农杆菌介导的植物转基因技术实验指导

农杆菌的活化培养及介导的遗传转化一、目的要求通过实验掌握农杆菌的活化与培养技术与农杆菌介导获得目的基因的转化植株。

二、基本原理农杆菌共培养法最早是由Marton 等（1979 年）以原生质体为受体建立起来的，经过一系列改进后，目前已经成为最常用的转化方法。

共培养法是利用Ti 质粒系统，将农杆菌与植物原生质体、悬浮培养细胞、叶盘、睫段等共同培养的一种转化方法。

三、材料及方法1.含目的基因共整合载体或双元载体的根癌农杆菌。

2.植物幼苗。

（一）细菌培养液直接浸染法操作︰（1）无菌受体材料的准备︰叶片、睫段、胚轴、子叶等均可做受体材料，有两种来源。

取自无菌试管苗。

取自田间或温室栽培植株︰叶片、睫尖、睫段用蒸馏水冲冼1 遍后，70％乙醇洗45 秒，0.1％升汞消毒6～8 分钟，无菌水冲洗三遍，无菌滤纸吸干水分。

（2）受体材料预培养︰将无菌叶片剪成0.5cm×0.5cm 的小块或用6mm 打孔器凿成圆盘，无菌胚轴、睫切成约0.8～1cm 长的切段，接种在愈伤组织诱导或分化培养基上进行预培养，注意叶片近轴面向下︰预培养2～3 天，材料切口处刚刚开始膨大时即可进行侵染。

（3）农杆菌培养︰从平板上挑取单菌落，接种到20mL 附加相应抗生素的细菌培养液体培养基（pH7.0）中，在恒温摇床上，于27℃, 180r/ min 培养至OD600 为0.6～0.8。

取OD600 为0.6～0.8 的菌液，按1％～2％的比例，转入新配制的无抗生素的细菌培养液体培养基中，可在与上相同的条件下培养6 小时左右，OD600 为0.2～0.5 时即可用于转化；或同时加入100～500μmol/的AS；（4）侵染︰于超净工作台上，将菌液倒入无菌小培养皿中（可根据材料对菌液的敏感情况进行不同倍数的稀释）。

从培养瓶中取出预培养过的外植体，放入菌液中，浸泡适当时间（一般1～5 分钟，不同材料处理时间不同）。

取出外植体置于无菌滤纸上吸去附着的菌液。

1 实验背景什么是“植物转基因技术”“转基因植物”？植物转基因技术：把从动物、植物或微生物中分离获得的目的基因，或者经过修饰的目的基因，通过各种方法转移重组到植物基因组内，使之稳定遗传并赋予植物新的遗传性状的方法。

转基因植物：通过植物转基因技术获得的、整合有外源基因的植物个体。

1 实验背景为什么要进行植物转基因？优势：◆农业：生产抗逆、高产、优质、抗病虫、除草剂、营养品质改良等优良性状的作物；遗传育种等。

◆制药、化工等：可作为生物反应器，生产药用蛋白和有用次生代谢物，或生产某些有机化合物等。

◆园艺：美化生活等，如蓝玫瑰等。

◆科学研究：生物学、遗传学等多领域基础研究等。

1 实验背景怎样将外源基因转入植物？间接转化法(载体介导)病毒介导法农杆菌介导法（双子叶/单子叶）种质系统介导法胚囊和子房注射法生殖细胞侵染法花粉管通道法直接转化法物理法化学法基因枪法(单子叶植物)显微注射法电击法超声波法PEG 法脂质体法1 实验背景各种转基因方法的区别是什么？（引自崔广荣，2003）1 实验背景针对不同植物，怎样选择转基因方法？目前转基因植株中，约80%以上通过“农杆菌介导转化法”获得。

