拟南芥原生质体制备转化操作

拟南芥（Arabidopsisthaliana）遗传转化实验技术原理拟南芥是植物领域应用较为广泛的模式生物。

由于具有较小的基因组（135 Mbp），生命周期短，可以在多种环境下生长，一直被视为研究植物遗传学、进化、种群遗传学和植物生长发育的系统。

农杆菌介导的蘸花法是目前相对成熟、应用较为广泛的拟南芥稳定遗传转化方法。

转化步骤大致如下：拟南芥（T0代）的花序浸没在一定浓度的含有目标转化质粒的根癌土壤杆菌（Agrobacterium tumefaciens）（常用的根癌农杆菌菌株为GV3101）悬浮液中，然后放在一定条件下进行培养（图1 a-e）。

待植物成熟后收集T0代植物的种子，将这些种子放在含有特定抗生素的培养基上进行生长筛选（图1f），获得阳性植株。

与其他植物转化方法相比，蘸花法需要较少的人力和专用试剂，所需设备相对简单且转化效率较高（在优化的条件下大于1%）（1）。

图 1. 拟南芥蘸花法简要过程（2）。

拟南芥瞬时转化常用的有农杆菌介导的叶片转化、基因枪轰击和聚乙二醇(PEG)介导的原生质体转化等方法。

拟南芥的瞬时转化为研究启动子活性、蛋白的亚细胞定位和蛋白相互作用等提供了支撑。

参考文献：Ghedira R.; et al.(2013) The ef f iciency of Arabidopsis thaliana f loral dip transf ormation isdetermined not only by the Agrobacterium strain used but also by the physiology and the ecotypeof the dipped plant. Moecular Plant Microbe Interaction, 26(7), 823-832.Zhang, X.; et al.(2006). Agrobacterium-mediated transf ormation of Arabidopsis thaliana using thef loral dip method. Nature Protocols, 1(2), 641-645.。

拟南芥原生质体制备转化方法选取开花前生长良好情况的拟南芥（Columbia型）叶片，用刀片切成0.5-1 mm宽的叶条；浸于配置好的酶解液中（每5-10 mL酶解液约10-20片叶子）；暗箱抽真空，30 min；转移至室温，继续黑暗酶解3-5 h；当酶解液变绿时轻轻摇晃培养皿促使原生质体释放；加入等量的W5溶液稀释酶解液；用60-100目筛子（W5溶液润湿）过滤酶解液；将滤液转移至30 mL eppendorf管，500-700 g离心1-2 min，弃上清；加入10 mL预冷的W5溶液轻柔重悬原生质体；放于冰上静置30 min；保持室温在23℃以下；500 g离心8-10 min，弃上清；加入1 mL MMG溶液重悬原生质体（使其终浓度约在2×105个/mL）；即得到原生质体溶液。

用移液器吸取100 L的以上原生质体溶液于1.5 mL eppendorf管，加入10L DNA（10-20 g的质粒DNA），轻柔混合后，加入110 L PEG溶液，轻柔拍打eppendorf管使其混合完全；室温下诱导转化5-15 min；加入400-440 L W5溶液稀释转化混合液，轻柔颠倒，使之混合完好以终止转化反应；500 g离心2 min，弃上清；加入1 mL W5溶液悬浮清洗，500 g 离心2 min，弃上清；再用1 mL WI溶液轻柔重悬原生质体；室温（20-25℃）下，诱导载体表达18小时以上。

相关溶液配制PEG4000溶液（现用现配）组分用量PEG4000 1 g1 M CaCl20.25 mL0.8甘露醇0.625 mL水0.75 mL纤维素酶解液试剂15 mL酶液体系1-1.5 % Cellulase R10 (YaKult Honsha) 0.225 g 纤维素酶0.2-0.4 % Mecerozyme R10 (YaKult Honsha) 0.045 g 果胶酶0.4 M 甘露醇 1.09 g甘露醇干粉20 mM KCl 1 mL 0.3 M KCl20 mM MES, pH5.7 1 mL 0.3 M MES，pH5.7加水10 mL55℃水浴加热10 min，冷却至室温后加入以下试剂10 mM CaCl2 1 mL 0.15 M CaCl20.1% BSA 1 mL 1.5 % BSA5 mM β-巯基乙醇1mL 75 mM β-巯基乙醇用0.45 m滤膜过滤后即可使用。

