实验二抗体制备和凝集反应沉淀反应PPT参考课件

第五章 凝集反应和沉淀反应 （P37）
凝集反应 (agglutination reaction)
概念：
细菌、细胞等颗粒性抗原悬液加 入相应抗体，在电解质存在下，两者 特异性结合，出现肉眼可见的凝集现 象。
Ag 凝集原 agglutinogen Ab 凝集素 agglutinin
颗粒性抗原： 凝集反应
原理：将已知抗体吸附于颗粒性载体 上，检测未知抗原
反向间接血凝试验结果判定
3.间接凝集抑制反应
方法：
待测样本（可溶性Ag？）+已知Ab
→ +已知致敏Ag颗粒（已成为颗粒性 Ag） → 观察是否有凝集现象
凝集为阴性，说明标本中无相应Ag; 不凝集为阳性，说明标本中有相应Ag
如： 用胶乳凝集抑制试验检测尿液 中绒毛膜促性腺激素（HCG）
体液免疫测定种类及敏感度
反应名称 抗原 结果 敏感度（m g/ml)
直接凝集 颗粒 凝集
0.5~1.0
间接凝集 抗原 现象
0.001~0.003
环沉
20~30
双扩
可溶 沉淀
3~5
单扩
抗原 现象
12~110
放射扩散
3~10
免疫电泳
50~200
思考题：
1.玻片凝集试验和试管凝集试验的区 别
2.反向间接凝集试验、间接凝集抑制 试验的原理及实例
协同凝集试验
协同凝集试验实际是用已知 抗体检测未知抗原，可用于的 细菌、病毒的直接检测
5 明胶凝集试验（gelatin-gglutination ,GAT)
属正向间接凝集反应 方法：
粉红色明胶颗粒吸附病毒抗原（称为致敏 Ag颗粒）+待测血清→观察有无凝集现象。 凝集为阳性，说明血清中含相应的病毒Ab; 不凝集为阴性，说明无相应Ab。 用途：常用于抗HIV-1抗体及抗精子抗体的 检测

注意2：看并列词组同它相关的句子成分搭 配是否完全恰当。
一.“和”字（3）
1、通过检查，大家讨论、发现、解决了课外活动 中的一些问题。
2、产品要赢得消费者的喜爱，厂家必须在售后、 生产、销售等各个环节下足功夫，真正为消费者 着想。
3、人生价值和意义，其实并不在于别人对自己 如何膜拜、崇敬、羡慕，而在于自己对社会，对 历史的进步和发展作出何种贡献。
高考真题
（13江西）B.教育主管部门要求，各级各类学校学生的生 活用品以及床上用品都应由学生自主选购，不得统一配备。
（13四川）D.2013年财富全球论坛是成都自改革开放以 来举办的具有里程碑意义的国际盛会，是成都推进和发展 国际化建设进程面临的重大历史性机遇。
（13辽宁）A. 第二十五届阿姆斯特丹国际记录片电影节 12天里吸引了20多万名观众，来自40多个国家的近2500 名电影人、300多部电影前来参与。
注意3：看并列词组内部的逻辑顺序是否恰 当。
一.“和”字（4）
1.他背着总经理和副总经理偷偷地把这笔钱分别 存入了两家银行。 2.这次外出比赛，我一定说服老师和你一起去， 这样你就不会太紧张了，可以发挥得更好。 3.因患病住院，83岁高龄的黄昆和正在美国的姚 明没能到场领奖。
注意4：出现并列的多个人或物时，看是否 有歧义
A
+抗A血清
+抗B血清
B
3.实验方法
（3）手持玻片，前后左右轻轻转动，促 其充分混匀。
A
B
不凝集（-） 凝集（+）
•如混合液由均匀红色混浊状逐渐变为透明，并出现大小不 等的红色凝集块者，即为红细胞凝集；如混合液仍呈均匀 混浊状，则为不凝集。
4.实验结果
记录受检者红细胞凝集情况，根据 ABO血型鉴定表，判断受检者的血型。

