农杆菌介导法

1 实验背景什么是“植物转基因技术”“转基因植物”？植物转基因技术：把从动物、植物或微生物中分离获得的目的基因，或者经过修饰的目的基因，通过各种方法转移重组到植物基因组内，使之稳定遗传并赋予植物新的遗传性状的方法。

转基因植物：通过植物转基因技术获得的、整合有外源基因的植物个体。

1 实验背景为什么要进行植物转基因？优势：◆农业：生产抗逆、高产、优质、抗病虫、除草剂、营养品质改良等优良性状的作物；遗传育种等。

◆制药、化工等：可作为生物反应器，生产药用蛋白和有用次生代谢物，或生产某些有机化合物等。

◆园艺：美化生活等，如蓝玫瑰等。

◆科学研究：生物学、遗传学等多领域基础研究等。

1 实验背景怎样将外源基因转入植物？间接转化法(载体介导)病毒介导法农杆菌介导法（双子叶/单子叶）种质系统介导法胚囊和子房注射法生殖细胞侵染法花粉管通道法直接转化法物理法化学法基因枪法(单子叶植物)显微注射法电击法超声波法PEG 法脂质体法1 实验背景各种转基因方法的区别是什么？（引自崔广荣，2003）1 实验背景针对不同植物，怎样选择转基因方法？目前转基因植株中，约80%以上通过“农杆菌介导转化法”获得。

植株特点首选方法备注对农杆菌敏感农杆菌介导法效率高，方法成熟，转基因植株遗传稳定。

原生质体培养容易直接转化法（如PEG 法）转化率高，可克服转基因植株嵌合体的难题。

多胚珠花粉管通道法提高转化率子房中有较大单胚珠植物(如核果类)显微注射法提高转化率转化难度大的植物基因枪法其它方法不可行时的备选放射性农杆菌发根农杆菌Agrobacterium rhizogenes根瘤农杆菌Agrobacterium tumefaciens旋钩子农杆菌1 实验背景农杆菌为什么能够介导基因转入植物？土壤农杆菌革兰氏阴性菌RiTi 质粒(tumor inducing plasmid ）约150~200 kb向植物细胞传递外源基因Ti1 实验背景农杆菌为什么能够介导基因转入植物？Vir 区:毒性区，包含多个致病基因，能激活T-DNA 的加工、剪切、复制及转入植物细胞，并使农杆菌表现出毒性。

实验九植物遗传转化——农杆菌介导法一、目的了解农杆菌转化的机理；掌握农杆菌介导转化水稻的技术二、原理根癌农杆菌(Agrobacterium tumefaciens)具有跨界转移DNA的能力。

下列因子与转化过程有关：1. Ti 质粒(tumor-inducing plasmid)上的T-DNA (transferred DNA)T-DNA是农杆菌Ti质粒上能够转移到植物基因组的一段DNA序列。

T-DNA含有RB和LB两个边界，它们是25bp的正向重复序列，是T-DNA 转移的顺式作用元件。

不同类型的农杆菌其边界序列有所不同，但划线部分为完全保守序列。

置于该边界内的任何外源基因均可被转化。

LB缺失突变后农杆菌仍能致瘤，但RB缺失会导致致瘤能力丧失，这时几乎完全没有T-DNA的转移。

LB（－链）5’GT TTACACCACAA TA TATCCTG CCA 3’RB（＋链）5’TGA CAGGA TA TA TTGGCGGGTAA AC 3’2. Ti质粒上的Vir区（virulence region）操纵子转化所必需的基因有vir A、B、C、D、E、G。

其中蛋白VirD1/D2识别T-DNA边界RB和LB；VirC识别T-DNA右边界的超驱增强子；VirD2在T-DNA底链起内切酶作用造成切刻，并与T－链5’ 共价结合，带有1个核定位信号NLS；VirB形成转移复合通道；VirE2为单链DNA 结合蛋白，有2个NLS。

该操纵子的表达顺序如下：vir A和vir G组成型表达形成VirA和VirG蛋白→VirA被植物创伤信号分子激活→激活的VirA使VirG激活→激活的VirG 诱导vir C、D、E、B、F、H表达。

