凝集和沉淀反应(第四版)2013

凝集反应
中国医科大学附属一院 检验科
目的与要求
1．熟悉凝集反应的概念、特点和类型 2．掌握各凝集反应的基本原理及临床应用
什么是凝集反应？
概念：细菌和红细胞等颗粒性抗原或表面包 被抗原的颗粒性载体与相应的抗体结合后，可 出现肉眼可见的凝集现象。 优点：灵敏度高，方法简便 三要素： 颗粒性抗原或致敏颗粒 相应抗体 适量电解质
沉淀反应（precipitation reaction)
目的与要求
1．掌握单向扩散试验（平板法）、双向扩散试验（平板 法）的基本原理及临床应用 2．熟悉沉淀反应的概念、絮状沉淀试验的基本原理、免 疫浊度测定基本原理 3．了解单向及双向扩散试验的试管法、环状沉淀试验
沉淀反应的认识发展
1897年 Kraus 就发现细菌培养液（毒素）与相应 抗血清混合出现沉淀 1905年 Bechhold 把抗体放在明胶中，将抗原加于 其中，发现沉淀反应可在凝胶中进行 1946年 Oudin 报告了试管免疫扩散技术 1965年 Mancini 提出单向免疫扩散技术，使定性 免疫试验向定量化发展 免疫浊度法的出现，使沉淀反应达到快速、 微量、自动化的新阶段。
OX19 流行性斑疹伤寒 恙虫病 洛矶山斑疹热 Q热 +++ ＋＋＋或 -
OX2 + ＋＋＋或 -
OXk +++或+ -
第三节 间接凝集反应

间接凝集试验：可溶性抗原(或 抗体）先吸附于适当 大小的载体表面，再与相应抗体（或抗原）作用，在 适宜电解质的参与下，出现的特异性凝集现象。
用于各种抗体和可溶性抗原的检测，敏感度高于沉淀 反应

载体种类


红细胞(O型红细胞、SRBC)吸附多糖抗原较好、 聚苯乙烯胶乳颗粒，明胶颗粒、活性炭、 火棉胶等。
二、间接凝集技术类型
根据致敏用的是抗原或抗体分为： 正向间接凝集试验（indirect agglutination test) 反向间接凝集试验(reverse indirect agglutination test) 根据载体选用明胶颗粒或红细胞分为： 乳胶间接凝集试验 间接血凝试验 根据反应方式分为： 间接凝集试验 间接凝集抑制试验 (indirect agglutination inhibition test) 协同凝集试验
抗原稀释法原理
絮 状 沉 淀 示意 图
Ag
各管抗原倍比稀释 加入抗血清
1: 2
A b Ag
1:4 1:8 1:16 1:32 1:64 1:128
各管抗体量不变
振摇 混匀、37℃孵育
沉淀量不同
轻摇
抗原过剩 最适比例管 抗体过剩
2. 抗体稀释法 本法采用抗原量恒定与不同倍比稀释度的抗体 反应，出现沉淀物最多的管为抗体最适比例管。 3. 方阵滴定法 抗原和抗体同时稀释，亦称棋盘(checkerboard) 滴定法，是前二法的结合，可一次完成抗原和抗 体的滴定并找出抗原、抗体的最适比。
三、胶乳凝集试验
原理： 将可溶性抗原(或抗体）与胶乳结合后，直接与 待 测标本中相应抗体（或抗原）发生凝集反应。 方法评价： 1.胶乳颗粒的性能比 RBC稳定、均一性好
2.与抗原结合的能力及凝集性能不如RBC
技术要点：定性及半定量，敏感性不如血凝试验
四、明乳凝集试验
原理： 将全病毒抗原或重组抗原吸附于粉红色凝胶颗 粒，当致敏颗粒与样品血清作用时，若血清中有相应 抗体则形成肉眼可见凝集。
方法评价： 简单、快速、特异、不需特殊设备。
五、间接凝集试验的应用
1. 抗体的检测 ①检测细菌、病毒、寄生虫感染后产生的抗体 如沙门菌抗体，HBV抗体、血吸虫抗体、沙眼衣原体及支原体。 ②自身免疫病患者的抗体的检测 DNA抗体，甲状腺球蛋白抗体、抗核抗体、类风湿因子 ③变态反应患者的抗体的检测 青霉素抗体，花粉抗体 2. 抗原的检测 AFP、HBV、HCG 等 ，取决于临床对敏感度的要求
的抗原(或抗体) 进行中和。
二、间接血凝试验(被动血凝试验) （indirect hemagglutination test)
原理 将可溶性抗原(或抗体）吸附人的“O”型血 红细胞或绵羊或家兔的红细胞，制成致敏血 红细胞,与相应抗体（或抗原）作用，在适宜 电解质参与下，出现红细胞凝集现象。 技术要点：根据红细胞凝集程度判断反应强弱 方法评价： 应用广泛； 结果稳定； 成本低廉 应用：检测抗核抗体、类风湿因子
第四节 自身红细胞凝集试验
基本原理： 自身红细胞凝集试验与一般间接血凝试验不同 之处为反应中的红细胞是未经致敏的受检者新 鲜红细胞。 临床应用： HIV、HBsAg的检测。
第五节 抗球蛋白试验(Coombs试验)
Coombs 试验检测人红细胞不完全抗体的一种经典方法。 不完全抗体多为7SIgG抗体，能与抗原牢固结合，但一般不出现 可见反应，需要利用抗球蛋白抗体作为第二抗体起桥梁作用。 原理 把产生“不完全抗体”的机体正常血清球蛋白，注射到异种动物， 使其产生抗球蛋白。此种抗球蛋白加入表面结合有不完全抗体的 红细胞的复合物中，就能出现可见的凝集现象。 类型 1.直接法 检测红细胞上的不完全抗体 2.间接法 检测血清中游离的不完全抗体
（正向）间接凝集试验
特点：简单快速，敏感特异，成本低 举例：伤寒杆菌多糖抗原致敏绵羊红细胞检测伤寒抗体
反向间接凝集试验
特点：快速，敏感特异，成本低 举例：检测HBsAg，AFP
协同凝集试验


