流式检测淋巴细胞亚群在临床中的应用

流式细胞术及其临床应用ABSTRACTKey words: Flowcytometry; Immunophenotyping; Leukemia; Activated platelets; Tumor; Apoptosis.流式细胞术(flowcytometry FCM)是对单个细胞或其他生物微粒进行快速定量分析和分选的一门技术。

在分析或分选过程中，包绕在流动液体中处理过的单个细胞或微粒通过聚焦的光源，产生电信号，这些信号代表光散射、荧光等参数，以此测定出细胞或微粒的物理和化学性质，并可根据这些性质分选出高纯度的细胞亚群，以对其进一步的培养或分析。

包绕细胞的液流称为鞘液。

所用仪器称为流式细胞仪（flowcytometer FCM）。

流式细胞术综合了光学、电子学、流体力学、细胞化学、免疫学、激光技术和计算机科学等多门学科和技术，具有检测速度快、精确、测量指标多、采集数据量大、分析全面、方法灵活等特点。

一、流式细胞仪(flowcytometer FCM)1．流式细胞仪的基本结构流式细胞仪的结构一般可分四部分，见图1。

（1）流动系统流动系统是流式细胞仪的心脏，因为细胞悬液在被检测之前必须首先形成一个很细的稳流，细胞在其内部排成单列通过测量区。

细胞悬液和鞘液分别（是分别还是同时）进入流动室，鞘液的作用是使样品悬液中的粒子组成单一纵列方式通过测量区，保证每个细胞通过激光照射区的时间相等，从而得到准确的细胞荧光信息。

（2）激光系统多采用氩离子激光器。

使发射光在可见光谱范围内488nm激发。

目前市场上大多数荧光色素适用于此波长。

激光的单色性好，功率高，稳定。

（3）光学和电子系统激光束射至经流体力学聚焦的个别细胞和粒子后，光散射在各个方向(360?)发射。

有两个光散射参数需收集，前向角散射(FSC)主要用于检测细胞体积的大小。

另一为侧向散射(SSC)用于检测细胞膜，胞质，核膜等细胞内部结构及胞质内颗粒。

荧光信号是由对细胞进行染色的特异性荧光染料受到激光激发后发射的。

流式细胞术分析外周血淋巴细胞亚群在儿科的临床应用专家共识（2019完整版）流式细胞术（flow cytometry,FCM）是一种对单细胞或生物颗粒进行多参数、定量分析的技术，具有速度快、精度高、准确性好等优点。

目前FCM广泛应用于临床医学，在疾病的预防、诊断、治疗及预后判断中具有重要作用。

但是淋巴细胞亚群在不同年龄阶段有不同的正常参考范围[1]，并且其结果受多种因素的影响，造成临床判读相对困难。

为科学合理应用FCM协助诊治儿科疾病，"流式细胞术分析外周血淋巴细胞亚群在儿科的临床应用共识"在多个学术组织的协作下于2016年正式发表[2]。

该共识提高了医务工作者对FCM在儿科临床应用的认识，促进了临床诊疗水平的提高。

医学技术飞速发展，FCM的应用也有了一定的进展。

为适应医学发展和临床应用的需要，多个学术组织的专家讨论撰写了"流式细胞术分析外周血淋巴细胞亚群在儿科的临床应用专家共识（2019版）"。

一、淋巴细胞亚群分析常规检测项目和报告内容淋巴细胞亚群分析是临床开展最多的FCM检测项目，是指借助各种荧光染料标记的单克隆抗体测定各类淋巴细胞胞膜或胞内独特的分化抗原（cluster of differentiation,CD），对淋巴细胞的各个亚群进行分析。

原国家卫生部发布的FCM检测外周血淋巴细胞亚群指南（WS/T 360－2011）对于规范FCM在外周血淋巴细胞亚群分析中的应用具有重要指导意义。

检测过程需注意标本采集和运输、免疫荧光染色、检测和分析、结果报告和审核等方面。

常规检测的淋巴细胞亚群包括T细胞（CD3+）、B细胞（CD3－CD19+）和NK细胞（CD3－CD16+CD56+）；T细胞又分为2个亚群：辅助性T细胞（CD3+CD4+）和杀伤性T细胞（CD3+CD8+）。

