淋巴细胞表面标志的检测及亚群分类

淋巴细胞分类和功能分类淋巴细胞是一类重要的免疫细胞，是淋巴系统中的关键成员。

根据细胞的表面标志物和功能特点，淋巴细胞可以被分类为多个亚群。

下面将详细介绍淋巴细胞的分类和功能分类。

一、淋巴细胞的分类1. T淋巴细胞T淋巴细胞是最常见的淋巴细胞亚群，约占淋巴细胞总数的80%以上。

根据细胞表面的CD4和CD8标志物的表达情况，T淋巴细胞可以进一步分为T辅助细胞（CD4+ T细胞）和T细胞（CD8+ T细胞）。

2. B淋巴细胞B淋巴细胞是另一类重要的淋巴细胞亚群，约占淋巴细胞总数的10-20%。

B淋巴细胞主要负责体液免疫应答，能产生和分泌抗体，对于细菌和病毒的清除起到重要作用。

3.自然杀伤细胞（NK细胞）NK细胞是第三类重要的淋巴细胞亚群，约占淋巴细胞总数的5-10%。

NK细胞主要负责细胞免疫应答，能够直接杀伤一些感染病原体的细胞或肿瘤细胞。

4.大颗粒淋巴细胞（LGL细胞）LGL细胞是一大类异质性的细胞，具有很强的杀伤能力。

根据表面标志物的不同，大颗粒淋巴细胞可以进一步分为自然杀伤T细胞（NKT细胞）和T细胞淋巴瘤/白血病（T-LGL）。

5.调节性T细胞调节性T细胞（Treg细胞）是一群具有免疫调节功能的淋巴细胞。

它们能够抑制免疫应答的过度反应，维持免疫系统的平衡。

二、淋巴细胞的功能分类1.免疫应答调节淋巴细胞在免疫应答中起到了重要的调节作用。

T辅助细胞通过激活B淋巴细胞并促进抗体的产生，帮助清除外来病原体；T调节细胞则通过抑制免疫应答过程中的过度反应，维持免疫系统的平衡。

2.抗体产生在体液免疫应答中，B淋巴细胞能够通过抗体的产生来清除病原体。

B淋巴细胞通过识别和结合抗原，进而分化为浆细胞，产生大量的抗体。

3.细胞毒性杀伤NK细胞和一些T细胞具有细胞毒性杀伤能力。

它们能够杀伤肿瘤细胞和感染病原体的细胞，起到免疫防御的重要作用。

4.免疫记忆淋巴细胞是免疫记忆的关键细胞。

一旦机体曾经接触过某个病原体，记忆性淋巴细胞能够迅速被激活，并产生特异性的免疫应答，从而保护机体免受再度感染。

1. 了解淋巴细胞亚群检测的基本原理和方法。

2. 掌握流式细胞术在淋巴细胞亚群检测中的应用。

3. 分析实验结果，了解淋巴细胞亚群在免疫调节中的作用。

二、实验原理淋巴细胞亚群检测是利用流式细胞术对淋巴细胞进行分类、计数和功能分析的一种技术。

通过特异性抗体标记，检测淋巴细胞表面标志物，实现对不同亚群的识别。

本实验主要检测T细胞、B细胞和NK细胞亚群。

三、实验材料1. 实验试剂：抗CD3、抗CD4、抗CD8、抗CD19、抗CD16、抗CD56单克隆抗体。

2. 实验仪器：流式细胞仪、细胞培养箱、离心机、移液器等。

3. 实验样本：新鲜血液。

四、实验步骤1. 样本采集：采集受试者新鲜血液，分离外周血单个核细胞（PBMCs）。

2. 抗体标记：将分离的PBMCs与抗CD3、抗CD4、抗CD8、抗CD19、抗CD16、抗CD56单克隆抗体混合，室温孵育30分钟。

3. 洗涤：将标记好的细胞用磷酸盐缓冲盐溶液（PBS）洗涤两次。

4. 流式细胞术检测：将洗涤后的细胞上流式细胞仪，进行检测和分析。

5. 数据分析：使用流式细胞术分析软件对实验数据进行处理，计算各亚群细胞比例。

五、实验结果1. T细胞亚群：CD3+T细胞占外周血淋巴细胞的50-70%，其中CD4+T细胞占CD3+T 细胞的30-45%，CD8+T细胞占CD3+T细胞的30-45%。

