第四章细菌的分型及其检测技术

14
2、常规试验稀释度测定
噬菌体的常规试验稀释度 (routine test dilution, RTD)： 是将噬菌体进行10倍系列稀释，各稀释度噬菌体溶液点 在宿主菌涂布的斑点上，经培养后，能产生仅次于融合性 裂解（CL）的最高稀释度。
RTD测定意义：高浓度噬菌体会对宿主菌产生裂解外观， 为避免噬菌体对细菌这种非特异性破坏，使分型噬菌体显 示最高的特异性，将噬菌体间的交叉反应降到最低，建议 使用RTD或称为临界试验稀释。
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(二)培养基和抗菌药物纸片 1 ．抗菌药物纸片：商品化，选择直径为 6.35mm ，
吸水量为 20μl 的专用药敏纸片，用逐片加样或浸
泡方法使每片含药量达规定要求。含药纸片密封
贮存于超低温冰箱。 2．培养基：水解酪蛋白（M-H）培养基是兼性厌氧 菌和需氧菌药敏试验标准培养基，4℃保存。
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（三）试验步骤
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三、噬菌体的分离、纯化与增殖技术

（一）噬菌体分离
制备菌悬液
接种适量样品，12-24h
噬菌体富集培养
离心，上清过滤除菌， 滤液无菌试验
制备裂解液
平板均匀涂布一层菌液，干燥后， 表层布5-7点 ，滴加滤液，一点 生理盐水，培养观察噬斑
11 噬菌体确证试验

（二）噬菌体纯化
稀释裂解液
10-1至10-55个稀释度的噬菌体各 0.1ml+0.2ml对数菌液，5min
温和噬菌体(temperate phage):
7
8
噬菌体与宿主菌共培养

液体培养基中 澄清 固体培养基上 噬斑 噬菌体在细菌鉴定与分型方面的应用
噬菌体的作用具有种特异性，一种噬菌体 只能裂解一种或与该种相近的细菌； 噬菌斑的形态、大小和透亮度的不同，可 用于鉴定细菌的型别。
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二、细菌噬菌体分型的一般原则
细菌自动化鉴定技术
2
自动细菌鉴定和药 敏分析系统。
主要内容
第一节 第二节 第三节
细菌噬菌体分型技术
细菌素分型技术 细菌的药物敏感试验与分型
第四节
第五节
3
分子生物学分型技术
色谱和质谱技术在细菌学检 验中的应用 细菌的自动化鉴定技术
第六节
第一节
细菌噬菌体分型技术

一、概述 二、细菌噬菌体分型的一般原则 三、噬菌体的分离、纯化与增殖技术 四、细菌的噬菌体分型技术 五、噬菌体分型优缺点（自学）
比例法：WHO、国际防痨和肺病联合会推荐的标准 方法。将不同稀释度的待测菌接种于相同浓度的含药 培养基，检测耐药性。

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第四节
分子生物学分型技术

一、核糖体分型 二、脉冲场凝胶电泳分型 三、序列分型 四、多位点序列分型技术
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一、核糖体分型

实质：核酸探针杂交分型技术。
核糖体RNA（rRNA）基因最为保守，在基因组上存 在多个拷贝，以rRNA基因片段为探针，检出含有 rRNA基因的DNA片段，通过分型杂交后的rRNA指纹 图，进行菌种分型和近源菌株的鉴定。
制备噬菌体与 敏感菌混合管
制备底层琼脂平板
各稀释度混合管+3ml半固体 培养基，均Hale Waihona Puke Baidu覆盖平板表层
制备上层琼脂平板 培养
选取噬斑较分散的平板，挑取典 型噬斑，接种至含菌体培养液中 过夜增殖噬菌体。分离纯化单斑 3次，至平板噬斑形态大小一致
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纯化

（三）噬菌体的增殖、保存
1、噬菌体增殖 液体增殖法：定时加入对数期菌体

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三、稀释法

稀释法是体外定量测定抗菌药物抑制细菌生长 活性的方法，所获结果比较准确，常被用作校 正其他方法的标准。 原理是用一系列不同浓度的药物与等量细菌作 用，找出能抑制细菌生长的最低浓度或杀灭细 菌的最低浓度，其结果用最小抑菌浓度 (MIC) 或最小杀菌浓度(MBC)表示P101。


分为肉汤稀释法和琼脂稀释法。
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28
（四）结果判断和报告 用精确度为1mm的游 标卡尺量取抑菌圈直径。 根据标准，作出“敏感”、
“耐药”或“中介”的判
几种抗生素抑菌环解释标准及相应的最低抑菌浓度
代号 P-G ERY 抗生素 青霉素G 红霉素 庆大霉素 纸片 含药量 10IU 15IU 10IU 抑菌环直径（mm） 耐药 ≤20 ≤13 ≤12 中介 21～28 14～22 13～14 敏感 ≥29 ≥23 ≥15 ≥8 ≥8 相应的MIC（μg/ml） 耐药 敏感 ≤0.1 ≤0.5 ≤4
断。
29 GEN