淋巴细胞亚群分析报告应提供各个亚群细胞的相对计数（百分比）和绝对计数。

FCM可以直接测得各淋巴细胞亚群的相对计数。

2023 流式细胞分析的标准化和标准化〔全文〕流式细胞分析的临床应用日趋广泛，主要应用有淋巴细胞亚群、造血干细胞计数、白血病免疫表型、阵发性睡眠性血红蛋白尿症诊断、血小板自身抗体及膜糖蛋白检测等，为机体免疫功能评估、血液与淋巴组织肿瘤的诊断、分型、鉴别诊断和预后等供给依据。

随着相关技术的进步和开展，临床使用的流式细胞仪从最初的单激光3 色，已经开展为3 激光10 12 色, 甚至5 激光18 色，一些型流式细胞仪如光谱流式细胞仪更是可以供给至少24 色。

毫无疑问，更多参数流式细胞仪的应用给使用者供给了更多的数据信息，有助于提高疾病的诊疗效率。

流式细胞分析具有强大的用户自定义功能，即不同用户〔试验室〕可依据自己试验目的建立检测流程，从某种程度上讲，流式细胞分析属于试验室自建方法〔laboratory designed test, LDT 〕范畴。

因此，各个试验室操作步骤如染色过程、抗体组合、数据分析等方面都不尽一样。

另一方面, 不同类型的流式细胞仪在激光光源、荧光素种类、抗体克隆、分析软件等的设置也不尽一样。

此外，目前尚未研发出相关工程的标准品。

以上诸多因素导致了流式细胞分析的结果存在较大差异，结果可比性有待提高。

行业内也面临标准化、标准化多参数流式细胞分析这一巨大挑战。

_、标准操作过程流式细胞分析的首要操作是标本处理，这个环节直接影响检测结果全都性和可比性,是标准化至关重要的一环。

具体步骤有标本采集、接收、标本处理。

前 2 个因素的标准化要求在临床试验室标准化协会等多个文件中均已说明。

标本处理通常分为染色和离心2 个步骤,标准地进展标本染色和离心可以确保结果全都性。

(-)标本染色标准化临床实际工作中，标本染色程序依据试验目的进展选择和确认。

选择: 前向散射光(forward scatter, FSC )和侧向散射光(side scatter, SSC ) 的变异系数(coefficient of variation , CV )低；标本中主要细胞亚群的FSC 和SSC 平均通道数要有明显差异细胞损失最小荧光强度保持最高；不影响偶联荧光染料的稳定性；背景染色低；室内误差最小；操作简便快速。

一、诊断性指标如图1所示，图（左）白血病细胞成为一个单一的群体，很难区分原始或病态的白血病细胞和成熟的细胞。

但是通过CD45和（SSC）设门法之后（图右），看到图（左）无法区分细胞被分成了五群。

在这五群中，成熟细胞CD45表达的荧光比较强。

A门里是淋巴细胞，B门里是单核细胞，C门里就是粒细胞群，D门里是原始细胞，一般CD45表达较弱。

一些细胞碎片、红细胞和转移来的瘤细胞，由于不表达CD45，可能位于D门、D门偏下或者E门的位置。

CD45结合侧向散射光之后能把白血病细胞找出来，减少了其它细胞的干扰。

对D门里的白血病细胞做进一步的分型，就能准确看到白血病细胞群免疫分型的表达情况。

图13.白血病的特异性标志免疫表型分析主要是根据细胞的特异表面标志，把白细胞分成T细胞、B细胞和原始细胞。

T淋巴细胞白血病一般表达的分化抗原有胞浆内的cCD3、抗TCRαβ、抗TCRγδ、CD2、CD5、CD8、CD10和CD7；B淋巴细胞白血病一般表达的分化抗原有胞浆内的cCD79a、CD22、CD19 、CD10和CD20；髓系白血病一般表达的分化抗原有胞浆内的cMPO、CD117、CD13、CD33、CD14、CD15和CD64；NK淋巴细胞白血病一般表达的分化抗原有CD16、CD56和CD57；红白血病一般表达的分化抗原有GlyA和CD36；巨核细胞白血病一般表达的分化抗原有CD41、CD42和CD61；一系列非特异标志在不同的白血病中可能都有表达，尤其是表达在早期的造血干组细胞上，一般表达的分化抗原有CD34和HLA-DR。