3. 农杆菌染色体基因组相关基因：chv A、chv B（农杆菌运动、附着）、chv D、chv E（编码单糖结合蛋白、趋化性）、psc A、att、cel（合成纤维素丝，附着）。

它们与农杆菌的趋化性和识别附着植物细胞有关。

农杆菌介导的高效水稻遗传转化体系的研究A Highly Efficient Agrobacterium - mediated Rice Transformation Method水稻是基因组研究的模式植物 ,近年来水稻基因组研究取得了很大进展 ,构建了遗传图谱和物理图谱 ,完成了籼稻和粳稻的全基因组草图测2 - 3序 ,以及第 1 号和第 4 号染色体的精细测4 - 5序 ,并对第 10 号染色体的结构进行了详细分析。

在此基础上 ,各实验室大规模地 ,系统地进行水稻功能基因研究 ,普遍采用的研究手段是基因标签技术。

基因标签技术包括 T - DNA 和转座子标签 ,创建大量的基因标签体是功能基因研究的材料平台。

而根癌农杆菌介导的水稻遗传转化是水稻基因标签技术中的重要步骤之一。

本研究完善了根癌农杆菌介导的水稻转化方法 ,以期为水稻功能基因研究提供丰富材料 , 为水稻重要农艺性状的改良开辟途径。

1材料以水稻品种日本晴(Oryza sativa L. ssp.japonica)为试验材料。

菌株类型为 EHA105 超毒力菌株 ,载体为增强子捕获载体 pFX- E24. 2 - 15R(见图 1) ,载体上带有 GUS报告基因、35 S的 CaMV 启动子序列和潮霉素选择标记基因(HYG) 。

农杆菌菌株为EHA105。

2方法2.1水稻愈伤组织的诱导诱导方法参照 HIEI7等。

将日本晴水稻种子去壳 ,用 75 %乙醇灭菌 5min ,再用2. 5 %的次氯酸钠灭菌处理不同时间(40min ,37 min ,30 min 和 25 min) ,以确定最佳灭菌时间 ,灭菌后用无菌水冲洗 6～8 次 ,于 MS 固体培养基上28 ℃避光培养 ,30 d 后 ,将愈伤组织进行继代培养 ,得到胚性愈伤组织。

2.2农杆菌转化愈伤组织用 AB 固体培养基+氯霉素 25 mg/L + 利福平 20 mg/L + AS 20 mg/L培养农杆菌 ,在20 ℃下培养5～6 d。

根癌农杆菌介导法原理引言根癌农杆菌介导法是一种常用的基因转化技术，广泛应用于植物遗传工程领域。

它利用植物根癌农杆菌接触感染时产生的植物激素和DNA导入技术，将外源基因导入植物细胞，实现对植物基因组的改造。

本文将全面、详细、完整地探讨根癌农杆菌介导法的原理、应用以及优缺点。

根癌农杆菌的特点1. 根癌农杆菌简介根癌农杆菌(Agrobacterium tumefaciens) 是一种通过植物接触感染的土壤细菌，在植物遗传工程研究中具有重要的应用价值。