“敏感”（sensitive，S）：表示测试菌可被测定药物 常规剂量给药后在体内达到的血药浓度所抑制；

“耐药”（resistant，R）：表示测试菌不能被在体内
感染部位可能达到的抗菌药物浓度所抑制，临床治疗无 效。

“中介”（intermediate，I）：表示测试菌对常规用药
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细菌素特点 抗菌范围很窄，在治疗上应用价值不大，但可 进行细菌分型和流行病学调查。
细菌素分型方法 利用不同型别的细菌素产生菌测定试验菌的细 菌素敏感模式（检测未知菌） 利用已知对不同型别细菌素敏感的菌株作为指 示菌，测定试验菌产生细菌素的模式

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二、细菌素分型方法

（一）待测菌对细菌素敏感模式分型试验方法
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二、纸片扩散法（K-B法）


（一）基本原理： 将含有定量抗菌药物的纸片贴在已接种待检菌 的琼脂平板上，纸片中所含的药物吸取琼脂中 的水分溶解后会不断地向纸片周围区域扩散， 形成递减的浓度梯度，在纸片周围抑菌浓度范 围内待检菌的生长被抑制，从而产生透明的抑 菌圈。 抑菌圈的大小反映检测菌对测定药物的敏感程 度，并与该药对待检菌的最低抑菌浓度（ MIC） 呈负相关，即抑菌圈愈大，MIC愈小。
制备菌悬液
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第二节
细菌素分型技术
一、概述


细菌素(bacteriocin)
是某些细菌产生的蛋白质类抗菌物质，这种物质仅对 与产生菌亲缘关系近的细菌有抗菌作用，而对产生菌 本身不敏感。如大肠菌素、绿脓菌素、蜡样芽胞杆菌 素等。


抗生素
抗菌素是细菌、真菌等微生物在生长过程中为了生存 竞争需要而产生的化学物质,这种物质可保证其自身生 存,同时还可杀灭或抑制其它微生物。细菌产生的有多 粘菌素、抗菌肽等。
体液或组织中的药物浓度的反应率低于敏感株，使用高 于正常给药量有疗效。
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（五）质量控制

采用质控标准菌株和测试菌在同一条件下做药
敏试验，质控菌株的抑菌圈在允许范围内，结
果可信。

目的：检查试验条件（如培养基、含药纸片和 接种菌量）、操作技术等是否合格 质控标准菌株：大肠杆菌ATCC 25922、粪肠球 菌ATCC 29212、金黄色葡萄球菌ATCC 25923等

(1)细菌型别与分型噬菌体裂解特异性稳定，分型结果
重复性好。 (2) 噬菌体具有较高分型效率，能够区分菌株间的细 微差别，能满足流行病学研究的需要。 (3) 操作方法简便易行，实验耗时短，结果记录简明。


(4) 方法应能标准化，以利结果的比较。
(5)所用噬菌体应易于获得较高效价，能较长时间保存， 噬斑清晰、大小适中，使之便于观察和准确记录。


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（三）待检菌产生细菌素对指示菌敏感模式分 型方法
方法同平板交叉划线分型法 已知细菌素产生菌划线接种培养基，培养2448h


无菌水冲洗掉菌苔，三氯甲烷熏蒸灭菌
多种细菌素敏感的指示菌依次垂直交叉划线接 种，培养24-48h，观察交叉点菌生长情况，判 定产生细菌素试验菌菌型。
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第三节
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四、细菌噬菌体分型技术
斑点滴定的结果记录如下: 融合性溶解程度:融合性溶解 (CL) 、 不能混有杂菌 次融合性溶解(＜CL) 、半融合性溶解 (SCL)、次半融合性溶解(＜SCL) 、融 菌液涂布平板 合性不透明溶解，中心混浊，菌苔厚 直接涂布或双层 (OL) 。 琼脂平板 单个噬斑:大( L) 即＞1.5mm、正常 (N) 选点滴加不 约1.0mm、小(S)0.1~1.0mm、细小(m) ＜ 0.1mm、微小(µ )。细小和微小均仅 同噬菌体 能用放大镜观察。 噬斑的数量:0~5(-)、6~20(±)、 1~40(+)、41~60(++)、61~120(+++)、 >120(++++)。
固体增殖法：同时加大菌体和噬菌体的浓度 2、去除菌体
细菌滤器法和三氯甲烷法
3、噬菌体的保存
冷藏保存：无需防腐剂，分装后7d，不宜超过4w
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冷冻干燥：2年

