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拟南芥原生质体的提取和转化(1)取4周后抽薹前的叶片，切成1mm宽的长条，置于甘露醇溶液（称1.82g D-甘露醇于20ml双蒸水中）；共需叶片约90片；(2)将步骤1中细条捞出，置于酶解液中；避光，23℃,40-50rpm摇床上酶解3小时；(3)酶解液过100-200目的筛子，收集滤液，置于15ml离心管中，均分为两管；于4℃，60g，离心15min；(4)原生质体用冰冷W5溶液轻柔洗涤，每管4ml；4℃，100g，离心1min；(5)弃上清，沉淀用冰冷的W5溶液轻柔悬浮，每管4ml；冰上放置30min；(6)23℃，100 g离心1min；弃上清，每管沉淀用0.5ml MaMg重悬；以下操作均在23℃下进行：(7)取约10-20ug 质粒于1.5ml EP管中，加100ul 步骤6中的原生质体；用200ul 枪头（剪去前端）轻柔混匀；(8)加入110ul PEG/Ca 溶液，轻柔混匀；放置20-30min；(9)加入0.44ml W5 溶液，来回颠倒混匀；23℃，100 g，1min，brake 设为4-5；(10)弃上清，加100ul W5，混匀；加900ul W5，混匀；(11)上述混合液体置于六孔板内，23℃，避光，孵育6-18小时。
(1)酶解液：cellulose R10 15%Macerozyme R10 0.3%Mannitol 1.09gKCl 0.3MMES 0.3M调节pH值到5.7，55℃加热10min，冷却到室温再加入下列溶液CaCl20.15Mβ-巯基乙醇0.75mM(2)PEG溶液（40%，v/v）PEG4000 1g0.8M Mannitol 0.625ml1M CaCl2 0.25m(3)W5溶液154mM NaCl 9.0g125mM CaCl218.4g5mM KCl 0.37g5mM glucose 0.9g0.03%MES 0.3g用KOH调pH至5.8，定容至1000ml，高压灭菌(4)MaMg溶液1M MgCl20.5ml0.1%MES 0.1g0.4M Mannitol7.3g用KOH调pH至5.8，定容至1000ml，高压灭菌。
作物学报 ACTA AGRONOMICA SINICA 2014， 40（2）： 231-239http：///ISSN 0496-3490； CODEN TSHPA9E-mail： xbzw@本研究由国家自然科学基金项目（31171590）资助。
*通讯作者（Corresponding author）： 郭旺珍， E-mail： moelab@Received（收稿日期）： 2013-06-17； Accepted（接受日期）： 2013-09-24； Published online（网络出版日期）： 2013-12-05. URL： http：///kcms/detail/11.1809.S.20131205.1101.003.htmlDOI： 10.3724/SP.J.1006.2014.00231棉花叶肉原生质体分离及目标基因瞬时表达体系的建立李妮娜 丁林云 张志远 郭旺珍*南京农业大学作物遗传与种质创新国家重点实验室 / 教育部杂交棉创制工程研究中心， 江苏南京210095摘 要： 以棉花幼嫩子叶为材料， 分析影响棉花叶肉原生质体分离及目标基因转化的主要因素， 以棉花叶肉原生质体为受体， 建立了稳定、高效的目标基因瞬时表达与鉴定体系。
技术体系包括， 选择自然生长12 d 的棉花幼嫩子叶为材料， 混合1.5%纤维素酶、0.4%离析酶、0.5 mol L -1甘露醇、20 mmol L -1 KCl 、20 mmol L -1 MES 、0.1 mol L -1 CaCl 2和1.0 g L -1 BSA， 在28℃黑暗条件下振荡酶解8 h， 可游离出浓度达1.0×106 mL -1以上的纯净棉花叶肉原生质体。
利用该方法将棉花锌指蛋白基因GhZFP2整合到pJIT166-GFP 质粒载体， 构建了GhZFP2：GFP 融合载体， 采用40% PEG-4000介导转化， 获得高转化率的棉花叶肉原生质体。
大量提取拟南芥保卫细胞原生质体方法的优化梁芸;孙宁;魏凤菊【摘要】保卫细胞在植物的生理和发育过程中发挥着重要作用,由于拟南芥作为研究材料自身的优越性,其保卫细胞成为研究信号转导机制的良好系统,对于基因组学和蛋白质组学分析具有重要意义.然而,大量获取保卫细胞原生质体存在一定的难度.本研究以拟南芥为材料,在两步酶解法的基础上,改用更加经济的纤维素酶,摸索酶浓度及酶解时间,旨在获得一套可以快捷、高效、低成本提取保卫细胞原生质体的方法.结果表明:黑暗条件下,22℃,酶解液Ⅰ酶解1h,酶解液Ⅱ(纤维素酶Onozuka R-10浓度2.5％)酶解2h,可最大量地收集原生质体.【期刊名称】《河北农业大学学报》【年(卷),期】2014(037)005【总页数】6页(P12-17)【关键词】保卫细胞;原生质体;大量提取;优化【作者】梁芸;孙宁;魏凤菊【作者单位】河北农业大学生命科学学院,植物逆境研究室,河北保定071001;河北农业大学生命科学学院,植物逆境研究室,河北保定071001;河北农业大学生命科学学院,植物逆境研究室,河北保定071001【正文语种】中文【中图分类】Q943气孔是植物进行气体交换的门户，由叶片表皮上的一对保卫细胞组成，可以响应多种外界刺激，如光、干旱和病原菌侵染等［1－4］。