原理： SPA能与血清中的IgG类抗体的Fc段非特异性 结合，而两个Fab段暴露在葡萄球菌菌体表面，仍然 保持正常的抗体活性，与特异性抗原相遇时，能出现 特异的凝集现象。 临床应用： 微生物的快速诊断、定种及定型；以协助 传染病的早期诊断。
二、免疫浊度测定
70年代以来，根据抗原和抗体所在液相内快速 结合并产生浊度的原理，建立了免疫比浊法。 1.透射比浊法（transmission turbidimetry) 2.散射比浊法（nephelometry) ①速率散射比浊法(rate nephelometry) ②终点散射比浊法(endpoint nephelometry)
第一节、沉淀反应特点
可溶性抗原+相应抗体 （蛋白质，多糖） 肉眼可见的沉淀
第一阶段 抗原抗体特异性结合反应，可溶性小复合物， 几秒－几十秒 第二阶段 可见的大复合物，几十分钟－数小时
•沉淀反应:(precipitation) 可溶性抗原与相应抗体，在适宜条件下 发生结合，出现的沉淀现象。 •液相内沉淀试验：指抗原抗体在以生理盐水 或其它无机盐缓冲液为反应介质的液相内 自由接触，短时间可出现反应。 •凝胶内沉淀试验：指琼脂糖内扩散或凝胶内
方法评价 检测不必等到抗原抗体反 应达到平衡，大大节约反 应时间，每小时可检测数 十份标本；敏感度高，最 小检出量达μg/L水平。
2. 终点散射比浊法
方法评价 原理 让抗原抗体作用一定时间， 敏感度达mg/L水平，可自 动化，但反应时间较长 使其反应达到平衡后，测 定其复合物的量。复合物 的浊度不再受时间的影响， 但反应复合物聚合产生絮 状沉淀之前(大约反应数 十分钟)进行浊度测定。
• 是细菌或红细胞等颗 粒性抗原与相应抗体 在试管中直接凝集的 半定量试验。 • 多用以测定抗体
•方法评价：
test)
特异性易受条件影响 敏感性不高
•临床应用：
外斐试验、肥达试验
交叉配血试验
肥达试验
外斐反应

