Annexin-V-FITC细胞凋亡检测试剂盒

Annexin V-FITC/PI 细胞凋亡检测试剂盒Annexin V-FITC Apoptosis Detection Kit一、试剂盒说明在正常细胞中，磷脂酰丝氨酸（PS ）只分布在细胞膜脂质双层的内侧，而在细胞凋亡早期，细胞膜中的磷脂酰丝氨酸（PS ）由脂膜内侧翻向外侧。

Annexin V 是一种分子量为35~36kD 的Ca 2+依赖性磷脂结合蛋白，与磷脂酰丝氨酸有高度亲和力，故可通过细胞外侧暴露的磷脂酰丝氨酸与凋亡早期细胞的胞膜结合。

因此Annexin V 被作为检测细胞早期凋亡的灵敏指标之一。

将Annexin V 进行荧光素FITC 标记，以标记了的Annexin V 作为荧光探针，利用荧光显微镜或流式细胞仪可检测细胞凋亡的发生。

碘化丙啶（Propidium Iodide, PI ）是一种核酸染料，它不能透过完整的细胞膜，但对凋亡中晚期的细胞和死细胞，PI 能够透过细胞膜而使细胞核染红。

因此将Annexin V 与PI 匹配使用，就可以将处于不同凋亡时期的细胞区分开来。

本试剂盒可应用于培养细胞凋亡检测（不推荐用于检测组织样本）。

二、试剂盒组份 组份(20 assays) (50 assays) (100 assays) 储存条件 AnnexinV-FITC100 μL 250μL 500 μL Propidium Iodide100 μL 250μL 500 μL Binding Buffer 10.0 mL 25 mL 50 mL 注：1、Annexin V-FITC 组份建议按需分装小份冻存于-20℃，避免反复冻融； 2、Propidium Iodide 和Binding Buffer 组份不用时可放置于4℃保存，Propidium Iodide 需要避光。

3、Store at -20℃ for 12 months三、试剂盒以外自备仪器和试剂流式细胞仪或荧光显微镜、低速离心机、微量移液器 1.5m L Microtube 、载玻片、盖玻片（荧光显微镜观察需用）、PBS 、不含EDTA 的胰酶消化液四、使用注意事项1.微量试剂取用前请离心集液。

请在使用前仔细阅读说明书Annexin V,FITC 凋亡检测试剂盒(100次)产品名称货号规格储存条件运输条件Annexin V,FITC结合物AD01-10 100次×1 0-5℃，避光(切勿冻存) 室温PI Solution AD02-05 50次×2 0-5℃，避光(切勿冻存) 室温10×Annexin V Binding Buffer AD03-05 50次×2 0-5℃，避光(切勿冻存) 室温*注：规格中的每“次”是以细胞浓度1×106 cells/ml计算产品描述细胞凋亡是指为维持有机体内环境稳定，由基因控制的细胞自主的有序的死亡。

正常情况下任何细胞在形成过程中发生的异常都会通过凋亡消除。

例如体内的癌细胞增长为肿瘤的过程会受细胞凋亡的引导而被抑制。

然而在抑癌基因p53出现问题时，凋亡就不会诱导发生，从而导致癌细胞的不断增长。

细胞凋亡可以通过细胞形态的变化或生物化学的变化来检测。

目前常用的指标有caspase活性变化、DNA碎片、磷脂酰丝氨酸的外翻等。

Annexin V染色的细胞可以用于检测细胞凋亡早期的细胞膜变化。

在细胞凋亡早期，膜磷脂酰丝氨酸由脂膜内侧翻向外侧。

Annexin V 是一种分子量为35~36kD的Ca2+依赖性磷脂结合蛋白，与磷脂酰丝氨酸有高度亲和力，可通过细胞外侧暴露的磷脂酰丝氨酸与凋亡早期细胞的胞膜特异性结合，因此Annexin V 被作为检测细胞早期凋亡的灵敏指标之一。

用绿色荧光FITC标记的Annexin V 通过流式细胞仪或荧光显微镜可以检测到细胞凋亡的发生。

碘化丙啶(Propidium Iodide, PI)是一种核酸染料，PI只能透过凋亡晚期和死细胞的细胞膜，因此Annexin V和PI结合使用，可以区分凋亡早晚期的细胞及死细胞。

所需的设备和材料-合适量程的移液枪-样品和诱导剂-细胞培养用6，12，24，96孔板-PBS、去离子水-流式细胞仪或荧光显微镜。

Annexin V-FITC凋亡检测试剂盒说明：细胞凋亡是细胞的基本特征之一，它在机体的胚胎发育、组织修复、内环境的稳定等方面起着十分重要的作用。

Annexin Ⅴ是一种分子量为35-36kD的Ca2+依赖性磷脂结合蛋白，能与细胞凋亡过程中翻转到膜外的磷脂酰丝氨酸（Phosphatidylserine，PS）高亲和力特异性结合。