其中，对T淋巴细胞白血病来讲比较特异的是胞浆内的CD3，当胞浆内CD3出现阳性的时候，高度怀疑是T淋巴细胞白血病。

对于B淋巴细胞白血病来讲，胞浆内的CD79a和CD19是比较特异的，cCD79a最具特异性。

cCD3和cCD79a分别表达于早期T细胞和B细胞。

cMPO是髓系特异标志。

如图2所示为B-ALL的表达图。

淋巴细胞亚群流式
淋巴细胞亚群流式是一种通过流式细胞术检测淋巴细胞亚群的方法。

流式细胞术是一种用于分析细胞特性和功能的生物技术，通过将单个细胞与特异性抗体结合，对细胞表面和内部标记物进行定量和定性分析。

在淋巴细胞亚群流式中，通过使用特异性抗体标记不同的淋巴细胞亚群，如T细胞、B细胞、NK细胞等，然后利用流式细胞仪对标记后的细胞进行快速分析和计数。

这种方法可以获得淋巴细胞亚群的相对百分比和绝对值，从而评估机体的免疫状态。

淋巴细胞亚群流式在临床诊治中发挥了重要作用。

例如，在白血病诊断和治疗中，通过监测异常淋巴细胞亚群及绝对计数结果，可以为临床初步判断信息提供依据。

同时，在诊疗阶段，更为明确的白血病分型及MRD监测有助于为治疗方案选择、临床疗效分析、预后判断、复发监测等方面提供更加精准的医学决策支持。

此外，在免疫重建过程中，多参数流式细胞术结果对于及时评价患者的细胞免疫功能，指导免疫抑制剂等药品的使用种类和剂量等方面均具有重要价值。

需要注意的是，临床检测都有标准化的检测方案，可以直接上机调用建立好的内置模板，使用比较方便。

流式细胞术（flow cytometry）是一种广泛应用于生物医学领域的技术，它通过检测细胞表面和内部分子的存在和数量，从而可以对细胞进行高度特异性的分析和分类。