2. B细胞亚群：CD19+B细胞占外周血淋巴细胞的10-20%。

3. NK细胞亚群：CD16+/CD56+细胞占外周血淋巴细胞的5-15%。

1. 实验结果表明，本实验成功检测了T细胞、B细胞和NK细胞亚群，验证了流式细胞术在淋巴细胞亚群检测中的应用价值。

2. 淋巴细胞亚群在免疫调节中发挥重要作用。

CD4+T细胞具有辅助功能，参与细胞免疫和体液免疫；CD8+T细胞具有杀伤功能，直接杀伤病毒感染细胞和肿瘤细胞；B细胞产生抗体，参与体液免疫；NK细胞具有天然杀伤功能，对病毒感染细胞和肿瘤细胞具有杀伤作用。

淋巴细胞的一般结构特点及分类淋巴细胞是一类重要的免疫细胞，具有多种结构特点和功能。

它们主要存在于淋巴组织和淋巴器官中，是机体免疫系统的重要组成部分，起着保护机体免受外界病原体侵害的重要作用。

淋巴细胞的结构特点和分类对于了解免疫系统的功能和机制具有重要意义。

一般来说，淋巴细胞具有以下结构特点：1.淋巴细胞的细胞核较大，呈圆形或椭圆形，核质比较富含染色质，核内有一两个核仁。

2.细胞质较少，主要由溶酶体、线粒体、内质网和高尔基体等细胞器组成。

3.细胞膜上有多种免疫受体，如T细胞受体（TCR）和B细胞受体（BCR），这些受体能够识别外来抗原并激活淋巴细胞。

4.淋巴细胞具有多样性，可以分为T淋巴细胞、B淋巴细胞和自然杀伤细胞等不同类型，每种类型的淋巴细胞在免疫应答中发挥着不同的作用。

根据功能和表面标志物的不同，淋巴细胞可以分为多个亚群，主要包括：1. T淋巴细胞：包括辅助T细胞（Th细胞）和细胞毒性T细胞（Tc 细胞）。

Th细胞在免疫应答中起着调节和协调作用，能够激活B细胞产生抗体和激活细胞免疫应答；Tc细胞则能够识别并杀灭感染病原体的细胞。

2. B淋巴细胞：主要功能是产生抗体，对抗体介导的免疫应答起着重要作用。

B细胞通过表面的BCR与抗原结合后，可被激活分化为浆细胞，产生大量抗体来清除病原体。

3. 自然杀伤细胞（NK细胞）：主要负责对异常细胞（如肿瘤细胞、病毒感染细胞）的直接杀伤，起到免疫监视和清除异常细胞的作用。

除了以上主要的淋巴细胞亚群外，还有其他类型的淋巴细胞，如调节性T细胞（Treg细胞）和记忆T细胞等，它们在免疫应答的调节和维持中发挥着重要作用。

总的来说，淋巴细胞在机体免疫系统中扮演着重要的角色，通过多种方式协同作用来保护机体免受病原体侵害。

深入了解淋巴细胞的结构特点和分类，有助于我们更好地理解免疫系统的功能和机制，为预防和治疗免疫相关疾病提供理论基础。

淋巴细胞的研究也将有助于揭示机体免疫应答的调控机制，为新型免疫治疗的研发提供重要参考。

T淋巴细胞亚群检测参考值淋巴细胞表面标志物检测：E玫瑰花形成试验、免疫荧光法（IFA）、荧光激活细胞分类法（FACS）、免疫金银法以及免疫酶染色法等。

E玫瑰花形成试验SRBC+CD2参考值Et 64.4%±6.7%免疫荧光法T淋巴细胞表面标志物检测意义可用于T淋巴细胞计数，T淋巴细胞亚群的分类以及判断T淋巴细胞的活化程度。

CD3 分子表达于所有成熟T淋巴细胞的表面，是总T淋巴细胞的重要标志，CD3+ 常见于甲状腺功能亢进、淋巴细胞性甲状腺炎、重症肌无力以及器官移植后排斥反应。

CD3+ 主要见于免疫缺陷病，如AIDS、先天性胸腺发育不全综合征以及联合免疫缺陷病等。

亦可见于恶性肿瘤、SLE、免疫抑制剂治疗等。

T细胞分化抗原测定白细胞分化抗原（cluster differentiation，CD）CD3代表总T淋巴细胞，CD4是辅助、诱导T细胞的标志，CD8是抑制、杀伤性T细胞的标志。

应用单抗和荧光标记二抗反应在荧光显微镜下或流式细胞仪中计数CD的百分率。

参考值：免疫荧光法（IFA）：CD3为63.1%±10.8%；CD4 为42.8%±9.5%；CD8 19.6%±5.9%；CD4 /CD8为（2.2±0.7）/1。