以标记了FITC的Annexin Ⅴ作为荧光探针，利用流式细胞仪或荧光显微镜可检测细胞凋亡的发生。

Propidium iodide（PI）是一种核酸染料，它不能透过完整的细胞膜，但在凋亡中晚期的细胞和死细胞，PI能够透过细胞膜而使细胞核红染。

将Annexin Ⅴ与PI匹配使用，可以将凋亡早期的细胞和晚期的细胞以及死细胞区分开来。

产品组成（50／25次反应）：· Annexin V-FITC 500ul／250ul（20ug /ml）· Binding Buffer 40ml／20 ml· Propidium Iodide (PI) 250ul／125ul（50ug /ml）保存条件: 2-8℃储存，有效期一年。

注意事项：1.为保证得到理想的实验结果，在使用此试剂盒之前请认真阅读该注意事项；2.试剂（尤其是小瓶装的试剂）在开盖前请短暂离心，将盖内壁上的液体甩至管底，避免开盖时液体洒落；3.Propidium iodide（PI）能通过皮肤吸收，对眼睛有刺激作用；4.此试剂盒仅供科研使用，不宜用于临床诊断；5.本试剂盒中提供的PBS为随试剂赠送，并非试剂盒的真正组成成分；细胞的洗涤同常规方法。

操作注意要点：1.整个操作过程动作要尽量轻柔，勿用力吹打细胞，尽量在4℃下操作；2.反应完毕后请尽快检测，因为细胞凋亡是一个动态的过程，反应1小时后荧光强度就开始衰变；3.Annexin V-FITC和Propidium iodide是光敏物质，在操作时请注意避光；4.成功的检测凋亡受以下几种因素的影响，如细胞类型、细胞膜上PS的密度、发生凋亡时PS翻转的比例、诱导细胞凋亡的方法、所用试剂、诱导凋亡的时间等，把这些影响因素进行优化对实验成功是非常必要的；5.在细胞洗涤的最后一步，请尽量将上清弃净，以免PBS残留，有可能会影响实验结果；6.PI染色时间过长有可能造成检测的凋亡率偏高，建议首先进行Annexin V-FITC染色，上机前5分钟再加入PI染色。

请在使用前仔细阅读说明书Annexin V,FITC 凋亡检测试剂盒(100次)产品名称货号规格储存条件运输条件Annexin V,FITC结合物AD01-10 100次×1 0-5℃，避光(切勿冻存) 室温PI Solution AD02-05 50次×2 0-5℃，避光(切勿冻存) 室温10×Annexin V Binding Buffer AD03-05 50次×2 0-5℃，避光(切勿冻存) 室温*注：规格中的每“次”是以细胞浓度1×106 cells/ml计算产品描述细胞凋亡是指为维持有机体内环境稳定，由基因控制的细胞自主的有序的死亡。

正常情况下任何细胞在形成过程中发生的异常都会通过凋亡消除。

例如体内的癌细胞增长为肿瘤的过程会受细胞凋亡的引导而被抑制。

然而在抑癌基因p53出现问题时，凋亡就不会诱导发生，从而导致癌细胞的不断增长。

细胞凋亡可以通过细胞形态的变化或生物化学的变化来检测。

目前常用的指标有caspase活性变化、DNA碎片、磷脂酰丝氨酸的外翻等。

Annexin V染色的细胞可以用于检测细胞凋亡早期的细胞膜变化。

在细胞凋亡早期，膜磷脂酰丝氨酸由脂膜内侧翻向外侧。

Annexin V 是一种分子量为35~36kD的Ca2+依赖性磷脂结合蛋白，与磷脂酰丝氨酸有高度亲和力，可通过细胞外侧暴露的磷脂酰丝氨酸与凋亡早期细胞的胞膜特异性结合，因此Annexin V 被作为检测细胞早期凋亡的灵敏指标之一。

用绿色荧光FITC标记的Annexin V 通过流式细胞仪或荧光显微镜可以检测到细胞凋亡的发生。

碘化丙啶(Propidium Iodide, PI)是一种核酸染料，PI只能透过凋亡晚期和死细胞的细胞膜，因此Annexin V和PI结合使用，可以区分凋亡早晚期的细胞及死细胞。