（四）噬菌体的效价和裂解谱的测定
1、噬菌体效价的测定
噬菌体效价：是指1ml液体中所含的活噬菌体 的数量。用噬斑形成单位（plaque forming unit,PFU）表示。 单位：PFU/ml;测定方法：双层琼脂平板法
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肉汤稀释法
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四、结核分枝杆菌药敏试验

特殊性：结核分枝杆菌生长缓慢，在细菌生长之前药 物已扩散而无法影响细菌的生长。
方法：绝对浓度法、比例法、放射测量法等。


绝对浓度法:是我国实验室普遍使用方法。将浓度递减 的药物与等量培养基混合制成含药培养基，不含药培 养基为对照，分别接种待测菌和标准菌，培养4w，菌 落数多于20个为阳性（据此判定MIC）。受试菌与标 准菌MIC的菌落数比值≤2判为敏感，≥8为耐药。
1. 在琼脂平板上挑取形态相同的菌落4～5个，接种于3～ 5mLM-H肉汤中，36℃培养4～8h，与标准比浊管比较， 可用肉汤或生理盐水稀释至与0.5麦氏标准比浊管浊度相 同 2.在15min内，用无菌棉签蘸取菌液，并在管壁上挤去多余的 菌液后涂布于M-H琼脂平板上（注意：涂布要均匀、致 密），待干 3. 镊子灭菌冷却后，夹取不同药敏纸片，按一定间隔贴在平 板的不同区域，即两纸片间距不小于24 mm，纸片距平板 边缘不小于15mm。 36℃温箱培养16～18h观察结果。
第四章 细菌的分型及其检测技术
邵丽军
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表型分型技术
血清学分型、生物化学分型、 噬菌体分型、细菌素分型、耐 药谱分型等
细 菌 分 型
基因分型技术
质粒图谱分析、聚合酶链式反应 技术、核糖体分析、染色体酶切 物脉冲场凝胶电泳分型、序列分 型、多位点序列分型技术等。
色谱与质谱技术
气相色谱法、液相色谱法、 毛细管电泳技术、飞行质 谱技术等。

原理：样本DNA经酶切消化，凝胶电泳分离片段，转 印到膜上进行Southern印迹杂交分析。以rRNA基因 片段为探针，杂交产生菌株特异性的DNA指纹图，与 平行样本或数据库进行比对达到分型目的。
细菌的药物敏感试验与分型

一、概述 二、纸片扩散法 三、稀释法 四、结核分枝杆菌药敏试验
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一、概述


细菌的药物敏感试验(drug susceptibility test)
是指在体外测定抗菌药物抑制或杀死细菌能力的试验， 简称药敏试验。


药敏试验方法
纸片扩散法、稀释法、抗生素浓度梯度法（E-试验 法）、联合药敏试验、自动化检测法、分子生物学方 法等。
（绿脓菌素为例） 绿脓菌素制备 绿脓菌素敏感试验
待测菌铺满平板，干燥后加细菌 素标准品，观察抑菌圈。
细菌素分型试验
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有清晰抑菌圈，圈内无菌落者为完全抑菌; 抑菌圈中尚有部分菌落为不完全抑菌;无抑 菌圈表示该菌对此种绿脓菌素不敏感。


（二）平板交叉划线分型法
适用于细菌素产生量不多的细菌 已知细菌素产生菌划线接种培养基，培养2448h 无菌水冲洗掉菌苔，放置2cm*2cm滤纸片，滴 加三氯甲烷，灭菌 多种待测菌株与原产细菌素菌株成垂直交叉划 线接种，培养24-48h，观察交叉点上是否有菌 生长，判定待测菌菌型。
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一、概述

噬菌体(bacteriophage;phage)

是一类能感染细菌、放线菌、真菌、螺旋体等
微生物的病毒，属于专性细胞内寄生的微生物。

自然界分布广泛，凡有细菌的场所，均可能存
在相应的噬菌体。
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噬菌体的基本形态
蝌蚪形
噬菌体
微球形（无 尾）
细杆形（无头）
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根据与宿主菌的关系分类
毒性噬菌体(virulent phage):
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RTD 与PFU关系，均是噬菌体效价的计量单位。受噬 斑大小的影响，一般的RTD 约含 1 X 106 pfu/ml
3、裂解谱
裂解谱是指一种噬菌体的作用范围。即确定该噬菌体在 种内或属内的广谱性，在种外或属外的交叉反应性。
裂解模式是指各种细菌培养物被几种噬菌体作用而出现 的特殊的反应模式，不同的细菌，可呈现不同的反应模式。 裂解谱和裂解模式一般用噬菌体原液进行试验，效价在 103～105RTD或109～1011PFU/ml之间。分型试验一般用 1 RTD的噬菌体。