一直以来，气孔是研究信号转导机制的重要模式系统。
多重外界刺激调节着气孔的运动［5－6］。
在保卫细胞中发现了许多与信号转导相关的蛋白质［7－8］，但是信号通路中的许多受体和一些信号相关组分在分子水平上仍然有待研究［9］。
目前关于保卫细胞内特异表达基因的研究还很有限［10－11］，保卫细胞的分子调节机制还不是十分的清楚。
原生质体是指去除细胞壁的细胞，保卫细胞原生质体（Guard Cell Protoplasts，GCPs）是研究气孔运动分子机制、膜透性和离子转运过程的重要材料。
通常将原生质体与膜片钳技术相结合［12－14］来研究膜电位变化；或通过转化GFP等荧光标记基因进行目的基因的亚细胞定位。
拟南芥原生质体制备原理拟南芥（Arabidopsis thaliana）是一种被广泛用于植物生物学研究的模式植物，拥有许多有益的特性，如小型体型、短生命周期和丰富的基因信息。
其中，原生质体（Protoplast）是拟南芥研究中广泛应用的一种实验材料，因其不包含细胞壁，使得研究人员可以更方便地通过转化等技术来分析和操作细胞。
本文将主要介绍拟南芥原生质体的制备原理，包括其基本步骤和关键操作。
一、拟南芥原生质体制备的基本步骤1.1 组织样品的准备首先，需要准备包含优良品种的拟南芥植株的新鲜叶片、茎段等组织样品作为原始材料。
这些组织样品应该是健康、无病虫害的，并且在生长状态良好的阶段。
要注意，不同部位的组织对原生质体制备的效率可能存在差异，因此可以根据具体实验目的选择合适的组织样品。
1.2 组织样品的消化将准备好的组织样品切碎，并加入含有合适浓度的细胞壁分解酶的酶解缓冲液中。
酶解缓冲液的选择应根据具体实验设计和预期结果来确定。
一般来说，含有高效的纤维素酶和果胶酶的酶解缓冲液可以更好地分解细胞壁，从而得到高质量的原生质体。
然后，将组织样品放置在酶解缓冲液中，在适当的温度下进行酶解。
酶解的时间和温度可以根据实验需求来确定，常见的条件为25-30℃，酶解时间约为3-6小时。
1.3 原生质体的分离和纯化经过酶解后，将酶解液通过筛网或离心等方法进行过滤，从而得到含有原生质体的悬浮液。
为了去除杂质和细胞残片，可以将悬浮液进行一次或多次的离心，得到较为纯净的原生质体沉淀。
最后，将原生质体沉淀用含有适当浓度的蔗糖等质量调节液进行浓缩和纯化，以获得高质量的原生质体。
二、拟南芥原生质体制备的关键操作2.1 细胞壁分解酶的选择细胞壁分解酶是原生质体制备中非常关键的一步，选择适当的酶解酶组合可以确保高效的细胞壁降解。
一般来说，搭配使用纤维素酶和果胶酶可以较好地完成细胞壁降解。
此外，还可以根据实验需求添加其他辅助酶，如蛋白酶和胰蛋白酶等，以进一步提高酶解效果。
六安2024届高三年级质量检测卷生物试卷（四）（答案在最后）命题人：樊蕾审题人：栾小玉一、单选题（每题3分，共45分）1．下列关于酶的特性及相关实验的说法，正确的是（）A．证明“酶具有高效性”的实验中，至少要设置两个实验组B．证明“酶具有专一性”的实验中，自变量只能是酶的种类D．证明“酶的活性受pH影响”的实验中，底物可以选择淀粉C．证明“酶的活性受温度影响”的实验中，需设置空白对照组2．中国是一个农业大国，源远流长的农耕文明是孕育中华文明的母体和基础。
农业谚语是我国劳动人民在农业生产实践中总结出来的农事经验。
下列对农业谚语的解读，错误的是（）A．“一挑粪进，一挑谷出”，施加有机肥可间接为植物补充CO2进而增加有机物积累B．“处暑里的雨，谷仓里的米”，补充水分可减弱植物的光合午休进而增加有机物积累C．“霜前霜，米如糠；霜后霜，谷满仓”，霜降前降温可减弱种子呼吸作用进而增加有机物积累D．“春雨漫了垄，麦子豌豆丢了种”，雨水过多会减弱种子的有氧呼吸进而降低其萌发率3．南极雌帝企鹅产蛋后，由雄帝企鹅负责孵蛋，孵蛋期间不进食。
下列叙述错误的是（）A．帝企鹅蛋的卵清蛋白中N元素的质量分数高于C元素B．帝企鹅的核酸、多糖和蛋白质合成过程中都有水的产生C．帝企鹅蛋孵化过程中有mRNA和蛋白质种类的变化D．雄帝企鹅孵蛋期间主要靠消耗体内脂肪以供能4．葡萄与爬山虎均是葡萄科常见植物，将二倍体爬山虎的花粉涂在未受粉的二倍体葡萄柱头上，可获得无子葡萄。
下列叙述正确的是（）A．爬山虎和葡萄之间存在生殖隔离B．爬山虎花粉引起葡萄果实发生了基因突变C．无子葡萄经无性繁殖产生的植株仍结无子果实D．无子葡萄的果肉细胞含一个染色体组5．某团队通过多代细胞培养，将小鼠胚胎干细胞的Y染色体去除，获得XO胚胎干细胞，再经过一系列处理，使之转变为有功能的卵母细胞。