所需的设备和材料-合适量程的移液枪-样品和诱导剂-细胞培养用6，12，24，96孔板-PBS、去离子水-流式细胞仪或荧光显微镜。

第1页，共3页ANNEXINV-FITC/PI 凋亡检测试剂盒说明书注意：本产品试剂浓度发生变化，使用前请仔细阅读说明书。

货号：CA1020规格：20T/50T /100T保存：2-8°C ，避光保存，有效期1年。

产品说明：细胞凋亡早期改变发生在细胞膜表面，这些细胞膜表面的改变之一是磷脂酰丝氨酸(PS)从细胞膜内转移到细胞膜外，使PS 暴露在细胞膜外表面。

PS 是一种带负电荷的磷脂，正常主要存在于细胞膜的内面，在细胞发生凋亡时细胞膜上的这种磷脂分布的不对称性被破坏而使PS 暴露在细胞膜外。

Annexin V 具有易于结合到磷脂类如PS 的特性，对PS 有高度的亲和性。

因此，该蛋白可充当一敏感的探针检测暴露在细胞膜表面的PS 。

PS 转移到细胞膜外不是凋亡所独特的，也可发生在细胞坏死中。

两种细胞死亡方式间的差别是在凋亡的初始阶段细胞膜是完好的，而细胞坏死在其早期阶段细胞膜的完整性就破坏了。

因此，可以采用Annexin V 与PI 双染的方法，通过流式检测细胞早期凋亡。

操作步骤:1.细胞样品的准备：a)对于贴壁细胞：小心收集细胞培养液到一离心管内备用。

用不含EDTA 的胰酶消化细胞，至细胞可以被轻轻用移液管或枪头吹打下来时，加入前面收集的细胞培养液，吹打下所有的贴壁细胞，并轻轻吹散细胞。

再次收集到离心管内。

1000rpm 左右离心5min ，沉淀细胞。

对于特定的细胞，如果细胞无法完全离心至离心管底，可以适当延长离心时间或稍稍加大离心力。

小心吸除上清，可以残留约50µl 左右的培养液，以避免吸走细胞。

加入约1ml 4℃预冷的PBS ，重悬细胞，再次离心沉淀细胞，小心吸除上清。

b)对于悬浮细胞：1000rpm 左右离心5min ，沉淀细胞。

对于特定的细胞，如果细胞无法完全离心至离心管底，可以适当延长离心时间或稍稍加大离心力。

小心吸除上清，可以残留约50µl 左右的培养液，以避免吸走细胞。

凯基Annexin V-FITC细胞凋亡检测试剂盒（Annexin V-FITC Apoptosis Detection Kit）Cat number：KGA For Research Use OnlyStore at4℃for one yearExpire date：一、试剂盒说明在正常细胞中，磷脂酰丝氨酸（PS）只分布在细胞膜脂质双层的内侧，而在细胞凋亡早期，细胞膜中的磷脂酰丝氨酸（PS）由脂膜内侧翻向外侧。

Annexin V是一种分子量为35~36kD的Ca2+依赖性磷脂结合蛋白，与磷脂酰丝氨酸有高度亲和力，故可通过细胞外侧暴露的磷脂酰丝氨酸与凋亡早期细胞的胞膜结合。

因此Annexin V 被作为检测细胞早期凋亡的灵敏指标之一。

将Annexin V进行荧光素（EGFP、FITC）标记，以标记了的Annexin V作为荧光探针，利用荧光显微镜或流式细胞仪可检测细胞凋亡的发生。

碘化丙啶（Propidium Iodide, PI）是一种核酸染料，它不能透过完整的细胞膜，但对凋亡中晚期的细胞和死细胞，PI能够透过细胞膜而使细胞核染红。

因此将Annexin V与PI匹配使用，就可以将处于不同凋亡时期的细胞区分开来。

本试剂盒可应用于培养细胞凋亡检测（不推荐用于检测组织样本）。

二、试剂盒组份组份Cat: KGA105(10 assays) Cat: KGA106(20 assays)Cat: KGA107(50 assays)Cat: KGA108(100 assays)储存条件AnnexinV-FITC 50μL 100μL 250μL 500μL 4℃避光Propidium Iodide 50μL 100μL 250μL 500μL 4℃避光Binding Buffer 5 mL 10.0 mL 25 mL 50 mL 4℃三、试剂盒以外自备仪器和试剂流式细胞仪或荧光显微镜、低速离心机、微量移液器1.5m L Microtube、载玻片、盖玻片（荧光显微镜观察需用）、PBS、不含EDTA的胰酶消化液四、使用注意事项1．微量试剂取用前请离心集液。