植株特点首选方法备注对农杆菌敏感农杆菌介导法效率高，方法成熟，转基因植株遗传稳定。

原生质体培养容易直接转化法（如PEG 法）转化率高，可克服转基因植株嵌合体的难题。

多胚珠花粉管通道法提高转化率子房中有较大单胚珠植物(如核果类)显微注射法提高转化率转化难度大的植物基因枪法其它方法不可行时的备选放射性农杆菌发根农杆菌Agrobacterium rhizogenes根瘤农杆菌Agrobacterium tumefaciens旋钩子农杆菌1 实验背景农杆菌为什么能够介导基因转入植物？土壤农杆菌革兰氏阴性菌RiTi 质粒(tumor inducing plasmid ）约150~200 kb向植物细胞传递外源基因Ti1 实验背景农杆菌为什么能够介导基因转入植物？Vir 区:毒性区，包含多个致病基因，能激活T-DNA 的加工、剪切、复制及转入植物细胞，并使农杆菌表现出毒性。

农杆菌介导甘蓝转化实验摘要：农杆菌是一种革兰氏阴性细菌，能在自然条件下趋化性地感染大多数双子叶植物和裸子植物的受伤部位，将外源DNA导入受体。

本实验主要材料是中甘十一号甘蓝种子。

该品种早熟丰产，冬性较强，并且早熟，适于我国华北、东北、西北及华南、中南、西南、华东等部分地区。

用中甘十一号甘蓝种子发芽，接入MS培养基制成无菌苗，超净工作台下取下胚轴和带柄子叶，接入脱分化培养基获得外植体。

再利用LB固体培养基做平板划线培养农杆菌，挑取单菌落在LB液体培养基培养至OD：0.3-0.6。

将外植体在30ml加入了3ml农杆菌的MS0培养基浸泡，完成转导。

接回原培养基，7天后移入含500mg/L头孢霉素的抑菌培养基。

一星期后进行继代培养，接入300mg/L头孢霉素培养基，再进行结果检测。

Abstract: Agrobacterium is a gram-negative bacteria, in the natural conditions become injured parts of infection most dicots and gymnosperms, exogenous DNA into receptor. The main material of this experiment is in the sweet eleven cabbage seeds. The variety of the early harvest, winter is strong, and premature, suitable for parts of North China, northeast, northwest and southwest, South, Southern China, East china. No. eleven seed germination of cabbage sweet use, access to MS medium made of aseptic seedlings, ultra-clean table from hypocotyl and cotyledon with petiole explants dedifferentiation, gain access medium. Then using LB solid medium plate streaking cultivation of Agrobacterium, taking one colony culture medium to OD:0.3-0.6 in liquid LB. The explants in 30ml joined the 3ml of Agrobacterium tumefaciens MS0 medium soaking, complete transduction. Back to the original medium, 7 days into the trichostatin 500mg\/L containing Cephalosporium medium. A week after the subculture, access 300mg\/L cefotaxime medium, then the test results.关键词：甘蓝转基因外植体前言：甘蓝近年来随着国内周年供应需求及出口贸易的增加，出于甘蓝产业发展的需要，甘蓝遗传育种的重要性日益凸显，对遗传育种目标提出许多新的要求。

农杆菌介导的植物转基因技术
农杆菌介导的植物转基因技术（Agrobacterium-mediated plant transformation）是一种常用的植物遗传转化技术。