是指细菌、螺旋体和红细胞等颗 粒性抗原，在适当电解质参与下可直 接与相应抗体结合出现肉眼可见的凝 集。反响中的抗原称为凝集原，参与 反响的抗体称为凝集素。
二、间接凝集反响
将的可溶性抗原〔或抗体〕吸附或耦联 到与免疫无关的载体颗粒外表,形成致敏颗粒, 再与相应抗体〔或抗原〕作用,在适宜的电解 质存在的条件下，出现肉眼所见的凝集现象， 称之。
A、正向：诊断试剂为抗原致 敏的载体颗粒及相应抗体，用 于检测标本中是否存在与致敏 抗原一样的抗原。
第一种情况：
(标本)
结果：免疫微球不凝集为阳性
第二种情况：
标本 中无 抗原
结果：免疫微球凝集为阴性
3间接凝集抑制反响
B、反向：诊断试剂为抗体致敏的 载体颗粒及相应抗原，用于检测标 本中是否存在与致敏抗体一样的抗 体。
凝集反响
是指颗粒性抗原(红细胞、细菌等)或可 溶性抗原〔或抗体〕与载体颗粒结合 成致敏颗粒后与相应抗体〔或抗原〕 发生特异性结合，在适当电解质存在 下，形成肉眼可见的凝集现象。
在免疫学技术中，凝集反响可分为 直接凝集反响和间接凝集反响两大类 。
凝集反响的类型 一、直接凝集反响(direct agglutination)
非特异性类脂抗体测定
1、性病研究实验室试验〔VDRL〕 2、不加热血清反响素试验〔USR〕 3、快速血浆反响素试验 〔RPR〕 4、甲苯胺红试验〔TRUST〕
特异性梅毒血清学试验
梅毒螺旋体抗原血清试验：用梅毒螺旋体作为抗 原检测血清中的抗螺旋体IgM和/或IgG抗体，其 敏感性和特异性均高于非梅毒螺旋体抗原血清试 验，但不能用作疗效观察的指标。
• 梅毒快速血浆反响素试验 • Rapid Plasma Reagin 〔RPR〕 • RPR试验

以பைடு நூலகம்盐缓冲液为反应介质的抗原抗体特异 性结合的沉淀试验。
环状沉淀 絮状沉淀 免疫浊度测定
絮状沉淀试验(flocculation)
【原理】将抗原溶液与相应抗体溶液混合,在 电解质存在的条件下,抗原与抗体结合出现可 见的絮状沉淀。
【应用】测定抗原抗体反应的最适比。
【方法】 1、抗原稀释法:抗原最适比例 2、抗体稀释法:抗体最适比例 3、方阵滴定法:抗原抗体最适比例
logC/d ＝K
Mancini曲线
Fahey曲线
T1为16～24h；T2为24～48h；T3为 48h以上,可见T3为直线，T1为反抛物 线
t1为 16～ 24h；t2为24～48h；t3为 48h以上,可见t1为直线，t3为反抛物线
已知含量的Ag标 准品
Fahey曲线的绘制
Fahey曲线,使用半 对数纸画曲线,浓 度的对数与沉淀环
(2)试管凝集试验 半定量试验
在微生物学检验中常用已知细菌 作为抗原液与一系列稀释的受检血清 混合,保温后观察每管内抗原凝集程 度,通常以产生明显凝集现象的最高 稀释度作为血清中抗体的效价,亦称 为滴度。
(2)试管凝集试验 半定量试验
方法: 1)倍比稀释待检血清:
0、5ml 0、5ml 0、5ml
• 沉淀线偏向抗原孔一方, 表示抗体浓度＞抗原,反 之,则是抗体浓度＜抗原 浓度。
【 CIEP方法评价】
(1)简便、快速、敏感度较双扩提高8～16倍,可测蛋 白质浓度达 ug/ml。
(2)要求抗原、抗体比例严格,尽估计使用高效价免疫 血清,必要时对待检样品采纳不同稀释度
(3)不适宜抗原抗体都是球蛋白的检测 。 (4)由于电渗的缘故,目前已不推荐使用。
抗球蛋白参与的间接血凝试验 (Coombs试验)

凝集反应
第一课件网网站
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一、凝集反应的概念及特点
定义：细菌，螺旋体，红细胞等颗粒性 抗 原,或可溶性抗原（或抗体）与载体颗粒结合 成致敏颗粒后，它们与相应抗体（或抗原） 发生特异结合，在适当电解质存在下，形成 肉眼可见的凝集现象，称为凝集反应 （agglutination)。 反应的两个阶段：1）抗原抗体的特异性结合 阶段，2）出现肉眼可见的凝集现象。
直接Coombs试验 检测红细胞上的不完全抗体
间接Coombs试验 检测游离在血清中的不完全抗体
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特点：抗原抗体反应既可以在体内作为 体液免疫应答的效应机制自然发生，也 可以在体外作为免疫学试验的结果而出 现，体外实验的抗原抗体反应称为血清 学反应（serological reaction).
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二.直接凝集反应
定义：细菌、红细胞等颗粒性抗原在适量电解 质的参与下，直接与相应抗体结合，出现肉眼 可见的凝集现象，该反应中的抗原称为凝集原 （agglutinatinogen)，抗体称为凝集素 （ agglutinin)。 一）玻片凝集试验（ABO血型鉴定）；二） 试管凝集试验（肥达试验）。
缘皱缩成花边状
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自身红细胞凝集试验