Annexin V-FITC/PI双染细胞凋亡检测试剂盒上海优宁维生物科技有限公司一、概述在正常细胞中，磷脂酰丝氨酸只分布在细胞膜脂质双层的内侧，细胞发生凋亡最早期，膜磷脂酰丝氨酸（PS）由脂膜内侧翻向外侧，这一变化早于细胞皱缩、染色质浓缩、DNA片断化和细胞膜的通透性增加等凋亡现象。

AnnexinV是一种磷脂结合蛋白，与磷脂酰丝氨酸有高度亲和力，故可通过细胞外侧暴露的磷脂酰丝氨酸与凋亡早期细胞的胞膜结合。

因此AnnexinV被作为检测细胞早期凋亡的灵敏指标之一。

碘化丙啶（Propidium Iodide,PI）是一种核酸染料，它不能透过完整的细胞膜，但凋亡中晚期的细胞和死细胞由于细胞膜通透性的增加，PI能够透过细胞膜而使细胞核染红。

因此将Annexin V与PI匹配使用，就可以将处于不同凋亡时期的细胞区分开来。

因此，将Annexin V与PI联合使用时，PI 则被排除在活细胞（Annexin V-/PI-）和早期凋亡细胞（Annexin V+/PI-）之外，而晚期凋亡细胞和坏死细胞同时被FITC 和PI 结合染色呈现双阳性（Annexin V+/PI+）。

图Annexin V 检测细胞凋亡原理三、实验步骤贴壁细胞需用0.25%的胰酶消化。

注意过度消化可损伤细胞。

在消化时可加2％的BSA 可防止消化过度。

如果用含EDTA的胰酶消化时，注意必须彻底清除EDTA：在标记前用1×PBS或1×bindingbuffer洗涤，清除EDTA，以免残余的EDTA与Ca2＋螯合，影响Annexin V的结合。

（1）用去离子水将10×Binding Buffer稀释成1×Binding Buffer；（2）细胞收集。

悬浮细胞收集：离心5分钟；贴壁细胞：用不含EDTA的胰酶消化收集后（注：胰酶消化时间不宜过长，否则会影响细胞膜上磷脂酰丝氨酸与Annexin V-FITC的结合），于室温2000rpm离心5～10分钟，收集细胞；（3）细胞洗涤：用预冷1×PBS（4℃）重悬细胞一次，2000rpm离心5～10分钟，洗涤细胞；（4）加入300μL 的1×Binding Buffer 悬浮细胞；（5）Annexin V-FITC标记：加入5μL的Annexin V-FITC混匀后，避光，室温孵育15分钟；（6）PI标记：上机前5分钟再加入5μL的PI染色。

艾美捷Annexin V-FITC/PI双染法细胞凋亡检测试剂盒操作说明细胞凋亡是细胞的基本特征之一,它在机体的胚胎发育、组织修复、内环境的稳定等方面起着十分重要的作用。

在细胞凋亡过程中,细胞内膜的磷酯酰丝氨酸外翻到细胞外膜,而Annexin V(膜联蛋白V)对其有天然的高亲和能力,故可以用FITC标记(绿色荧光)的Annexin V来检测细胞凋亡,但本方法的缺点是不能区分早期和晚期的凋亡细胞。

早期和晚期的凋亡细胞的一个重要区别在于细胞膜的完整性(凋亡早期细胞没有丧失膜的完整性),故可以用碘化丙啶(PropidiumIodide,PI)来染色加以区分。

图源：网络艾美捷Annexin V-FITC/PI双染法细胞凋亡检测试剂盒特点：1. 即开即用,不需要专门花时间准备各种成分。

2. 整合了Annexin V-FITC和PI检测法的优点,提高了凋亡细胞检测的灵敏度和特异性,本方法是目前极为灵敏的细胞凋亡检测方法。

3. 跟流式细胞仪、荧光显微镜或其它荧光检测兼容。

艾美捷Annexin V-FITC/PI双染法细胞凋亡检测试剂盒操作步骤：(一)获得目的基因1、通过PCR方法:以含目的基因的克隆质粒为模板,按基因序列设计一对引物(在上游和下游引物分别引入不同的酶切位点),PCR循环获得所需基因片段。

2、通过RT-PCR方法:用TRIzol法从细胞或组织中提取总RNA,以mRNA为模板,逆转录形成cDNA第一链,以逆转录产物为模板进行PCR循环获得产物。

(二)构建重组表达载体1、Annexin V-FITC/PI双染法细胞凋亡检测试剂盒载体酶切:将表达质粒用限制性内切酶(同引物的酶切位点)进行双酶切,酶切产物行琼脂糖电泳后,用胶回收Kit或冻融法回收载体大片段。