该技术利用农杆菌（Agrobacterium tumefaciens）作为载体，将外源基因
导入目标植物细胞，使其产生转基因植物。

农杆菌天然具有植物细胞转化的能力。

当农杆菌感染植物时，其携带的质粒（T质粒）能够在植物细胞中插入外源基因，并
将其转化为转座子形式，随后将其整合入宿主植物基因组中。

转座子通常包含目标基因、转座酶和调控序列，它们共同确保外源基因正确表达。

T质粒还携带有自身所需的发育激素和植
物生长调节物质，以维持转化后细胞的生存和分裂。

农杆菌介导的植物转基因技术具有许多优点。

首先，它可以用于许多不同植物物种的基因转化。

其次，该技术可以实现整株或局部的基因转化，包括细胞、组织、器官或整个植株。

此外，农杆菌介导的转基因技术可实现稳定遗传转化，外源基因可以遗传到植物后代中。

最后，该技术对植物基因组中的特定位点插入外源基因，使得外源基因可以与内源基因进行正常结合。

随着转基因技术的不断发展，农杆菌介导的植物转基因技术仍然广泛应用于研究和农业生产领域。

它为植物功能研究、抗病虫害、提高产量和改善品质等方面提供了有效手段。

然而，农杆菌介导的转基因技术也面临着一些挑战，如转化效率低、插入位点随机性以及响应植物抗性等问题。

因此，研究人员不断探索新的转基因技术和改进农杆菌介导的植物转基因技术的方法，以改善转基因植物的性状和应用。

农杆菌转化法及转基因植物检测方法摘要：近年来，植物基因工程技术飞速发展，转基因植物在很多领域的研究推广取得了令人瞩目的成绩。

植物基因工程中常用的转化方法一般是通过土壤农杆菌系统、植物病毒系统和DNA直接导入法这三种方法进行。

另外，转基因技术快速发展的同时转基因植物检测技术也在不断地进歩和完善，目前被广泛应用的转基因植物检测方法有三类：整合水平上的检测、转录水平上的检测和表达水平上的检测。

本文着重对农杆菌介导的植物转化方法和转基因植物的检测两方面进行综述。

关键词：农杆菌，转化，转基因植物，检测方法伴随着生命科学的飞速发展，植物组织培养技术以及植物组织分化、植物基因重组等技术发展迅速并得到广泛应用。

1984年转基因烟草的诞生[1]，使外源基因导入植物细胞从而获得转基因新品种的设想成为现实。

随后，转基因技术被广泛应用于各个方面如：植物新品种的改良、植物性状改良、植物抗性的提高以及植物基因功能的研究等[2-4]。

新型转基因大豆、转基因番茄及转基因玉米等转基因新品种陆续面世[5]。

植物转基因技术不但能够打破植物的物种界限，还能够使物种基因彼此进行交流。

使植物育种年限缩短，植物育种进程加快，植物抗性也在一定程度上得到很大提高，使来自于不同生物种类的优良目的基因导入植物并得到优良植物新品种。

同时，运用转基因技术研究植物自身基因结构组成及其基因功能调控等方面也取得了一定成果；运用转基因技术还研制出生物反应器和雄性不育系[6]。

目前，利用转基因技术将目的基因导入植物基因组中的常用方法主要有：土壤农杆菌介导的基因转化、DNA直接导入和植物病毒系统介导法。

本文着重介绍土壤农杆菌介导的目的基因转化法，同时也对目前转基因植物的检测进行适当总结。

1 土壤农杆菌介导系统的种类土壤农杆菌中的发根农杆菌和根癌农杆菌能够侵染植物伤口并形成与土壤农杆菌中大质粒有关的植物肿瘤和冠瘿。

能够诱发此类肿瘤的根瘤农杆菌中常常带有分子量为200-250kb的Ti质粒。

实验三根癌农杆菌介导的植物遗传转化一实验目的了解植物遗传转化的方法和理论掌握根癌农杆菌介导的遗传转化技术二原理植物遗传转化技术是指通过物理的，化学的或生物学的方法，将外源的基因导入受体植物细胞中获得再生植株的转基因技术。

自1983转基因植物问世以来，至今不到20年时间里，植物转基因技术发展迅速，除了占指导地位，运用最为广泛的农杆菌介导法，还发展了10多种转基因方法，如物理方面的基因枪法，电激法，显微注射法，超声波法，激光微束法，炭化硅纤维介导法，电泳法等；化学方面PEG介导转化，脂质体介导转化；生物学方面的种质系统法如花粉介导法，花粉管通道法等。