它能够将其自身的T-DNA（转座子DNA）片段导入植物细胞，并在植物细胞中稳定表达。

2. 根癌农杆菌的感染机制根癌农杆菌感染植物的过程包括以下几个步骤：1.识别和结合：根癌农杆菌通过识别植物伤口释放的酚类化合物，结合到植物细胞表面。

2.感染透入：根癌农杆菌产生的信号分子诱导植物细胞产生细胞壁降解酶，使其自身进入植物细胞。

3.T-DNA转移：根癌农杆菌通过特殊的转移螺旋（vir蛋白）将T-DNA从细菌自身转移到植物细胞中。

4.T-DNA整合：转移的T-DNA片段在植物细胞染色体上整合，并导致植物细胞的遗传改变。

根癌农杆菌介导法原理根癌农杆菌介导法利用根癌农杆菌的感染机制，将外源基因导入植物细胞，从而实现对植物基因组的改造。

1. 构建适合的转化载体在根癌农杆菌介导法中，首先需要构建适合的转化载体。

转化载体通常包括以下几个重要组成部分：•T-DNA：携带待转化的外源基因片段。

•选择标记基因：用于筛选转化成功的植物细胞。

•根癌农杆菌起始核酸序列（ori）：用于在根癌农杆菌中复制转化载体。

2. 根癌农杆菌感染植物将构建好的转化载体导入根癌农杆菌中，然后让根癌农杆菌感染植物组织。

通常可以通过以下步骤实现：•制备根癌农杆菌感染液：将构建好的转化载体导入根癌农杆菌中，培养至菌体达到一定浓度。

•植物组织处理：将待转化的植物组织浸泡在根癌农杆菌感染液中，利用真空处理或共振法促使菌体进入植物细胞。

农杆菌介导植物转化的机制及影响转化效率的因素农杆菌介导植物转化是一种常用的基因转化技术，利用农杆菌转化DNA进入植物细胞，使其表达目的基因。

在这个过程中，农杆菌的外源DNA会被单胞菌分泌物（Vir）基因编码的蛋白质工具分子T-DNA结合酶（VirD2）切割成目标T-DNA片段，然后T-DNA和Vir蛋白质工具分子挤进被切开的植物细胞，最终整合入植物细胞的染色体中。

1.农杆菌菌株：农杆菌菌株的选择对转化效率有重要影响。

通常选择具有较高转化效率的农杆菌菌株，如LBA4404、GV3101等。

不同的菌株对于不同的植物种类和品种可能有不同的适应性，因此需要根据具体情况进行选择。

2.感受性植物：不同植物对农杆菌介导植物转化的感受性各不相同，高度感受性的植物容易进行转化。

除了感受性外，植物的再生能力也是影响转化效率的因素之一、通常来说，拥有较高再生能力的植物对转化更加容易。

3.T-DNA载体：T-DNA载体是构建农杆菌介导植物转化载体的关键。

在农杆菌介导植物转化过程中，目标基因的载体必须经过农杆菌系统与植物细胞进行相应的介导，进而整合到植物细胞基因组中。

选择合适的T-DNA载体进行构建，可以提高转化效率。

此外，T-DNA载体中导入基因的拷贝数、插入位点的选择等也会对转化效率产生影响。

4.辅助物质：除了基础的转化体系以外，辅助物质也是影响转化效率的一个重要因素。

辅助物质主要包括感受性缓解物质、抗生素等。

感受性缓解物质主要用于保护不同类型的植物细胞免受农杆菌侵染造成的伤害，提高细胞存活率；抗生素主要用于抑制农杆菌菌落的生长，避免菌落过度生长对植物细胞的负面影响。

辅助物质的添加可以有效增加转化效率。

5.转化条件：转化温度、菌液浓度、转化时间等转化条件也会对转化效率产生影响。

具体条件需要根据植物种类和品种的特点进行优化。

总之，农杆菌介导植物转化主要是通过农杆菌菌株和植物的相互作用引发变化，其转化效率受多个因素的综合影响。

一. 植物遗传转化的方法植物遗传转化技术可分为两大类：一类是直接基因转移技术，包括基因枪法、原生质体法、脂质体法、花粉管通道法、电激转化法、PEG介导转化方法等，其中基因枪转化法是代表。

另一类是生物介导的转化方法，主要有农杆菌介导和病毒介导两种转化方法，其中农杆菌介导的转化方法操作简便、成本低、转化率高，广泛应用于双子叶植物的遗传转化。

二.农杆菌介导的基因转化方法（一）农杆菌的Ti质粒与T-DNA的整合机制几乎所有双子叶植物都容易受到土壤农杆菌感染，而产生根瘤。

它是一种革兰氏阴性土壤杆菌（A. tumefaciens）。

其致瘤特性是由Ti（tumor－inducing）质粒介导的。

农杆根瘤菌之所以会感染植物根部是因为植物根部损伤部位分泌出酚类物质乙酰丁香酮和羟基乙酰丁香酮，这些酚类物质可以诱导Vir（Virulence region)基因的启动表达，Vir基因的产物将Ti 质粒上的一段T－DNA单链切下，而位于根瘤染色体上的操纵子基因产物则与单链T－DNA 结合，形成复合物，转化植物根部细胞。