拟南芥原生质体的提取和转化(1)取4周后抽薹前的叶片，切成1mm宽的长条，置于甘露醇溶液（称1.82g D-甘露醇于20ml双蒸水中）；共需叶片约90片；(2)将步骤1中细条捞出，置于酶解液中；避光，23℃,40-50rpm摇床上酶解3小时；(3)酶解液过100-200目的筛子，收集滤液，置于15ml离心管中，均分为两管；于4℃，60g，离心15min；(4)原生质体用冰冷W5溶液轻柔洗涤，每管4ml；4℃，100g，离心1min；(5)弃上清，沉淀用冰冷的W5溶液轻柔悬浮，每管4ml；冰上放置30min；(6)23℃，100 g离心1min；弃上清，每管沉淀用0.5ml MaMg重悬；以下操作均在23℃下进行：(7)取约10-20ug 质粒于1.5ml EP管中，加100ul 步骤6中的原生质体；用200ul 枪头（剪去前端）轻柔混匀；(8)加入110ul PEG/Ca 溶液，轻柔混匀；放置20-30min；(9)加入0.44ml W5 溶液，来回颠倒混匀；23℃，100 g，1min，brake 设为4-5；(10)弃上清，加100ul W5，混匀；加900ul W5，混匀；(11)上述混合液体置于六孔板内，23℃，避光，孵育6-18小时。

(1)酶解液：cellulose R10 15%Macerozyme R10 0.3%Mannitol 1.09gKCl 0.3MMES 0.3M调节pH值到5.7，55℃加热10min，冷却到室温再加入下列溶液CaCl20.15Mβ-巯基乙醇0.75mM(2)PEG溶液（40%，v/v）PEG4000 1g0.8M Mannitol 0.625ml1M CaCl2 0.25m(3)W5溶液154mM NaCl 9.0g125mM CaCl218.4g5mM KCl 0.37g5mM glucose 0.9g0.03%MES 0.3g用KOH调pH至5.8，定容至1000ml，高压灭菌(4)MaMg溶液1M MgCl20.5ml0.1%MES 0.1g0.4M Mannitol7.3g用KOH调pH至5.8，定容至1000ml，高压灭菌。

拟南芥待转化植株培养及遗传转化一实验目的：获得待转化拟南芥植株并进行花序浸润转化植株。

二实验材料：拟南芥种子（拟南芥的生态型最好是Col-0或者Ws-O，Nd-O，No-O），25cm3花盆，15ml离心管，10ml吸管，Agar，乙醇，次氯酸钠，利福平，Silwet L-77，营养液配方所需试剂，营养土，蛭石，塑料薄膜，托盘等。

三实验步骤：1 待转化植株培养⑴种子消毒：20μl种子装入1.5ml离心管内，加1ml 75% 乙醇消毒1分钟；吸去乙醇，加入1ml 1%次氯酸钠，震荡洗涤15-20分钟；稍离心使种子沉于下部，吸去次氯酸钠，加入无菌蒸馏水清洗（清洗3次，每次洗完后稍离心，吸净水分）；均匀撒播于MS培养基平板上，注意每次洗脱用V ortxe充分混匀。

⑵春化作用：将MS培养基放到4℃冰箱中放置2天。

⑶将MS培养基放置在23 0 C/20 0 C光照培养箱16h/8h培养，在有3~5片成熟叶片后，移栽生长良好的拟南芥幼苗至用营养液浇灌过的营养土和蛭石（4:6）中生长，营养土和蛭石分装在25cm3的小培养皿中，保湿7天左右，湿度为60%~80%。