在临床诊断、生物医学研究以及药物开发等方面都有着重要的应用。

其中，流式细胞术检测淋巴细胞亚群，可以帮助我们更好地了解免疫系统的功能状态，对于免疫相关疾病的诊断和治疗具有重要意义。

本文将从原理和注意事项两个方面，深入探讨流式细胞术检测淋巴细胞亚群的相关知识。

**一、流式细胞术检测淋巴细胞亚群的原理**1. 标本处理流式细胞术检测淋巴细胞亚群的首要步骤是标本处理。

通常情况下，我们会收集外周血进行检测。

在实际操作中，需要抗凝剂进行处理，避免血液凝固，从而保证细胞的完整性。

2. 抗体染色标本处理完成后，接下来是抗体染色。

我们会选择特定的单克隆或多克隆抗体，将其与待检测的淋巴细胞结合。

这些抗体会携带着荧光标记，通过激光的激发，可以将淋巴细胞亚群进行精准识别。

3. 流式细胞分析染色完成后，样本会被注入到流式细胞仪中，通过激光的激发和散射光的检测，可以将不同淋巴细胞亚群进行高效、高速的分析。

在这一步骤中，流式细胞仪会根据荧光信号的强度和特异性来对淋巴细胞进行分类和计数。

4. 数据分析通过计算机对流式细胞仪获取的数据进行分析和解读，我们可以得到淋巴细胞亚群的比例、数量和表达特征等信息，从而更好地了解免疫系统的状态和功能。

**二、流式细胞术检测淋巴细胞亚群的注意事项**1. 样本保存在进行流式细胞术之前，我们需要认真保存样本，避免细胞的损伤和变性。

通常情况下，标本需要在4摄氏度下保存，并尽快进行检测，避免细胞的失活和降解。

2. 抗体选择在进行抗体染色时，需要根据实际情况选择合适的抗体，保证其对于待检测的淋巴细胞具有高度的特异性和亲和性。

还需要注意避免抗体的交叉反应，以免对结果的准确性造成影响。

3. 仪器校准流式细胞仪作为检测设备，需要定期进行校准和质控。

外周血淋巴细胞免疫亚裙计数概念及应用一、概述外周血淋巴细胞免疫亚裙计数是一种用于评估机体免疫功能的检测技术，通过对外周血中不同类型淋巴细胞数量的测定，可以帮助医生判断机体的免疫状态，诊断免疫系统相关疾病以及监测免疫治疗的疗效。

本文将就外周血淋巴细胞免疫亚裙计数的概念、检测方法以及临床应用进行介绍。

二、外周血淋巴细胞免疫亚裙计数的概念外周血淋巴细胞免疫亚裙计数是通过流式细胞术或细胞分析仪等技术，对外周血中的淋巴细胞进行亚裙分型和计数。

淋巴细胞主要包括T淋巴细胞、B淋巴细胞和NK细胞，其中T淋巴细胞可以进一步分为CD4+T细胞和CD8+T细胞，而B淋巴细胞可以进一步分为成熟B细胞和记忆B细胞。

三、外周血淋巴细胞免疫亚裙计数的检测方法1. 样本采集：外周血样本采集是进行外周血淋巴细胞免疫亚裙计数的第一步，通常采用静脉血抽取的方式获取样本。

2. 样本处理：采集到的外周血样本需要经过一定的处理才能进行免疫亚裙计数的检测，比如进行红细胞裂解等操作。

3. 流式细胞术：流式细胞术是一种通过激光仪器检测样本中细胞类型和数量的技术，可以用于进行外周血淋巴细胞免疫亚裙计数。

4. 细胞分析仪：细胞分析仪是一种用于细胞计数和分类的仪器，在外周血淋巴细胞免疫亚裙计数中也有着重要的应用。

四、外周血淋巴细胞免疫亚裙计数的临床应用外周血淋巴细胞免疫亚裙计数在临床上具有重要的应用价值，主要体现在以下几个方面：1. 免疫功能评估：通过对外周血淋巴细胞免疫亚裙计数的检测，可以评估机体的免疫功能状态，了解机体的免疫活性和免疫抑制情况，为临床治疗提供重要参考依据。

2. 免疫系统疾病诊断：外周血淋巴细胞免疫亚裙计数可以用于诊断免疫系统相关疾病，比如自身免疫性疾病、免疫缺陷病等，有助于医生进行早期诊断和治疗。

3. 免疫治疗监测：在进行免疫治疗的过程中，通过定期监测外周血淋巴细胞免疫亚裙的变化，可以了解治疗的效果和机体的免疫反应，为治疗方案的调整提供依据。

淋巴细胞亚群检测在肿瘤临床的应用一、淋巴细胞亚群检测内容：T淋巴细胞（CD3+）：T辅助\诱导淋巴细胞(CD3+CD4+)细胞免疫(Th1, Treg)T 抑制\毒性淋巴细胞(CD3+CD8+) 淋巴细胞亚群B淋巴细胞（CD19+）体液免疫：以B淋巴细胞产生抗体，特异性地结合并清除外来物质为特征NK细胞CD3-CD16+56+：是机体固有免疫的重要成分免疫监控：CD4/CD8：二、动态检测肿瘤淋巴细胞亚群的临床意义：(一)、辅助诊断：评价肿瘤患者的整体免疫功能。