2、PCR产物双酶切后回收,在T4DNA连接酶作用下连接入载体。

(三) 获得含重组表达质粒的表达菌种1、将连接产物转化大肠杆菌DH5α,根据重组载体的标志(抗Amp或蓝白斑)作筛选,挑取单斑,碱裂解法小量抽提质粒,双酶切初步鉴定。

PH0539|Annexin V-FITC/PI凋亡检测试剂盒（Annexin V-FITC/PI Apoptosis Assay Kit）货号：PH0539规格：PH0539-50|50T存储：Store at4℃，一年有效。

◆产品组分>>Annexin V-FITC--------------------250ul>>10×Binding Buffer-----------------2*13ml>>Propidium Iodide(PI)--------------500ul◆产品简介细胞凋亡（Apoptosis）是一种由基因控制的细胞自主死亡方式。

它与组织器官的发育，机体正常生理功能的维持，某些疾病的发生发展以及细胞癌变过程均有着密切的关系。

细胞凋亡已成为生命学科极为活跃的研究领域之一。

此外，介绍几种常用的细胞凋亡检测方式。

在细胞凋亡的早期，细胞膜表面的磷脂酰丝氨酸（Phosphatidylserine，PS）将会从细胞膜内侧转移到细胞膜外侧，使PS充分暴露在细胞膜外表面。

Annexin V是一种磷脂结合蛋白，对PS有高度的亲和力。

因此，Annexin V作为一个敏感的探针可以有效地检测暴露在细胞膜表面的PS。

目前普遍使用的检测方法是将荧光标记后的Annexin V-FITC作为探针，利用流式细胞仪来检测细胞凋亡。

值得注意的是，在细胞坏死的过程中也会发生PS的暴露。

但两者的差别在于细胞凋亡的初始阶段细胞膜结构是完好的，只有PS转移，而细胞坏死则在早期阶段细胞膜的完整性就破坏了，从而暴漏出PS。

因此，检测细胞凋亡时，通常会使用颜料碘化丙啶（Propidium Iodide，PI）以确立细胞膜的完整性。

PI是一种核酸染料，它可以染色死细胞，但不能进入完整的活细胞，从而将凋亡性细胞和坏死性细胞区分开来。

◆使用说明1、细胞收集与Annexin V-FITC结合（1）在完成细胞凋亡诱导处理后，1500rpm，5分钟离心后弃上清，收集细胞。

碧波TUNEL细胞凋亡检测试剂盒(显色法)（通用型，适用于细胞、组织样本）Store at: -20℃for one yearMADE BY BIOBOX碧波TUNEL细胞凋亡检测试剂盒(显色法)（通用型，适用于细胞、组织样本）一、产品简介TUNEL细胞凋亡检测试剂盒(Colorimetric TUNEL Apoptosis Assay Kit)为您提供了一种高灵敏度又快速简便的细胞凋亡检测方法。

对于待检测的细胞或组织样品，经过生物素标记和后续的DAB显色等步骤，即可在普通光学显微镜检测到凋亡的细胞。

细胞在发生凋亡时，会激活一些DNA内切酶，这些内切酶会切断核小体间的基因组DNA。

细胞凋亡时抽提DNA进行电泳检测，可以发现180-200bp的DNA ladder。

基因组DNA断裂时，暴露的3’-OH可以在末端脱氧核苷酸转移酶(Terminal Deoxynucleotidyl Transferase, TdT)的催化下加上生物素(Biotin)标记的dUTP(Biotin-dUTP)，随后和辣根过氧化物酶(HRP)标记的Streptavidin (Streptavidin-HRP)结合，最后在HRP的催化下通过DAB显色来显示凋亡细胞，从而可以通过普通光学显微镜检测到凋亡的细胞；由于正常的或正在增殖的细胞几乎没有DNA 的断裂，因而没有3'-OH形成，很少能够被标记。

这就是TUNEL(TdT-mediated dUTP Nick-End Labeling)法检测细胞凋亡的原理。

本试剂盒适用于组织样本（石蜡包埋、冰冻和超薄切片）和细胞样本（细胞涂片）的凋亡原位检测。

本试剂盒有如下优点：1、高灵敏度：可以在单细胞水平检测到细胞凋亡，同时由于凋亡早期就有DNA断裂，可以检测到早期的细胞凋亡。

2、操作简便：使用Ready-to-Use型试剂，并配有Proteinase K 和DAB。

3、特异性：TUNEL检测时通常更容易标记凋亡细胞，而不容易标记坏死细胞。

Annexin Ⅴ-FITC 细胞凋亡试剂盒使用（细菌）K：不加菲A：5000ug/L菲B: 500ug/L C: 500ug/L1、在0,24,48,72h取样3ml，测定OD6002、在0,24,48,72h取样，三个平行各取1ml,混匀，6000r/min,离心20分钟，弃上清，收集细胞，用5mlPBS轻轻重悬（注意：PBS重悬不能省略，PBS重悬的过程同时也起到了洗涤细胞的作用，可以保证后续Annexin V-FITC的结合。