在生长期间适当浇灌营养液，按需要没3-4周一次（或者时间更长）。

⑷为了在每个植株上得到较多的花芽，当大多数植株第一个花序形成后剪去第一个花序，解除顶端优势，促使多个次生花序的同步出现。

当大多数花序约1~10cm高（剪主序后4~8d）时准备浸润。

表1 MS培养基注意事项：①溶化琼脂：用粗天平分别称取琼脂5.5g、蔗糖20 g，放入1 000 mL的搪瓷量杯中，再加入750 mL蒸馏水，用电炉加热，边加热边用玻璃棒搅拌，直到液体呈半透明状。

然后再将配好的混合培养液加入到煮沸的琼脂中，最后加蒸馏水定容至1000 mL，搅拌均匀。

②调节PH至5.7~5.8。

表2 营养液配方（无需调节PH）成分含量（mol/L）Ca(NO3)2·4H2O 1.01×10-3NH4H2PO4 1.30×10-4KNO3 5.10×10-3MgSO4·7H2O 4.98×10-4NaOH 3.13×10-5Fe-EDTA 2.24×10-5H3BO39.68×10-6Mncl2·4H2O 2.03×10-6CuSO4·5H2O 2.1×10-7MoO3 1.39×10-7Co（NO3）2·6H2O 8.59×10-8NH4NO3 2.93×10-52 农杆菌的培养取出保种的农杆菌菌液活化后，挑取农杆菌单菌落接入10mL无菌LB液体培养基中（一般含75mg/ L利福平、100mg/ L链霉素和100mg/ L卡那霉素），28℃恒温下250r/ min 振摇过夜培养。

拟南芥原生质体遗传转化1.目的●了解在拟南芥悬浮培养的细胞中瞬间表达目的基因的遗传转化方法。

●学习和掌握拟南芥原生质体的制备方法。

2.原理原生质体是除去细胞壁的裸露细胞。

由于消除了细胞壁的障碍，故原生质体是遗传操作、基因转化的好材料。

以植物原生质体为材料进行遗传转化，可以瞬间表达外源基因，也可以获得外源基因稳定表达的转基因细胞系或转基因植株。

常用的进行原生质体遗传转化的方法有电击法和PEG介导的转化法。

电击法利用高压电脉冲使细胞膜发生瞬间的可逆穿孔，从而使外源基因穿过细胞膜而进入细胞中。

这种方法操作简单，转化效率高，但是需要电击仪。

PEG（聚乙二醇）介导的转化方法是通过PEG处理改变细胞膜的通透性，从而使外源DNA易于进入原生质体。

此方法不需要特殊的仪器设备，实验结果比较稳定。

拟南芥原生质体可以从悬浮培养的细胞分离，也可以由新鲜叶片分离制备。

本实验是从拟南芥悬浮培养的细胞分离原生质体，然后进行遗传转化。

3.材料、试剂和仪器3.1 材料●拟南芥（Col-0）悬浮培养细胞●带GFP报告基因的质粒3.2 试剂●B5-0.28 M S(蔗糖)：MS盐（Duchefa M0222.0025） 4.4 g/l蔗糖0.28 M（96 g/l）用KOH调pH至5.5，抽滤灭菌。

●B5-0.34 M GM（葡萄糖, 甘露醇）：MS盐（Duchefa M0222.0025） 4.4 g/l葡萄糖30.5 g/l甘露醇30.5 g/l用KOH调pH至5.5，抽滤灭菌。

●酶解液：纤维素酶1% (0.5 g/ 50 ml)离析酶0.2% (0.1 g/ 50 ml)以上两种酶溶于B5-0.34 M GM中，低速搅拌30 min，用Whatmann滤纸过滤, 然后抽滤灭菌。