T－DNA 上有三套基因，其中两套基因分别控制合成植物生长素与分裂素，促使植物创伤组织无限制地生长与分裂，形成冠瘿瘤。

第三套基因合成冠瘿碱，冠瘿碱有四种类型：章鱼碱（octopine）、胭脂碱（nopaline）、农杆碱（agropine）、琥珀碱（succinamopine），使农杆菌生长必需的物质。

1. Ti质粒的结构在发现根瘤农杆菌诱发冠瘿瘤的本质是Ti 质粒后，Ti质粒便成为冠瘿瘤形成基因鉴定与分析的主要研究对象。

Ti质粒大约在160～240kB之间。

其中T-DNA大约在15kb-30kb。

Vir基因区在36kb 左右。

除此之外，Ti质粒上还存在Con区（region encoding conjugation)和Ori区（origin of replication)。

T-DNA上共有三套基因和左右两个边界，LB和RB是长为25bp的末端反复重复顺序，在切除及整合过程具有重要意义。

农杆菌介导的植物遗传转化技术的研究植物遗传转化技术是一项广泛应用于作物改良和生物制药领域的重要技术手段。

其中农杆菌介导的植物遗传转化技术是目前最为常用和成熟的一种转化方法。

本文将对农杆菌介导的植物遗传转化技术的研究进行介绍和探讨。

一、农杆菌介导的植物遗传转化技术原理农杆菌（Agrobacterium tumefaciens）是一种土壤杆菌，是一种天然的植物病原菌。

它通过菌体上存在的Ti质粒（tumor-inducing plasmid）和T-DNA（transfer DNA）片段，将外源DNA片段导入植物细胞并整合到植物基因组中，导致细胞核内出现转化的植物细胞。

因此，农杆菌介导的植物遗传转化技术也被称为农杆菌转化。

农杆菌介导的植物遗传转化技术包括以下几个步骤：农杆菌感染植物细胞、T-DNA整合进入植物细胞、T-DNA片段内的外源DNA导入植物细胞基因组、以及转化细胞的筛选和检测等。

其中，农杆菌感染植物细胞是整个转化过程的关键步骤，需要通过构建合适的载体和适当的农杆菌菌株，使其能够有效地感染到目标植物细胞。

二、农杆菌介导的植物遗传转化技术的研究进展农杆菌介导的植物遗传转化技术已经被广泛应用于许多作物品种的改良和基因功能研究中。

例如，利用农杆菌转化技术可将外源基因导入烟草、玉米、水稻、小麦、大豆等许多重要的作物中，实现对它们特性的改良。

在农杆菌介导的植物遗传转化技术的研究和应用中，也出现了许多问题。

其中，影响转化效率的因素包括转化载体、农杆菌菌株、植物品种、转化条件等。

此外，还存在着难以破解的难题，例如植物细胞壁难以透过、转化后细胞的不稳定性、外源基因的稳定性等。

为了提高转化效率和成功率，许多研究者着眼于改进农杆菌转化系统，包括构建新的载体、筛选适合的农杆菌菌株、研究植物细胞壁和农杆菌感染机制等。

一些新型转化技术，例如粒子轰击法、激光微加工技术和等离子膜处理技术等，也被尝试用于植物遗传转化中，但它们还需要进一步的研究和优化。

随着科学技术的不断发展，人类对植物基因研究的需求也日益增加。

而农杆菌介导的基因瞬时表达方法则成为了植物基因研究领域的热门话题之一。

本文将围绕这一主题展开讨论。

一、农杆菌介导的基因瞬时表达方法简介农杆菌介导的基因瞬时表达方法是一种将外源基因导入植物细胞中并在短时间内表达的技术。

其原理是利用土壤中常见的植物致病菌——农杆菌（Agrobacterium tumefaciens）来传递外源基因，使其经由农杆菌转座子插入到植物细胞的基因组中，从而实现目的基因的表达。

