临床检验免疫学沉淀反应、凝集反应

形成肉眼可见的大的免疫复合 物。沉淀线或沉淀环的观察以 及免疫比浊法中的终点法就是 测定此阶段形成的复合物
沉淀反应分类
液体内沉淀 试验
环絮免 状状疫 沉沉浊 淀淀度 试试测 验验定
凝胶内沉淀 试验
凝胶免疫电 泳技术
单双
向向
扩扩
散散
试 验
试验
对火免免
流 免
箭 免
疫
疫 固
疫 电 泳
疫 电 泳
电 泳
定 电 泳
第一节 沉淀反应
沉淀反应（precipitation）是 指可溶性抗原与相应抗体在适 当条件下发生特异性结合而出 现的沉淀现象,其特性与经典的 抗原抗体反应相同。
沉淀反应分两个阶段
第一阶段
抗原抗体特异性结合，快速但 不可见。免疫比浊法中的速率 法就是利用此阶段测定免疫复 合物形成的速率。
第二阶段
＋
＋＋ ＋＋ ＋＋ ＋＋＋ ＋＋
＋
－
1/40
－
±
＋
＋
＋＋ ＋＋＋ ＋＋
－
1/80
－
－
－
－
＋
＋
＋
－
凝胶内沉淀反应
可溶性抗原和相应抗体在凝胶中扩散， 形成浓度梯度，在抗原抗体相遇并且浓度 比例适当的位置形成肉眼可见的沉淀线或 沉淀环。
常用的凝胶有琼脂、琼脂糖、葡聚糖或 聚丙烯酰胺凝胶。
一、免疫扩散试验
Mancini曲线
T1为16～24h；T2为24～48h；T3为48h以上,可见 T3为直线，T1为反抛物线
Βιβλιοθήκη Baidu
Fahey曲线： K＝logC∕d 小分子抗原（IgG,IgA）
扩散时间24h 半对数坐标纸曲线
Fahey曲线
t1为16～24h；t2为24～48h；t3为48h以上 ,可见t1为直线，t3为反抛物线
对流免疫电泳
通电
蛋白质抗原常
－
带较强的负电 荷，在电场中
向正极移动
抗体球蛋白
带负电荷较少， 籍电渗作用向
＋
负极泳动
对流免疫电泳
结果分析： • 无沉淀线出现则表明
无相应的抗原。 • 沉淀线位于抗原抗体
孔中间，说明两者比 例较适合。 • 沉淀线偏向抗原孔一 方，表示抗体浓度＞ 抗原，反之，则是抗 体浓度＜抗原浓度。
火箭免疫电泳示意图
+
-
火箭免疫电泳图 ①②③④为标准抗原；⑤⑥为标本
三、免疫电泳
原理：区带电泳＋双向扩散 1、将蛋白质抗原在凝胶中电泳分成肉眼不可 见的若干区带 2、沿电泳方向挖一与之平行的抗体槽，加入 相应抗血清进行双向扩散 。
技术要点： 制备琼脂板，打孔，加样于孔内，电泳 2～3mA/cm ，0.5～1h后，槽内加入 相应抗血清作双向扩散。
4）在免疫球蛋白的测定中，有时出现结果与真实含量 不符，这是由于抗体相对过剩，使沉淀环直径变小；
5）抗原相对过剩时，会使沉淀环呈不相关的扩大，从 而造成某一成分的假性增加。
6）测定时必须同时加测质控血清，以保证测量准确性。
二、双向扩散试验 （平板法）
鉴定抗原抗体的最基本、最常见的方法之一
原理：将抗原抗体分别加在琼脂糖 不同的对应孔中，两者在凝胶中自 由扩散，在比例合适处形成白色沉 淀线。
抗原抗体反应 的高度特异性
电泳技术的高 分辨率、快速、 微量
一、对流免疫电泳
原理：双向扩散 + 电泳
比双向扩散试验灵 敏度提高8∼16倍