●PEG溶液：PEG 6000 25%甘露醇0.45 MCa(NO3)2 0.1 M用KOH调pH至9.0，抽滤灭菌。

●0.275 M Ca(NO3)2：Ca(NO3)2·4H2O 64.94 g/l抽滤灭菌。

一、实验目的本实验旨在通过农杆菌介导法对拟南芥（Arabidopsis thaliana）进行遗传转化，将目的基因导入拟南芥基因组中，并通过筛选和鉴定得到转基因植株。

二、实验材料1. 拟南芥（T0代）植株2. 根癌土壤杆菌（Agrobacterium tumefaciens）GV3101菌株3. 目的基因质粒（含有荧光素酶基因）4. 抗生素：卡那霉素、氯霉素5. 培养基：MS培养基、N6培养基、再生培养基6. 仪器：离心机、PCR仪、荧光显微镜等三、实验方法1. 构建重组表达载体将荧光素酶基因插入到农杆菌转化载体pCAMBIA1300中，构建重组表达载体pC1300-FRT::GUS。

2. 农杆菌转化将重组表达载体转化根癌土壤杆菌GV3101菌株，通过平板划线法筛选阳性克隆。

3. 拟南芥转化将阳性克隆的农杆菌悬浮液与拟南芥（T0代）花序进行蘸花处理，将蘸花后的拟南芥放入MS培养基中培养。

4. 筛选和鉴定在含有卡那霉素的培养基上筛选转基因植株，通过PCR检测和荧光显微镜观察GUS 基因的表达情况，鉴定转基因植株。

5. 再生和繁殖将转基因植株移栽至N6培养基中培养，待植株生长稳定后，收集种子进行繁殖。

四、实验结果1. 构建重组表达载体成功构建了含有荧光素酶基因的重组表达载体pC1300-FRT::GUS。

2. 农杆菌转化通过平板划线法筛选到阳性克隆，表明重组表达载体已成功转化根癌土壤杆菌GV3101菌株。

3. 拟南芥转化蘸花处理后，部分拟南芥植株在含有卡那霉素的培养基上生长，表明转基因植株已成功筛选。

4. 筛选和鉴定通过PCR检测和荧光显微镜观察，发现部分转基因植株GUS基因表达阳性，荧光素酶活性明显。

5. 再生和繁殖将转基因植株移栽至N6培养基中培养，植株生长良好，繁殖成功。

五、实验讨论1. 本实验通过农杆菌介导法成功将荧光素酶基因导入拟南芥基因组中，获得了转基因植株。

2. 在实验过程中，农杆菌转化和拟南芥转化效果良好，表明该实验方法适用于拟南芥遗传转化。

花序浸染法转化拟南芥1 种植或者移栽拟南芥之前都需要提前一天泡土，泡土过程中要加足量的水。

营养土和蛭石1：1比例混合。

2 可以采取两种方法种植野生型拟南芥：一种是直接在大钵子里种八、九颗，小钵子里种四、五颗，等它稍微长大以后去掉长势不好的或者不能成活的，大钵子保留四颗，小钵子保留两颗，这种方法不用移栽；另一种是现在大钵子里种上几十颗（小钵子里相应的减少），等它们长成小苗后移栽（千万不要等它们长大了再移栽，因为这时它们的根会缠绕在一起，很不好移栽，而且还容易伤根），这种方法移栽比较麻烦，但是在移栽过程中能保证你要移栽的每一颗都是长势良好的拟南芥。

不管你采取哪种方法，在种下拟南芥后都需要浇水并盖膜，盖膜的目的是为了保持水分。

注意：移栽拟南芥后还需要盖3到4天的膜，因为刚移栽的苗子比较小。

总之盖膜时间自己灵活掌握。

3 转拟南芥一般用GV3101这个农杆菌，在你电转农杆菌，挑取阳性克隆检测后，先用2ml离心管少量摇菌，每管装1ml的LB，分装2管，摇8—10小时（时间灵活掌握，有时候需要摇更长的时间才能浑浊）待浑浊后再转移到500ml三角瓶（按1：100的比例装有200ml的LB）中大量摇菌8—10小时直到浑浊为止（有时候需要摇更长的时间才能浑浊）。