外斐反应是某些立克次体病的辅助诊断试验，为一种非特异性反应， 该试验用与立克次体有共同抗原的变形杆菌OX19、OX2、OXk代替 立克次体，进行凝集反应，来判断病人血清中有无立克次体抗体， 若凝集效价＞40，结合临床可考虑立克次体感染。
(二) 散射比浊法
原理 散射光系指一定波长的光沿水平轴照射，碰到小颗粒 的免疫复合物，光线被折射，发生偏转，这种偏转的 角度可因光线波长和颗粒大小不同而有所区别。散射 浊度法是在入射光的一定角度检测粒子发出的散射光， 散射光的强度与复合物的含量呈正比，即待测抗原越 多，形成复合物越多，散射光强度越强。又可分为速 率散射比浊法(rate nephelome-try)和终点散射比浊法 (endpoint nephelometry)。
一、玻片凝集试验(slide agglutination test)
原理：通常以已知抗体作为诊断 •技术要点 •方法评价： 特异性强、
血清，与待测颗粒抗原在有电解
质存在下，作用一定时间，通过 凝集与否，进行细菌或红细胞定 性（或定型）。
简便、快速
•临床应用
ABO血型鉴定
二、试管凝集试验(tube agglutination
(一) 透射比浊法
原理 抗原抗体在一定缓冲液 中形成免疫复合物(IC)， 当光线透过反应溶液时， 由于溶液内复合物粒子对 光线的反射和吸收，光线 倍吸收的量与免疫复合物 呈正相关，根据所测吸光 度的值推算待检抗原含量。 方法评价 敏感度高于单相琼脂扩散 试验5~10倍，批内、批间 重复性较好，变异系数 <10%，操作简便快速， 1h可报告结果。
第一节 凝集反应的特点与类型
凝集反应的发生分为两阶段： ①抗原抗体的特异结合； ②出现可见的颗粒凝集。 凝集反应是一个定性检测方法，也可半定量。 凝集反应分为：直接凝集反应 间接凝集反应
负离子强度∝ Z电位
+
Z电位 + + +
+
+
+ + + + -
+
+ + + + -
+ + +
-
-
-
促进凝集反应的因素
应用：新生儿溶血症、特发性自身免疫性贫血、自身免疫性贫血 和医源性溶血性疾病
应用：检测母体Rh抗体，以尽早发现和避免新生儿溶血症、红细胞不相容 性输血产生的血型抗体、分析红细胞表面不完全抗体的Ig亚类。
小结

Hale Waihona Puke Baidu
凝集反应的特点及未来发展趋势 直接凝集反应和间接凝集反应的异同 间接血凝实验的原理 不完全抗体 直接Coombs实验与间接Coombs实验原理和 应用
间接凝集试验比较
致敏颗粒 正向间接 凝集试验 反向间接 已知抗原 致敏载体 已知抗体 第二试剂 无 无 待测物 抗体 抗原 阳性结果 胶乳凝集 RBC凝集 胶乳凝集
凝集试验
间接凝集
致敏载体
已知抗原 致敏载体 抗体 抗原
RBC凝集
胶乳不凝集
抑制试验
（或抗体） （或抗原 ）
抗体
胶乳不凝集
阴性结果凝集
* 间接凝集抑制试验：需要先加入已知与致敏颗粒相同



适量的电解质，过高或过低离子强度对凝集反 应均有抑制作用 增加蛋白质，缩短颗粒间距 增加溶液粘滞度，如加入右旋糖酐或葡聚糖等 胰酶或神经氨酸酶处理，改变细胞表面结构 离心克服颗粒间排斥力
第二节 直接凝集反应
直接凝集试验：细菌、螺旋体、红细胞等颗粒性 抗原在适当电解质的参与下，直接与相应抗体 结合出现肉眼可见的凝集现象。 凝集原(agglutinogen)：凝集反应中的抗原。 凝集素(agglutinin)：凝集参与反应的抗体
扩散试验。
第二节、液体内沉淀试验
根据沉淀现象的不同，液体内沉淀又可分为三类：
絮状沉淀:(flocculation)
环状沉淀:(ring precipitation) 免疫浊度: (immunoturbidimetry)
一、絮状沉淀试验
原理
抗原溶液与相应抗体溶液混 合，在电解质存在的条件下， 抗原与抗体结合出现可见的絮 状沉淀。絮状沉淀易受抗原与 抗体比例的影响，由此可作为 最适比测定的基本方法。 方法评价 方法简单，设备要求低，敏感 度较低，受抗原抗体比例影响 非常明显，目前多用以测定抗 原抗体反应的最适比。 应用 曾用于测定梅毒抗体的Kahn试 验是絮状沉淀的代表试验，现 今已被更简便而敏感的USR或 RPR方法替代。
透射比浊法和散射比浊法光路
IC
透射比浊法 I
I0
当复合物＜3×106dal， I≈Iθ;θ＜90°，散射光 的量代表IC的量。
θ
检测器A
Iθ 检测器B
散射比浊法
1. 速率散射比浊法
原理 是一种抗原抗体结合动态测定法。 所谓速率是抗原抗体结合反应过 程中，在单位时间内两者结合的 速度。 速率法是测定最大反应速率，即 在抗原抗体反应达最高峰时，通 常为数十秒钟，测定其复合物形 成的量。 峰值的高低在抗体过量情况下与 抗原的量成正比。 峰值出现的时间与抗体的浓度及 其亲和力直接相关。 不同抗原含量其速率峰值不同， 通过微电脑处理，求出抗原含量。