技术要点：制备1.2%巴比妥 琼脂凝胶板，在其上成对打 孔，孔径3mm，孔距6 mm， 于阴极侧孔内加待测血清， 阳性侧孔加抗血清，电泳条 件3～4mA/cm，30min～1h。
液体内沉淀反应
一.环状沉淀试验
又称环状试验。在小口径试管中先加入 已知抗血清，然后将待检抗原小心地加在血 清的表面，成为界面清晰的两层。数分钟后， 两界面交界处出现白色沉淀环，为阳性反应。
常用做抗原定性，如炭疽的诊断 （Ascoli氏试验）、鉴别血迹、媒 介昆虫的嗜血性等。
二、 絮状沉淀试验
•将抗原与相应抗体混合，在电解质存在的条 件下，抗原抗体结合形成肉眼可见的絮状沉淀 物。 •方法受抗原抗体比例的影响非常明显 •应用于测定抗原抗体反应的最适比例 (三种类型)
技术要点
1.2%巴比妥琼脂糖约55℃，加入适 量抗血清，混匀后制板，打孔，孔 内加待测样品，样品孔放负极侧， 6h后观察琼脂板上沉淀峰，绘制标 准曲线，求出待测样品浓度。
火箭免疫电泳
影响因素
1.琼脂（无电渗或电渗很小的）影响火箭形状不 规则。 2.电泳终点时间的确定。 3.标本数量多时应先通电后加样,防止宽底峰形. 4.IgG定量时，可用甲醛与IgG上的氨基结合 （甲酰化），抵消了电渗作用。
是指可溶性抗原、抗体在含有相 应电解质的凝胶内自由扩散， 二者相遇而发生特异性结合， 在比例适当处出现可见的沉淀。
（一）单向扩散试验（平板法）
倾注平板 打孔 加样 放置37℃ 观察沉淀环
单向扩散试验 （平板法）
Mancini曲线：K＝C∕d2 大分子抗原（IgM） 时间扩散＞48h， 普通坐标纸曲线
双向扩散试验应用（平板法）
1.抗原抗体存在与否以及相对含量的估计 2.抗原抗体相对分子量的估计
双向扩散试验应用（平板法）
3.抗原性质的分析
双向扩散试验应用（平板法）
4.抗体效价的滴定
5.抗原或抗体纯度 的鉴定
免疫电泳技术
免疫电泳技术
电泳分析 ＋ 沉淀反应
优点： 1.加快反应的速度。 2.提高了灵敏度。 3.增加了分辨率。
二、火箭免疫电泳
原理 单向免疫扩散＋电泳,定量检测技术
电泳时凝胶中抗体不移动，样品孔中的 抗原向正极泳动，随着抗原量的逐渐减 少，抗原泳动的基底区越来越窄，抗原 抗体分子复合物形成的沉淀线逐渐变窄， 形成一个形状如火箭的不溶性复合物沉 淀峰，抗体浓度固定时，峰的高度与抗 原量呈正相关。
火箭免疫电泳
絮状沉淀试验
抗原稀释法：抗原最适比例 抗体稀释法：抗体最适比例 方阵滴定法：抗原抗体最适比例
最适比方阵测定法
抗原稀释度
抗体 稀释度
1/10 1/20 1/40 1/80 1/160 1/320 1/640 对照
1/5
＋
＋＋ ＋＋＋ ＋＋＋ ＋＋
＋
±
－
1/10
＋
＋＋ ＋＋ ＋＋ ＋＋＋ ＋＋
＋
－
1/20
单向扩散试验 （平板法）
方法学评价 单向琼脂免疫扩散法操作简便，特异性强，
结果可靠，重复性好，敏感度稍差（不能 测μg/ml以下含量）。
注意：
1）抗血清不但要求亲和力强、特异性好、效价高，而 且还应注意存放的方法，防止效价下降；
2）标准曲线测定必须同时制作，决不可一次做成，长 期应用；
3）有时出现双环现象，这是由于出现了不同扩散率、 但抗原性相同的两个组分。例如α重链病；