二、农杆菌介导的基因瞬时表达方法的优势1. 高效性：农杆菌介导的基因瞬时表达方法能够在短时间内使目的基因得到高效表达，为研究人员提供了更快捷、高效的研究手段。

2. 适用范围广：农杆菌介导的基因瞬时表达方法不仅适用于单一植物种类，还适用于多种植物，包括但不限于拟南芥、烟草、水稻等。

3. 可操作性强：相比于稳定转化方法，农杆菌介导的基因瞬时表达方法不需要等待植株成熟，而是直接在植物叶片上进行操作，省时省力。

三、农杆菌介导的基因瞬时表达方法的研究现状目前，科研人员对农杆菌介导的基因瞬时表达方法进行了大量探索与研究，不断优化该技术并拓展其应用范围。

通过改变农杆菌株系、转染条件、辅助基因等因素，有效提高了基因转化效率，并使其更适用于不同植物。

四、农杆菌介导的基因瞬时表达方法的应用前景随着生命科学领域的不断发展，对植物基因研究的需求逐渐增加，而农杆菌介导的基因瞬时表达方法正是满足这一需求的重要手段。

未来，该方法有望在植物遗传改良、抗病株培育、蛋白表达等方面发挥更为广泛的作用。

五、结语农杆菌介导的基因瞬时表达方法作为一种重要的植物基因研究技术，其独特的优势和潜在的应用前景吸引着越来越多的研究人员投入到相关领域的研究中。

随着技术的不断完善和发展，相信农杆菌介导的基因瞬时表达方法一定会为植物基因研究领域注入新的活力，为人类农业生产和生态环境的改善带来新的希望。

农杆菌介导的基因瞬时表达方法在植物基因研究领域中具有广阔的应用前景，其高效性和适用范围广的特点使其成为研究人员们研究植物基因功能和调控的重要工具。

农杆菌转化法又名农杆菌Boletus介导转化法。

农杆菌是普遍存在于土壤中的一种革兰氏阴性细菌，它能在自然条件下趋化性地感染大多数双子叶植物和裸子植物的受伤部位(受伤处的细胞会分泌大量酚类化合物,从而使农杆菌移向这些细胞)，并诱导产生冠瘿瘤或发状根农杆菌转化法。

根癌农杆菌和发根农杆菌中细胞中分别含有Ti(Tumour including)质粒和Ri质粒，其上有一段T-DNA(Transferring DNA)，农杆菌通过侵染植物伤口进入细胞后，可将T-DNA插入到植物基因组中,并且可以通过减数分裂稳定的遗传给后代，这一特性成为农杆菌介导法植物转基因的理论基础。

我们将目的基因插入到经过改造的T-DNA区，借助农杆菌的感染实现外源基因向植物细胞的转移与整合，然后通过细胞和组织培养技术，再生出转基因植株。

农杆菌介导法起初只被用于双子叶植物中，近年来，农杆菌介导转化在一些单子叶植物(尤其是水稻)中也得到了广泛应用。

本段步骤1、获取目的基因。

用限制酶切割下目的基因。

2、基因表达载体的构建。

将目的基因与载体(大多数选用质粒)用DNA连接酶连接起来。

3、将目的基因导入受体细胞。

将含目的基因的重组质粒导入农杆菌(农杆菌为受体细胞)。

4、目的基因的检测与鉴定。

用DNA分子杂交技术/分子杂交技术/抗原-抗体杂交/个体生物学水平鉴定(这个方法需要导入重组后的细胞的植物体，详见第五步) 几种方法进行检验(根据要求选取不同方法)。

5、最后将成功表达的细胞导入植物体内，对植物体进行个体生物学水平鉴定。

整个转基因体系的建立步骤大致可以归纳为:目的载体的构建---载体的农杆菌转化---农杆菌与植株共培养---转化植株的筛选---转化植株的鉴定。

在每一步中都涉及到很多的方法与技术。

目的载体的构建，包括目的基因的克隆，载体的酶切，连接，以及测序分析。

载体的农杆菌转化，目前有很成熟的方法，试验中应注意热激和冷激的时间。

农杆菌与植株的共培养，即为植株转化实验，在溶液中加入促进植株愈伤生长的激素能一定程度提高转化率。