流式细胞术：CD3 61%~85%；CD4 28%~58%；CD8 19%~48%；CD4 /CD80.9~2.0/1。

T细胞分化抗原测定临床意义CD3CD4+T细胞下降常见于某些病毒感染性疾病，如AIDS、MCV、严重创伤、全身麻醉、大手术、应用免疫抑制剂等；升高见于类风湿性关节炎活动期。

CD8+ T细胞下降常见于类风湿性关节炎、Sjogren综合征、重症肌无力、DM（II型）以及膜型肾小球肾炎等；升高见于传染性单核细胞增多症急性期、MCV以及慢性乙肝。

CD4 +/CD8+比值下降，常见于AIDS、瘤型麻风病、恶性肿瘤进行期和复发时。

也见于部分感染性疾病如传染性单核细胞增多症、MCV、血吸虫病等；增高见于类风湿性关节炎活动期、SLE、Sjogren综合征、重症肌无力、膜型肾小球肾炎以及器官移植后排斥反应等。

t淋巴细胞亚群测定检测内容
淋巴细胞亚群检测主要包括以下内容：
1. T细胞亚群测定：T细胞是淋巴细胞中的一类重要的免疫细胞，根据表面标志物的不同，可以将其分为多个亚群。

常见的T细胞亚群包括CD4+ T细胞和CD8+ T细胞，它们在免疫调节和杀伤病原体方面起着重要作用。

2. B细胞细胞亚群测定：B细胞是淋巴细胞中的另一类免疫细胞，可以分泌抗体并参与体液免疫反应。

B细胞亚群测定可以确定不同类型的B细胞数量及功能状态。

3. 自然杀伤细胞（NK细胞）测定：NK细胞是淋巴细胞中的一类重要细胞，具有自然杀伤、分泌细胞因子等免疫功能。

NK细胞亚群测定可以了解NK细胞数量和杀伤活性。

4. 调节性T细胞（Treg细胞）测定：Treg细胞是T细胞中的一种特殊亚群，具有免疫抑制和免疫调节功能。

Treg细胞测定可以评估免疫调节的状态。

这些淋巴细胞亚群测定可以通过流式细胞术（Flow Cytometry）等实验方法进行。

这些检测内容可以帮助评估患者的免疫功能状态、了解免疫细胞亚群的数量及活性，对于诊断和治疗免疫相关疾病具有重要意义。

淋巴细胞标志和功能的检测人体内的淋巴细胞分为T细胞、B细胞和包括NK细胞为代表的第三群细胞，下分若干亚群，各有其特异的表面标志和功能，据此建立许多相应的检测方法。

临床上各种类型的免疫缺陷症、自身免疫病以及肿瘤等均可出现不同群淋巴细胞数量和功能的变化。

因此计数外周血和组织内淋巴细胞及其亚群的数目或比例，以及它们所显示的功能强弱，可藉此判断机体的细胞免疫水平，对临床认识疾病，探讨其发病机制、观察病情、判断预后、考核疗效以及防治疾病等方面可提供极为有用的信息。

第一节T细胞表面标志的检测一、特异性抗原的检测检测人T细胞的特异性抗原，曾采用抗人脑、抗人胸腺细胞和抗人T细胞等抗血清，通过细胞毒试验或免疫荧光染色加以鉴定。

自抗白细胞分化抗原的单克隆抗体问世以来，上述诸多方法均被新方法取而代之。

常用以鉴定和检测计数T细胞的表面分化抗原如表21-1所示。

表21-1 T胞表面主要CD抗原及其特异性用单克隆抗体检测T细胞表面抗原的方法有两大类，一类是用标记抗体着染，如免疫荧光法、酶免疫法、生物素－亲和素（或链霉亲和素）系统的ABC法以及免疫金银染色法；另一类是用抗体致敏的红细胞作花环试验。

两类方法各有优缺点。

以下叙述有代表性的方法。

（一）间接免疫荧光法本法是将分离获得的外周血单个核细胞分别与抗相应CD的单克隆抗体（如CD2、CD4、CD8）结合后，洗去游离的抗体，继加荧光素标记的抗小鼠IgG抗血清，经温育结合后，洗去多余的标记抗体，取样制片，用荧光显微镜观察并计数约200个单个核细胞，以荧光阳性细胞与计数细胞总数之比，求得相应CD抗原阳性的T百分率。