下列有关叙述错误的是（）A．营养供应充足时，传代培养的胚胎干细胞不会发生接触抑制B．获得XO胚胎干细胞的过程发生了染色体数目变异C．XO胚胎干细胞转变为有功能的卵母细胞的过程发生了细胞分化D．若某濒危哺乳动物仅存雄性个体，可用该法获得有功能的卵母细胞用于繁育6．某伴X染色体隐性遗传病的系谱图如下，基因检测发现致病基因d有两种突变形式，记作dA与dB。
拟南芥原⽣质体制备转化⽅法整理溶液配制1、纤维素酶解液：2、PEG4000溶液（⼀次配置可以保存五天，但是最好现⽤现配，每个样品需100µl PEG4000溶液，可根据实验样品量调整溶液配置总量）3、W5 溶液4、MM G溶液5、WI溶液拟南芥原⽣质体制备转化⽅法整理⼀、⼟培室播种种植的拟南芥。
⼆、⽣长良好情况下在未开花前⽤于取材叶⽚制备原⽣质体。
三、剪取中部⽣长良好的叶⽚⽤⼑⽚切成0.5 -1 mm宽的叶条。
四、将切好叶条掷⼊预先配置好的酶解液中（每5-10 ml酶解液⼤约需10-20⽚叶⼦）。
并⽤镊⼦帮助使叶⼦完全浸⼊酶解液。
五、⽤真空泵于⿊暗中抽30分钟。
（此时可配制PEG4000溶液，200和1000 ul 枪头去尖使操作时吸打缓和。
）六、在室温中⽆须摇动继续⿊暗条件下酶解⾄少3个⼩时。
当酶解液变绿时轻轻摇晃培养⽫促使原⽣质体释放出来。
（此时预冷⼀定量W5溶液）七、显微镜下检查溶液中的原⽣质体，拟南芥叶⾁原⽣质体⼤⼩⼤约30-50 um。
⼋、在过滤除去未溶解的叶⽚前⽤等量的W5溶液稀释含有原⽣质体的酶液。
九、先⽤W5溶液润湿35-75 um的尼龙膜或60-100⽬筛⼦，然后⽤它过滤含有原⽣质体的酶解液。
⼗、⽤30毫升的圆底离⼼管100g，1-2分钟离⼼沉淀原⽣质体。
尽量去除上清然后⽤10ml 冰上预冷的W5溶液轻柔重悬原⽣质体。
⼗⼀、在冰上静⾄原⽣质体30分钟。
以下操作在室温23℃下进⾏⼗⼆、100g离⼼⼋⾄⼗分钟使原⽣质体沉淀在管底。
在不碰触原⽣质体沉淀的情况下尽量去除W5溶液。
然后⽤适量MMG溶液（1m）重悬原⽣质体，使之最终浓度在2X105个/ml。
⼗三、加⼊10 ul DNA（10-20微克约5-10kb的质粒DNA）⾄2ml离⼼管中。
⼗四、加⼊100 ul原⽣质体（2x104个），轻柔混合。
⼗五、加⼊110 ul PEG溶液，轻柔拍打离⼼管完全混合（每次⼤约可以转化6-10个样品）。
PEG介导拟南芥叶片原生质体瞬时表达方法1.B5培养基上萌发拟南芥种子，待根长至1-3厘米时即可移栽到土里，温室培养，光照12h/12h，150μE。
2.准备好一个90mm培养皿，称1.82克D－甘露醇于20ml双蒸水中。
培养皿的盖子用来切叶片。
3.取4周后未抽台前的叶片，约90片。
切成1mm宽的长条，置于甘露醇溶液中。
可以一边切一边从植株上取。
4. 配酶解液，100ml三角瓶，15ml酶解体系。
5. 将步骤3中细条捞出，置于酶解液中。
黑暗，23℃，40-50rpm酶解3小时。
6. 酶解液过100-200目的筛子，将过滤后的绿色混合物置于15ml离心管（直径约1cm）中，均分为两管。
4℃，60 g，15min，brake 设为4-5。
7. 弃上清，沉淀用冰冷的W5溶液轻柔洗涤，每管4ml。
4℃，100 g，1min，brake 设为4-5。
8. 弃上清，沉淀用冰冷的W5溶液轻柔洗涤，每管4ml。
冰上放置30min。
9. 23℃，100 g，1min，brake 设为4-5。
弃上清，每管沉淀用0.5ml MaMg重悬。
（本步骤及以下操作均在23℃。
）10. 取约10-20ug 质粒于1.5ml EP管中，加100ul 步骤9中的原生质体。
用200ul 枪头（剪去前端）轻柔混匀。
11. 加入110ul PEG/Ca 溶液，轻柔混匀。
放置20-30min。
12. 加入0.44ml W5 溶液，来回颠倒混匀。
23℃，100 g，1min，brake 设为4-5。
13. 弃上清，加100ul W5，混匀。
加900ul W5，混匀。
14. 上述混合液体置于六孔板内，23℃，弱光，孵育6-18小时。
15. 荧光观察，观察之前100g，常温，离心2分钟，终体积控制在50ul左右。