）3、实验组（4组）：取K、A、B、C组重悬的细胞，加入5mg/ml的溶菌酶2ml,35℃水浴30Min,6000r/min,离心10分钟，弃上清。

4、实验组：各取K、A、B、C组0.1ml于1ml离心管中，定容至1ml左右,混匀。

加入10μl Annexin V-FITC，轻轻混匀；再加入100μl碘化丙啶，轻轻混匀。

室温(20～25℃)避光孵育10分钟。

5、阳性对照组：取2份K组菌液0.1ml于1ml离心管中，定容至1ml左右,混匀。

1管放入沸腾的蒸馏水中煮30min（杀死细胞）,然后加入100μl 碘化丙啶（PI）单染，轻轻混匀，另1管加入10ul Annexin V-FITC单染，轻轻混匀。

室温(20～25℃)避光孵育10分钟。

6、阴性对照组：另取1份K组菌液0.1ml于1ml离心管中，定容至1ml，混匀，不加任何染色剂。

7、将样品过400目筛网，进行流式细胞仪检测。

8、Annexin V-FITC为绿色荧光，PI为红色荧光。

9、因检测细胞的类型、凋亡诱导剂种类、使用的检测仪器不同，因而流式检测的荧光补偿也不同，因此建议每次检测均需使用未经凋亡诱导处理的细胞作为对照，进行荧光补偿的调节。

10、用流式细胞仪检测，激发波长Ex=488 nm; 发射波长Em=530 nm。

Annexin V-FITC 的绿色荧光通过FITC 通道（FL1）检测；PI 红色荧光通过PI 通道（FL2 或FL3）检测，建议使用FL3。

细胞凋亡检测(Annexin-V-FITC 单染法)(Assay of CellApoptosis)2010-05-25 20:06:41 来源：易生物实验浏览次数：197 网友评论0 条细胞凋亡或称程序性细胞死亡（Programmed Cell Death ,PCD）是细胞的生命现象之一，它在机体的胚胎发育、组织修复及自身反应性T淋巴细胞的清除等方面起着十分重要的作用。

细胞凋亡调节的失控可导致临床各种疾病的发生。

如老年性痴呆与神经细胞凋亡过度有关，自身免疫性疾病和肿瘤与细胞凋亡的抑制有关。

细胞凋亡有别于细胞坏死，它有一系列的细胞形态学和生物化学的改变，包括出现染色质浓缩、DNA降解、凋亡小体形成等。

关键词：细胞检测单染法细胞凋亡检测Annexin-V-FITCAssayCellApoptosis一、实验原理细胞凋亡或称程序性细胞死亡（Programmed Cell Death ,PCD）是细胞的生命现象之一，它在机体的胚胎发育、组织修复及自身反应性T淋巴细胞的清除等方面起着十分重要的作用。

细胞凋亡调节的失控可导致临床各种疾病的发生。

如老年性痴呆与神经细胞凋亡过度有关，自身免疫性疾病和肿瘤与细胞凋亡的抑制有关。

细胞凋亡有别于细胞坏死，它有一系列的细胞形态学和生物化学的改变，包括出现染色质浓缩、DNA降解、凋亡小体形成等。

在正常的活细胞，磷脂酰丝氨酸（phosphotidylserine，PS）位于细胞膜的内侧，但在凋亡的细胞，PS 从细胞膜的内侧翻转到细胞膜的表面，暴露在细胞外环境中。

Annexin-Ⅴ（膜联蛋白-V）是一种分子量为35-36KD的Ca2+ 依赖性磷脂结合蛋白，能与PS高亲和力结合。

因此将Annexin-Ⅴ进行荧光素（如FITC、PE）或生物素（Biotin）标记，以标记了的Annexin-Ⅴ作为探针，利用流式细胞仪或荧光显微镜可检测细胞凋亡的发生。

二、实验仪器和材料Annexin V-FITC（膜联蛋白-V-FITC）500μl/250μl 20μg/ml标记缓冲液（Binding Buffe）r 40/20 mlPBS（1×）60/30 ml20μl , 200μl , and 1000μl 移液器和吸头微量离心管可调速离心机载玻片（用于荧光显微镜观察）盖玻片（用于荧光显微镜观察）去离子水冰块流式细胞仪或荧光显微镜三、实验方法1．凋亡细胞的制备：小鼠腹腔注射地塞米松25mg/kg体重，10h后解剖取胸腺，分离胸腺细胞。

