程中，由于这些生化反应都涉及到电子转移，因此可以轻松地将它们与甲烷结合起来。

三、甲烷合成的影响海洋生物的甲烷合成过程对环境有着重要影响。

甲烷是一种强大的温室气体，可以在大气中停留长达10年。