浑浊的标准是OD值为0.8，但是现在基本都不测OD值。

（在摇菌过程中所用的离心管和LB要灭菌，另外还要注意添加抗生素利福平，最好选用利福平和另外一种到两种抗生素以达到双抗或者三抗的效果，实际上双抗就可以了，理论上可以添加三种抗生素，一种是利福平，GV3 101农杆菌本身就是抗利福平的；另一种是农杆菌自身所携带的协助Ti质粒载体上的基因所抗的抗生素；还有一种就是T-DNA区内基因所对应的抗生素），接下来就是离心富集农杆菌（用离心瓶或者是50ml的大离心管，这个时候离心瓶或者50ml大离心管可以灭菌也可以不灭菌），然后用100ml的5﹪的蔗糖悬浮，蔗糖溶液中加入20微升表明活性剂，也就是浓度0.02%（此时的蔗糖溶液就不用灭菌了，因为以后的侵染也不在超净工作台操作）。

拟南芥的遗传转化（花序浸泡法）
1.培养基
YEP培养基：蛋白胨10g/L 酵母提取物10g/L
NaCl 5g/L 固体琼脂粉15g/L
2.拟南芥材料
培养拟南芥直到它们开始抽苔并产生花序（为了让植株产生更多不成熟的花序，需要推迟转化实验，将抽出的第一个苔剪去，以便于莲花座上腋芽分化出的第二花序的增值）。

3.拟南芥的遗传转化
1)含有目的基因的双元载体转化农杆菌，并接种当菌斑到5ml含有
适当抗生素的YEP液体培养基中，28℃培养2天。

2)再将这一培养基内注入500ml带有适当抗生素的YEP液体培养
基，并在28℃条件下培养16-24小时，使用生长达到稳定期的细胞（OD=1.0-1.6）
3)室温下4000rpm离心10分钟，收集农杆菌细胞，然后加入新制的
5%蔗糖，轻轻悬浮细胞，使OD =0.6-0.8
加入Silwet L-77至浓度0.05%，立刻混匀。

将农杆菌悬浮细胞转移到大的平皿中，用于侵染。

注：Silwet L-77可能有毒，腰带手套保护皮肤。

4)倾斜植株，使所有的花序都浸泡在农杆菌溶液中，浸泡时间1.5-2
分钟，取出后轻轻煽动10秒，控干3-5秒，将植株横放，暗处培养16小时，再恢复光照。

5)为了提高转化效率，可以浸泡植株两次，中间相隔7天。

6)分株收种子，并在含有合适抗生素的MS培养基上萌发，筛选得
到T1转基因拟南芥。

拟南芥原⽣质体转化在短⽇照，相对低光和⾼湿的条件下种苗⼦。

（10-13 h light at 23°C/11-14 h dark at 20°C）（50-75µmol m-2 S-2），湿度40-65%。

选择3-4周的苗⼦，没有开花，没有胁迫，⼀般第5-7⽚真叶已经完全展开。

选取第5,6,7⽚真叶，⽤锋利的⼑⽚切下，在实验台上，先把叶⽚的边缘切掉，然后将叶⽚的中间部分切成0.5-1mm 的细条，将切好的细条两⾯都沾到酶解液，浸泡到酶解液Enzyme solution中。

28°C⿊暗消化叶⽚5 h。

⼀般10⽚叶⽚⾜够做20个样品的。

向消化好的叶⽚中加⼊等体积的W5 solution（10 ml 酶解液加10 ml W5），轻轻混匀，⽤筛⼦将消化的原⽣质体过滤到50ml的圆底离⼼管中。

4°C，200 g，soft离⼼2 min，使原⽣质体沉到管底，去除上清，轻轻旋转离⼼管，使原⽣质体分散。

（⼤离⼼机上升下降的加速度设成5）.沿管壁向原⽣质体中缓缓加⼊5 ml的W5 solution，轻轻混匀后，冰上放置30 min，使原⽣质体靠重⼒沉降。

尽量去除上清，但不要碰到原⽣质体的沉淀，之后加⼊样品需要体积的MMG solution。

轻轻混匀，冰上放置。

分装10 µl质粒到2 ml的圆底离⼼管中，加⼊100 µl的原⽣质体，轻轻拨匀，之后沿管壁轻轻加⼊110 µl预先配好的PEG-calcium transfection solution，轻轻拨匀。