Solution RecipesEnzyme solution1ml 15％cellulase R10 (RS is too strong)1ml 4.5％macerozyme R10 (Yakult Honsha, Tokyo, Japan)1.09 g mannitol1ml 0.3M KCl1ml 0.3M MES, pH 5.7Heat the enzyme solution at 55oC for 10 min (to inactivate proteases and enhance enzymesolubility) and cool it to room temperature before adding1ml 0.15M CaCl21ml 0.75mM β-mercaptoethanol1ml 1.5% BSAPEG solution (40%, v/v)1 g PEG4000 (Fluka, #81240) **Very Important!!0.75 ml H2O0.625 ml 0.8 M mannitol0.25 ml 1M CaCl2W 51000 ml154 mM NaCl 9.0 g125 mM CaCl2 18.4 g5 mM KCl 0.37 g5 mM glucose 0.9 g0.03% MES 0.3 gpH to 5.8 with KOHautoclave 20 minutes in 125 bottlesMaMg solution100 ml15 mM MgCl2 1.5 ml 1M MgCl20.1% MES 0.1 g0.4 M mannitol 7.3 gpH to 5.6 with KOHautoclave 20 minutes in 125 ml bottlesReferences1. Sheen, J. 2002, A transient expression assay using Arabidopsis mesophyll protoplasts./sheenweb/2. Doelling & Pikaard. 1993, Transient expression in Arabidopsis thaliana protoplasts derived from rapidlyestablished cell suspension cultures. Plant Cell Reports 12: 241-244Enzyme solutionPrepare 20 mM MES (pH 5.7) containing 1.5% (wt/vol) cellulase R10, 0.4% (wt/vol) macerozyme R10,0.4Mmannitol and 20mMKCl.Warm the solution at 55 ℃for 10 min to inactivate DNAse and proteases and enhance enzyme solubility. Cool it to room temperature (25 ℃) and add 10mM CaCl2, 1–5 mM β-mercaptoethanol (ptional) and 0.1% BSA. ▲CRITICAL :Addition of 1–5 mM β-mercaptoethanol is optional, and its use should bedetermined according to the experimental purpose. ▲CRITICAL Before the enzyme powder is added, the MES solution is preheated at 70 ℃for 3–5 min. The final enzyme solution should be clear light brown. Filter the final enzyme solution through a 0.45µmsyringe filter device into a Petri dish (100x 25mm2 for 10 ml enzyme solution).▲CRITICAL The enzyme solution should be prepared fresh.WI solutionPrepare 4 mM MES (pH 5.7) containing 0.5 M mannitol and 20 mM KCl. The prepared WI solution can be stored at room temperature (22–25 ℃).W5 solutionPrepare 2mM MES (pH 5.7) containing 154mM NaCl, 125mM CaCl2 and 5 mM KCl. The prepared W5 solution can be stored at room temperature.MMG solutionPrepare 4 mM MES (pH 5.7) containing 0.4 M mannitol and 15mMMgCl2. The preparedMMG solution can be stored at room temperature. PEG–calcium transfection solution Prepare 20–40% (wt/vol) PEG4000 