一文掌握AnnexinV-FITCPI细胞凋亡实验方法一、技术原理细胞凋亡（apoptosis）是指细胞在一定的生理或病理条件下，受内在遗传机制控制，按照自身程序主动性、生理性的死亡过程。

细胞凋亡受凋亡相关基因调控，故又称为程序性细胞死亡（programmed cell death，PCD）。

一般来说，凋亡早期，主要涉及胞内一些蛋白的变化，例如蛋白量的增高、位置的迁移、状态的改变等，还有一些磷脂、Ca2+的变化等；中晚期则伴随着DNA的断裂、凋亡小体的形成；而细胞形态的改变则伴随着整个凋亡过程。

二、产品应用目前可以采用单染色法和双染色法对细胞进行染色，流式细胞仪检测或荧光显微镜观察来检测细胞凋亡，其中Annexin V/PI法是当下较为流行的检测细胞凋亡的方法。

正常细胞中，磷脂酰丝氨（phosphotidylserine，PS）位于细胞膜的内侧，但在早期凋亡细胞中，PS会从细胞膜的内侧翻转到细胞膜的表面，暴露在细胞外环境中。

Annexin-V（膜联蛋白-V）是一种分子量为35-36KD的Ca2+依赖性磷脂结合蛋白，能与PS高亲和力结合。

用荧光素（FITC、Alexa Fluor488等）标记的Annexin-V作为探针，利用流式细胞仪或荧光显微镜可检测细胞凋亡的发生；碘化丙啶(propidine iodide, PI)是一种核酸染料，它不能透过完整的细胞膜，但在凋亡中晚期的细胞和坏死细胞，PI能够透过细胞膜而将细胞核染红。

因此将Annexin-V 与PI结合使用，就可以检测出细胞群体中的早期凋亡细胞与晚期凋亡细胞。

Apoptosis-AnnexinV 检测示意图碘化丙啶PI检测示意图三、使用方法1悬浮细胞，2000rpm离心5min收集细胞;对于贴壁细胞，要用不含EDTA的胰酶消化细胞，胰酶消化时间不宜过长或过短(过长细胞膜破碎，造成假阳性，过短，细胞黏连影响检测)最好是在轻轻吹打可以使贴壁细胞吹打下来时，吸除胰酶消化液，加入细胞培养液终止消化，，2000rpm离心5min收集细胞；24℃预冷PBS，洗涤细胞2次（2000rpm x 5min）,收集细胞2～5×105 ；3离心弃上清，加入500μL结合缓冲液，轻轻吹打重悬细胞；4加入5μL Annexin V-FITC，轻轻吹打混匀，加入5μL PI 轻轻吹打混匀,室温避光孵育5-15min。

Annexin V-FITC / PI荧光双染细胞凋亡检测试剂盒货号: P-CA-201规格: 20Assays / 50Assays / 100Assays / 200Assays产品编号产品名称20Assays 50Assays 100Assays 200Assays Storage P-CA-101 Annexin V-FITC 染色液100 μL250 μL500 μL 1 mL 2~8℃. 避光P-CA-151 Annexin V Binding Buffer(10×) 1.4 mL×2 5.5 mL 11 mL 11 mL×2 2~8°C 碘化丙啶(PI)染色液P-CA-161 100 μL250 μL500 μL 1 mL 2~8℃, 避光说明书一份保存条件2~8℃可保存1年。

Annexin V-FITC禁止冷冻保存。

实验原理Annexin V-FITC/PI 荧光双染细胞凋亡检测试剂盒，可用于检测悬浮细胞和贴壁细胞的凋亡。

Annexin V是一种钙离子依赖性磷脂结合蛋白，与磷脂酰丝氨酸(PS) 有高度亲和力。

当细胞发生凋亡时，膜内侧的磷脂酰丝氨酸(PS) 外翻到膜表面，而被荧光染料FITC标记的Annexin V结合，可通过流式细胞仪或荧光显微镜进行检测。

由于凋亡晚期或坏死细胞膜丧失完整性，而碘化丙啶（Propidium Iodide, PI）可与双链DNA特异性结合并产生强烈的荧光，与Annexin V搭配使用，可区分处于不同凋亡时期的细胞。

本试剂盒检测喜树碱诱导的Jurkat细胞凋亡效果如下图所示：Jurkat细胞用 5 μM喜树碱（Camptothecin）(左) 或未加药(右) 处理4 h，本试剂盒染色后流式检测。