室温静置5-15 min。

向管中加⼊400-440 µl的W5 solution，轻轻颠倒混匀，终⽌转化反应。

RT，100 g，soft 离⼼2 min，之后去除上清。

⽤1 ml的W5 solution重悬原⽣质体。

将离⼼管放到光下培养过夜。

光下培养有利于某些基因的表达，但强光会破坏原⽣质体的⽣长，最后在培养的时候上⾯盖上两层卫⽣纸。

2.2.7 拟南芥原生质体制备制备酶解液10 ml1．取幼嫩拟南芥叶片，使用新的单面刀片将叶片切为0.5 mm-1 mm大小。

（用胶带把下表皮沾掉，效果更好。

放一小培养皿里面降解）2．材料侵入10 ml酶解液中，暗培养3 h-4 h，至原生质体完全从叶片上解离下来。

3．酶解结束后轻轻晃动溶液，镜检酶解结果。

4．使用200目不锈钢网筛过滤原生质体至新离心管中10ml。

（冰上）5．100×g，4℃，离心2 min，收集原生质体。

6．重悬原生质体于等体积预冷的W5液体培养基中，100×g离心2 min，收集原生质体，（重复三次）。

（重悬时，先加入少些W5轻轻悬起原生质体，随后再轻轻加入剩W5）7．重悬原生质体于等体积预冷的W5液体培养基中，冰浴30 min。

8．100×g离心2 min，收集原生质体，重悬原生质体于1/10体积MMg中。

（看细胞浓度而定）9．取少量重悬原生质体镜检，其余用于转化或4℃保存一周内使用。

2.2.8 原生质体转化1．在2 ml离心管中一次加入10 µl质粒DNA(10-20 µl，大小在5 Kb之内)，100 µl原生质体，充分混匀后加入110 µl PEG4000溶液。

（3=1+2）2．上述混合物室温放置10-30 min。

3．反应结束后加入440 µl W5液体培养基，充分混匀。

4．100×g离心2 min，收集原生质体，移除上清。

5．加入500 µl W5溶液培养基，100×g离心2 min，收集原生质体，（重复一次,可以重复两次）。

6．重悬原生质体于1 ml W5液体培养基中，在细胞培养板中，24℃黑暗培养。

7．取黑暗培养18 h后的原生质体，加入荧光素底物，使用CCD照相成像保存。

2. 酶解液10ml在一个10ml试管中分别加入下列组分Cellulase R10 0.15 gMacerozyme R10 0.04 g200mM MES pH5.7 1 ml200mM KCl 1 mlD- Mannitol 0.728 g1 M CaCl2100 µl加ddH2O至10 ml（0.45um过滤）Cellulase R10 , Macerozyme R10 :Yakault of Japan 都是经科宏达买的能买到sigma 最好了，其他药品都是sigma3. W5培养基50 ml在一个100 ml三角瓶中分别加入下列组分2M NaCl 3.85 ml200mM KCl 1.25 ml200mM MES 0.5 ml1M CaCl2 6.25 ml加ddH2O至50 ml4. MMg培养基10 ml在一个50 ml三角瓶中分别加入下列组分D-Mannitol 0.728 g150mM MgCl2 1 ml200mM MES pH5.7 200 µl加ddH2O至10 ml5. PEG/Ca2+溶液在一个10 ml离心管中分别加入下列组分PEG4000 4 gD-Mannitol 0.364 g1M CaCl2 1 ml加ddH2O至10 ml。