如有条件，细胞经荧光标记抗体着染后，用流式细胞仪计数，快速而准确，但需要较多的投资，难以普及应用。

（二）免疫细胞化学法通常用酶免疫检测法，如APAAP酶免疫桥联法。

为减少非特异性着染，可选用生物素－链霉亲和素系统试剂作ABC法染色。

该类方法可用普通显微镜观察，凡呈棕黄色的细胞为相应CD抗原阳性细胞，计其占总淋巴细胞的百分率。

两种流式细胞仪检测T细胞亚群的比对分析流式细胞仪是一种用于研究和分析细胞的仪器。

它可以通过分析细胞的表面标记物或细胞内的分子，来获得关于细胞亚群的信息。

其中，T细胞是一类重要的免疫细胞，可以分为多个不同的亚群，如细胞毒性T细胞（CD8+）、辅助性T细胞（CD4+）等。

在免疫学研究和临床检测中，了解T细胞亚群的数量和比例对于评估免疫功能的状态至关重要。

下面将介绍两种常用的流式细胞仪检测T细胞亚群的比对分析方法。

1.全血淋巴细胞表面标记法全血淋巴细胞表面标记法是通过将新鲜全血样本进行细胞表面标记，然后使用流式细胞仪进行分析。

该方法的优点是样本处理简单快速，可以直接得到体内T细胞亚群的比例。

具体步骤如下：（1）制备淋巴细胞上清液：将新鲜全血样本与等体积的生理盐水混合，用离心管密封离心，将上清液分离出来。

（2）染色：将淋巴细胞上清液转移到离心管中，加入适量的表面标记的单克隆抗体。

常用的表面标记抗体有CD3、CD4和CD8等。

（3）洗涤：离心管密封离心，将上清液倒掉，再次加入适量的生理盐水洗涤淋巴细胞。

（4）流式细胞仪检测：将洗涤后的细胞上样到流式细胞仪中，设置相应的检测参数，如激发波长和荧光信号的检测通道。

通过流式细胞仪收集数据，并使用分析软件对数据进行解析和计算。

这种方法的优点是可以同时检测多种T细胞亚群，准确计算亚群的比例。

但是由于这种方法无法获得细胞内的功能和分子表达信息，只能通过表面标记物进行鉴定。

2.胞浆染色法胞浆染色法是通过流式细胞仪检测细胞胞浆内的标记物，从而分析T 细胞亚群的比例。

该方法通常与细胞表面标记法联合使用，可以同时获得细胞表面和胞浆内的信息。

具体步骤如下：（1）制备全血淋巴细胞上清液：与全血淋巴细胞表面标记法相同。

（2）染色：将淋巴细胞上清液进行细胞膜标记和胞浆胞浆标记。

胞浆标记常用的有抗体和荧光染料，如免疫球蛋白（IgG）等。

（3）洗涤：与全血淋巴细胞表面标记法相同。

（4）流式细胞仪检测：与全血淋巴细胞表面标记法相同，但需要在分析软件中选择相应的通道来检测胞浆标记物。

项目十七T淋巴细胞表面标志和功能检测一、E花环形成试验(Erythrocyte rosette formation assay)【实验原理】人外周血T淋巴细胞表面具有绵羊红细胞(SRBC)受体，可与SRBC结合形成花环样细胞团(即E花环)。

此试验用于计数T细胞数量，进而可判断机体细胞免疫状况。

由于T 细胞的异质性，其中在4℃放置1h以上，所形成的花环数代表T细胞总数，称为总花环(Et 花环)，而淋巴细胞与SRBC混合后不经4℃作用，立即反应形成的花环称为活性花环(Ea花环)。

【试剂和器材】1．肝素抗凝剂用Hanks液将肝素配成500U/ml，分装，每管0.1ml，置4℃备用。

2．淋巴细胞分离液(密度为1.077±0.001)。

3．小牛血清56℃加热灭活30min，按2:1比例与沉积SRBC混合，置37℃30min，离心，收集血清备用。

4．0.5％SRBC悬液取脱纤维或Alsever液保存的羊血，用5～10倍量生理盐水洗3 次。

第3次2500r/min离心10min，弃上清液，用生理盐水配成0.5％的SRBC悬液(约108个细胞/ml)。

5．0.8％戊二醛取30.25ml 4.5 g/L NaCl 盐水，加入1ml 25％戊二醛即可。

6．姬姆萨-瑞氏染液取磷酸缓冲液(PB：1/15 mol/L, pH7.0～7.4)10ml，加入姬姆萨染液6滴及瑞氏染液1滴。

7．Alsever液、Hanks液(无Ca2+和Mg2+, pH7.2～7.4)、PB(1/15 mol/L, pH7.0～7.4)、生理盐水。

8．离心机、水浴箱、电冰箱、显微镜、离心管、载玻片、盖玻片、吸管、吸球、注射器。

【步骤和方法】1．淋巴细胞悬液的制备取2ml肝素抗凝血，加入2ml Hanks液，叠加于2ml 淋巴细胞分离液上，水平离心2000 r/min 20 min。

取出单个核细胞层，用4~5倍Hanks液洗2次，每次离心1000r/min 10min。