Annexin V-FITC单阳细胞为早期凋亡细胞，AnnexinV-FITC和PI双阳细胞为坏死或晚期凋亡细胞，PI单阳细胞为裸核细胞。

Annexin V-FITC Apoptosis Detection Kit目录货号PF032包装包装：：1 试剂盒组分组分：：100次检测形式形式：：流式细胞仪或荧光显微镜检测方法检测方法：：荧光测定种属特异性种属特异性：：可适用于许多种属储存储存：：Annexin V-FITC 试剂盒组分用干冰运输，4°C 储存。

为了防止由于沾在管盖上造成的试剂损失，移除管盖前需要轻轻旋转使沾在管盖上的液体落入管内。

请参考注意事项和操作建议。

适用范围适用范围：：Calbiochem® Annexin V-FITC Apoptosis Detection 试剂盒是一种非同位素检测方法，可以检测伴随着细胞死亡发生的细胞膜的变化。

检测手段包括流式细胞仪或荧光显微镜。

背景背景：：凋亡是细胞死亡的一种基本形式，它在胚胎发育，组织分化和一些疾病发生过程中起着重要的调控作用。

在正常细胞中，磷脂酰丝氨酸（PS ）位于细胞膜内侧，一旦发生细胞凋亡，可以从细胞膜的内侧迅速翻转到细胞膜外侧，使得PS 暴露在细胞膜表面。

在体内，巨噬细胞可以识别翻转到细胞膜表面的PS 从而将这些程序性死亡的细胞清除，因此凋亡过程中并不伴随局部的炎症反应，而在细胞坏死的过程中则常常伴随着炎症反应。

在体外可以用PS 与抗凝血剂annexin V 的相互作用检测外翻的PS 。

在Ca2+存在的情况下，annexin V 与PS 有很高的亲和力，可以与之迅速结合。

PS 外翻发生在细胞核破裂，DNA 片段化以及凋亡相关蛋白出现之前，这使得annexin V 与PS 的结合成为凋亡早期的一种重要检测标志事件。

检测原理检测原理：：在该方法中，基于流式细胞仪和荧光显微镜，FITC 标记的annexin V 可以用来检测细胞凋亡。

由于细胞坏死的过程中也会发生细胞膜通透性增强，坏死的细胞同样也会结合annexin V-FITC 。

因此，propidium iodide （PI ）被用来区分存活的早期细胞和坏死或晚期凋亡细胞。

Annexin V凋亡试剂盒一般染色检测方法1.把将被染色分析的细胞用冷PBS洗涤二次并在恰当的染色缓冲液（binding buffer）中以1 x 106 细胞/mL的浓度重悬。

（染色缓冲液，binding buffer,中必须含有钙离子）2.吸取100ul的细胞(1 x 105)至试管中。

（必须在室温下进行）3.加入适量的荧光标记的annexin V试剂和PI。

（必须在室温下进行）4.混匀后避光室温下孵育15分钟。

（必须在室温下进行）5. 孵育后加入400ul染色缓冲液，立即上流式细胞仪分析。

（实验必须在一小时内完成，否则无意义！）我们推荐另外制备三个质控样本来设定流式细胞仪的荧光补偿和设置十字门的范围：a) 没有染色的细胞;b) 仅用荧光标记的annexin V染色的细胞;c) 仅用PI染色的细胞.annexin V和PI双阳性可以说明细胞群体中含有死亡细胞。

我们推荐可以使用一个细胞系来制备以上三个对照管来作为annexin V和PI阳性染色对照。

可以使用在RPMI +10% FCS + 2-4 ng/mL的TNF-a孵育2-3小时的人U-937细胞，或在培养液中孵育1-2小时鼠淋巴细胞作为对照细胞。

请依据以下建议来正确设置仪器补偿。

以下方案可以根据不同的细胞类型稍加修改。

在流式细胞仪上分析经染色的细胞:使用流式细胞仪正确分析annexin V-FITC和PI双标的细胞要求仪器的荧光补偿来去除两种染料激发光之间的叠加。

因为荧光补偿设置与PMT的电压直接相关，所以不同仪器之间的补偿不同。

我们建议在实验开始阶段分析单染的细胞来调整荧光补偿去除光谱重叠。

1. 上样未经染色的细胞，在线性FS-SS点图上显示细胞并设门圈出目标细胞群体。

注意：细胞在经培养后光散射信号会发生变化。

要注意使用侧向散射光设门来识别出这些已改变的细胞。

2.建立LogFL1-LogFL2双参数点图并分析以上光散射图中设门的细胞；保证>98%的细胞处于在X、Y轴Log 1为边界的左下象限中心区域。