农杆菌介导法土壤农杆菌（Agrobacterium）是一种革兰氏阳性菌，有两个种与植物转基因有关，即根癌农杆菌（Agrobacterium Tumefaciens）和发根农杆菌（Agrobacterium Rhizogenes）.它们在自然状态下具有趋化性地感染大多数双子叶植物的受伤部位，并诱导产生冠缨瘤或发状根，在离体条件下，可以在不加任何生长素的培养基中持续生长，研究表明根癌农杆菌和发根农杆菌细胞中分别含有Ti 和Ri质粒,上面有一段T-DNA区，可以通过一系列过程进入植物细胞并将这一段T-DN插入到植物基因组中，这是农杆菌侵染植物后产生冠缨瘤或发状根的根本原因，因此农杆菌是一种天然的植物遗传转化体系，人们可将所构建的目的基因插入到去除了致瘤基因的Ti(Ri)质粒的T-DNA区，借助农杆菌侵染受体植物细胞后T-DNA向植物基因组的高频转移和整合特性，实现目的基因对受体植物细胞的转化，然后通过植物细胞合和组织培养技术，利用植物细胞的全能性获得转基因再生植株。

农杆菌介导法转基因技术的关键是T-DNA整合受体植物基因组的过程，这一过程依赖与Ti质粒上的T-DNA区，和Vir区各种基因的表达以及一系列蛋白质和核酸的相互作用。

简略地说。

其过程是：植物细胞在受伤后细胞壁破裂，分泌高浓度的创伤诱导分子，它们是一些酚类化合物，如乙酰丁香酮（acetosyringone,AS）和羟基乙酰丁香酮（hydroxy- acetosyringone,OH-As）农杆菌对这类物质具有趋化性，首先在植物细胞表面发生贴壁，继而植物创伤分子诱导农杆菌Vir区各种基因的激活和表达。

·29·所谓的转基因技术实际上是DNA 技术的重组方式，从外源克隆到的优良基因直接地注入到植物体的基因组织当中来，对作物的遗传性特征进行改变，使其向着人类更加向往的发展方向。

转基因技术自从问世以来实现了非常快速的发展，目前全球种植转基因的作物越来越多。

农杆菌介导是转基因技术之一，其在水稻转基因当中的应用，采取的是外源基因转化的方式，使外源基因的转化更具更正性，降其为稳定性等，进而实现大片段的基因转换等。

近年来水稻转基因技术不断地发展，并取得了相当大的成效，其中农杆菌介导水稻转基因技术发胡了重要的作用，以下降低基本的原理以及运用情况进行重点分析。

1.基本原理农杆菌介导是一种天热性的基因转化系统。

在具体的划分过程中可以分诶根瘤农杆菌和发根农杆菌。

首先，根瘤农杆菌当中有一种肿瘤诱导颗粒，这种颗粒具有可转移性的DNA 以及毒性区和冠瘿碱代谢基因。

在T -DNA 的两端是在两个数为25bp 的重复性序列，分别位于左右两个边界当中，两个边界的序列之间又是生长素和细胞分裂素合成的共性基因以及冠瘿碱合成性基因。

不同的区域内存在多个基因段，每一个基因段当中又有非常多基因。

一旦植物出现被伤害的情况，就会分泌出具有酚类化合物的一种汁液，此种汁液是通过染色体的毒性基因等介导㢟进行传输的，从而使农杆菌可以向只的其他部位上进行移动，并附着在其表面之上。

在T -DNA的转移上两个边界序列与之关系非常密切，特别是右侧的边界对于T -DNA 的精准转移是必不可少的重要条件，而且在边界序列之间也存在着一定的基因，但这些基因对于T -DNA 的转移并不发生太大的影响。

因此，T -DNA 区域的基因是可以采取外源性基金进行替代的，之后再利用农杆菌将已经改造后的T -DNA 转移到植物的基因组织当中，进而获取到转基因的植株。

伴随着科学技术水平的不断提升，农杆菌转化也进入到了非常关键的阶段，人们对此进行了多次地改造，并使其载体不断地创新与完善，转化的效率不断地提升，这样应用的范围也会越来越广泛。