一般来说，由于肿瘤抑制免疫细胞、化疗毒副作用、放疗损伤等原因肿瘤患者免疫功能低下，呈现一定的特征。

一般肿瘤患者的总T淋巴细胞（CD3+）降低，T抑制性淋巴细胞（CD3+CD8+）早期升高，中晚期患者降低，T辅助\诱导淋巴细胞(CD3+CD4+)降低，CD4/CD8比值降低，NK细胞在肿瘤的早期升高，中晚期降低。

由于放化疗的原因，肿瘤病人的B淋巴细胞也时常会降低。

例1：如下表是我科检测的典型的肿瘤患者的流式报告：结果提示：这是一个早期肿瘤患者的检测结果。

Th细胞及Th/Ts细胞比值降低多见于恶性肿瘤，此时机体防御病毒能力降低并处于“免疫抑制”状态。

肿瘤早期NK细胞升高，NK细胞可非特异直接杀伤肿瘤细胞，其活性可作为判断机体抗肿瘤和抗病毒感染的指标之一。

不同发展阶段的肿瘤患者，免疫功能状态也存在很大差异，随着病程进展，CD3、CD4、CD4/CD8逐渐降低，CD8逐渐增高。

（临床和实验医学杂志，2009,9月第5卷,第9期。

）I期：CD4、CD8未见明显抑制，CD4/CD8比例基本正常。

II期：CD4减少明显，CD8增高，CD4/CD8比值下降III-IV期：CD4显著减少，CD8明显降低，CD4/CD8比值下降或倒置。

（二）、疗效观察，判断预后：1）：常规肿瘤手术，放疗和化疗可引起免疫功能抑制，淋巴细胞亚群检测结果可呈规律性改变，甚至紊乱。

流式细胞术的工作原理及其临床应用一、本文概述流式细胞术（Flow Cytometry，FCM）是一种在液流中快速检测和分析单个细胞的技术，广泛应用于生物学、医学和生物技术等众多领域。

本文将对流式细胞术的工作原理进行详细介绍，并探讨其在临床诊断和治疗中的广泛应用。

我们将概述流式细胞术的基本原理和技术特点，包括细胞染色、荧光信号检测和数据分析等方面。

然后，我们将深入探讨流式细胞术在免疫学、血液学、肿瘤学等领域中的临床应用，以及其在疾病诊断、预后评估、疗效监测等方面的重要作用。

我们将对流式细胞术的未来发展趋势进行展望，以期为读者提供全面而深入的了解。

二、流式细胞术的工作原理流式细胞术（Flow Cytometry，FCM）是一种在液流中快速定量分析和分选细胞的技术。

其工作原理主要基于流式细胞仪的精确设计和操作。

待检测的细胞经过预处理，如荧光标记、固定和破膜等，使其带有可检测的荧光染料或抗体。

这些细胞随后被导入到流式细胞仪中，通过喷嘴形成单细胞悬液，并以一定的流速通过检测区域。

在检测区域，细胞经过激光束的照射，激发出荧光信号。

这些信号被光电倍增管等光电转换器接收，并转化为电信号。

电信号经过放大、数字化处理后，由计算机系统进行记录和分析。

流式细胞仪可以同时检测多个参数，如细胞大小、内部结构、DNA 含量、蛋白质表达等。

这些参数的分析主要基于荧光信号的强度和波长，以及细胞的电学特性，如电阻抗。

流式细胞术还可以结合分选技术，将特定类型的细胞从混合细胞群体中分离出来。

这主要通过在流式细胞仪的出口处设置电磁场或静电场，对带有特定荧光信号的细胞进行偏转，从而实现细胞的分选。

流式细胞术的工作原理是将单个细胞在液流中快速通过激光束，通过检测和分析荧光信号，实现细胞的定量和定性分析，以及细胞的分选。

这种技术具有高灵敏度、高分辨率和高通量的特点，广泛应用于生物医学研究的各个领域。

三、流式细胞术的临床应用流式细胞术（Flow Cytometry，FCM）作为一种高度灵敏且多功能的细胞分析技术，在临床医学领域的应用日益广泛。