in ddH2O containing 0.2 M mannitol and 100 mM CaCl2. ▲CRITICAL Prepare PEG solution at least 1 h before transfectionto completely dissolve PEG. The PEG solution can be stored at room temperature and used within 5 d. However, freshly prepared PEG solution gives relatively better protoplast transfection efficiency. Do not autoclave PEG solution.Protoplast lysis bufferPrepare 2.5 mM Tris–phosphate (pH 7.8) containing 1 mM DTT, 2 mM DACTAA, 10% (vol/vol) glycerol and 1% (vol/vol) Triton X-100. The lysis buffer should be prepared fresh.MUG substrate mix for GUS assayPrepare 10 mM Tris–HCl (pH 8) containing 1 mM MUG and 2 mM MgCl2. The prepared GUS assay substrate can be stored at –20 ℃PRO CEDUREPlant growth _ Timing 3–4 weeks生长3-4周1| Grow Arabidopsis plants on either Metro-Mix 360 or Jiffy7 soil in a greenhouse or anenvironment-controlled chamber with a relatively short photoperiod (10–13 h light at 23 ℃/11–14 h dark at 20℃) under low light (50–75 µE m–2 s–1) and 40–65% relative humidity.较短的光照时间(10-13小时光照23℃/11-14小时黑暗20℃) 40-65%的相对湿度.▲CRITICAL STEPCol-0 and Ler have been extensively tested in our lab. In general, Arabidopsis plants are very sensitiveto all kinds of environmental changes (e.g., drought, flooding, extreme temperature and constant mechanical perturbation). Try to maintain aconstant environment as much as possible.注意:经过我们实验室的反复验证,总的来说拟南芥对各种环境变化非常敏感(如干旱,水淹,极端温度和不停地机械性干扰)。
洗液对拟南芥叶原生质体分离的影响
赵严伟;黄志刚;李合松
【期刊名称】《中国农学通报》
【年(卷),期】2011(27)12
【摘要】原生质体分离过程中洗液对原生质体的纯化和保存起着重要的作用。
本试验通过比较30h内WI、W5、MMg3种洗液中原生质体数量与活力的变化以及分析不同浓度CaCl2处理WI、W5、MMg后对原生质体的影响,选择出获得最多活性原生质体数量的洗液。
结果表明,WI在维持质膜稳定性上较有优势,而W5则更有利于保持原生质体活力且30h后得到的活性原生质体最多,较适宜在短期内保存原生质体;CaCl2处理洗液对原生质体活力无显著影响,且其对原生质体数量的影响取决于CaCl2处理浓度及洗液种类,MMg洗液在补充0～50mM CaCl2后原生质体数量呈上升趋势。
【总页数】4页(P187-190)
【关键词】原生质体;洗液;CaCl2
【作者】赵严伟;黄志刚;李合松
【作者单位】湖南农业大学生物科学技术学院
【正文语种】中文
【中图分类】Q25
【相关文献】
1.IAA处理对拟南芥叶原生质体分离的影响 [J], 赵严伟;黄志刚;李合松
2.拟南芥叶肉细胞原生质体分离及影响因素 [J], 陈颖;贾艳菊;张翠茹
3.不同酶解条件对金边瑞香幼叶原生质体分离的影响 [J], 屈红恩;王烈峰;刘仁林;藤莉丽
4.IAA处理对拟南芥叶原生质体分离的影响 [J], 赵严伟; 黄志刚; 李合松
5.甘蔗幼叶原生质体分离过程中呼吸的变化及其影响因素 [J], 何若天;覃伟
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