植物生物技术中的基因转导技术基因转导技术在植物生物技术中具有重要的应用价值。

通过基因转导技术，我们可以在植物体内引入外源基因或调控内源基因的表达，进而实现对植物性状的改良和提高，促进作物产量、品质的提升。

本文将对基因转导技术在植物生物技术中的原理、应用及挑战进行探讨。

一、基因转导技术的原理基因转导技术是通过介导物质将目标基因送入靶细胞中，使其被转录和翻译为蛋白质。

目前常用的基因转导技术主要包括农杆菌介导的转化、基因枪法和冷冻处理法。

1. 农杆菌介导的转化农杆菌介导的转化是目前最常用的基因转导方法之一。

通过将目标基因导入农杆菌中，利用农杆菌与植物细胞发生共生关系的特点，使农杆菌将目标基因传递给植物细胞。

这种方法适用于一些易感植物，因其易操作、高转化效率而被广泛应用于植物遗传转化领域。

2. 基因枪法基因枪法是一种将DNA微粒载体通过高压射击的方式导入植物细胞的方法。

通过将目标基因包裹在微粒载体上，并在射击中将微粒载体射入植物细胞内，使目标基因被植物细胞摄取。

这种方法适用于不易进行农杆菌介导转化的植物，可以克服芽体发生的障碍，对于某些作物品种遗传转化也有较高的效率。

3. 冷冻处理法冷冻处理法是一种通过植物细胞的质膜和细胞壁的物理破坏，使目标基因进入植物细胞的方法。

通过在目标基因解冻后迅速与植物细胞接触，利用渗透压和温度梯度等因素，使目标基因进入植物细胞中。

这种方法适用于不易进行农杆菌介导转化的植物，操作简便，但转化效率较低。

二、基因转导技术在植物生物技术中的应用基因转导技术在植物生物技术中具有广泛的应用前景，主要体现在以下几个方面：1. 抗病虫害基因的导入通过基因转导技术，我们可以将植物抗病虫害的基因导入到感病的作物中，使其获得抗病虫害的能力。

比如将Bt（Bacillus thuringiensis）基因导入到作物中，使其产生杀虫蛋白，从而提高作物对害虫的抗性。

这一技术的应用不仅可以减少农药的使用，降低环境污染，还可以提高作物的产量和品质。

农杆菌介导的植物转基因技术一、实验目的1 了解低温离心机、恒温振荡培养箱、超净工作台等仪器的使用。

2学习真核生物的转基因技术及农杆菌介导的转化原理；掌握农杆菌介导转化植物的实验方法，了解转基因技术的操作流程。

二、实验原理农杆菌是普遍存在于土壤中的一种革兰氏阴性细菌，它能在自然条件下趋化性地感染大多数双子叶植物的受伤部位，并诱导产生冠瘿瘤。

农杆菌通过侵染植物伤口进入细胞后，可将T-DNA插入到植物基因组中。

因此，农杆菌是一种天然的植物遗传转化体系。

人们将目的基因插入到经过改造的丁-DNA区，借助农杆菌的感染实现外源基因向植物细胞的转移与整合，然后通过细胞和组织培养技术，再生出转基因植株。

实验一培养基配制一、仪器和试剂1、仪器：高压灭菌锅，超净工作台2、药品：Beef extract （牛肉浸膏）5g/L，Yeast extract （酵母提取物）1g/L， Peptone （蛋白胨）5g/L，Sucrose （蔗糖）5g/L，100ml，Agar （琼脂）100ml， MS粉，有机溶液，肌醇，Fe盐，NAA （萘乙酸），6-BA（6-苄氨基腺嘌吟），卡那霉素（kan），利福平（"「，链霉素（str）。

二、实验方法第一组配制YEB固体培养基1、配制250mlYEB固体培养基：先称取Beef extract （牛肉浸膏）；Peptone （蛋白胨）；Yeast extract （酵母提取物）；Sucrose （蔗糖）；1g ；琼脂粉；将上述药品置于250ml三角瓶中，用量筒称取200ml蒸馏水将其溶解混匀，然后再定容至250ml,用NaOH调pH=。

2、灭菌：将盛有250ml培养基的三角瓶封口，在三角瓶表面写清培养基名称，用高压灭菌锅进行灭菌。

3、抗生素的加入：高压灭菌后，待培养基温度降到50-60℃时（手可触摸）加入已经过滤好的抗生素（100ug/ml kan+50Dg/ml Str+50ug/ml rif）,以免温度过高导致抗生素失效。