免疫学实验课沉淀反应
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;两者相遇时在比例合适处形成沉淀线。
抗体
抗原
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免疫学实验课沉淀反应
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双向琼脂扩散试验 免疫学实验课沉淀反应
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(3)对流免疫电泳检测血清中AFP
• 1、3孔加抗AFP抗 体
+
1
• 2孔，AFP阳性对照
3
血清
• 4孔，待检血清
pH 8.6巴比妥缓冲液
免疫学实验课沉淀反应
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免疫学实验课沉淀反应
实验室规则－要点
❖ 实验室安全－门窗、水、电、火源
实验结束后关闭门窗、水、电、火源 酒精灯和易燃物的使用注意事项；棉塞着火须报
告老师 电源－空气开关 水的使用
❖ 实验室安全－生物安全
白大褂的穿着要求
不得将实验无关物品带入实验室
不得在实验室内饮食
不得擅自开UV灯
污染及潜在污染物品须进行消毒处理
免疫学实验课沉淀反应
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沉淀反应:
可溶性抗原（血清蛋白质、细胞裂解液、组织浸液、微生
物蛋白等）与相应抗体，在一定的抗原抗体比例下，在一定离 子浓度的缓冲体系中，发生结合后出现沉淀物称沉淀反应。
沉淀原，沉淀素。
环状法、絮状法、琼脂扩散法
类型：
★单向免疫扩散 ★双向免疫扩散 ★对流免疫电泳
★免疫比浊法
免疫学实验课沉淀反应
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电场力
Ab
pI～7.5
电
Ag
pI～4.8
琼脂糖：在pH8.6的缓冲液中带负电 与琼脂糖接触的可移动液体：带正电
免疫学实验课沉淀反应
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对流免疫电泳 免疫学实验课沉淀反应

一、单向琼脂扩散试验 （平板法）
抗体与待测的抗原,在两者比例合适的部位结合形 成沉淀环。环的大小与抗原的浓度成正相关。
本法稳定、简便、无需仪器设备。重复性和线性 均可信，但灵敏度稍差、耗时长、影响因素多。
单向免疫扩散试验
二、双向琼脂扩散试验 （平板法）
将抗原抗体分别加在琼脂糖凝胶不同的对应孔 中，两者在凝胶中自由扩散，在比例合适处形成白 色沉淀线。沉淀线的位置、形状以及对比关系，可 进行定性分析，如抗原或抗体的存在与否、相对含 量估计、相对分子量分析和性质分析。
方法评价：简便快速，只能定性。
二、絮状沉淀试验
原理：抗原溶液与相应抗体溶液混合，在电解质 存在的条件下，抗原与抗体结合出现可见的絮状 沉淀。由此可作为最适比测定的基本方法。
技术要点：
抗原稀释法
抗体稀释法
方阵滴定法
方法评价：简单、不需特殊设备，敏感度较低， 受抗原抗体比例影响非常明显。常用于滴定抗原 抗体反应的最适比例。
沉淀反应
前言
• 沉淀反应（precipitation )
•
可溶性抗原与相应抗体发生特异性结合，在适
当条件下而出现的沉淀现象。
•
沉淀反应分类
1.液相内沉淀试验 环状沉淀反应、絮状沉淀反应、 免疫比浊度分析。
2.凝胶内沉淀试验 单向琼脂扩散试验、双向琼脂 扩散试验。
3.凝胶免疫电泳技术 对流电泳技术、免疫电泳技 术、火箭电泳技术、免疫固定电泳技术。
三、免疫比浊度分析
根据抗原抗体在体内快速结合的原理
透射免疫比浊法
（turbidimetric immunoassay）
散射免疫比浊法
（nephelometry immunoassay）

类风湿因子的检测
Normal serum
Patient’s serum
ቤተ መጻሕፍቲ ባይዱ
Macroscopic agglutination of latex(乳胶颗粒) coated with human IgG serum from a patient with rheumatoid arthritis.
梅毒快速血清反应素RPR试验
1、4孔加AFP阳性对照 2、3、5、6孔加待检血清
3. 置于湿盒，37C 24h
•结果下周观察
学号
1
6
2
5
3
4
抗AFP抗体
对流免疫电泳检测血清中AFP
• 1、3孔加抗AFP抗体
+
• 2孔，AFP阳性对照血清
1
• 4孔，待检血清
3
pH 8.6巴比妥缓冲液
2
-
4
第2次 凝集反应与沉淀反应
1. 试管凝集（操作） 2. 双向扩散（操作）、对流免疫电泳（示教） 3. 抽血（每组一人，下次实验用）
• 肥达反应结果（观察结果注意：勿摇；先看对照管）
- 不凝集 + 小部分凝集，管底小量凝集，上层液体较混浊 ++ 部分凝集，管底部分凝集，上层液体微混浊 +++ 大部分凝集，凝块非全部下沉于管底而是稍有铺开，上层液体澄清 ++++ 完全凝集，管底有边缘不整齐的膜状凝集块，上层液体澄清透明。
沉淀反应 Precipitation Tests
RPR是心脂质（而不是密螺旋体的）梅 毒抗体试验，在疾病初期呈阳性。 将病人血清与炭联心脂质抗原试剂 混合，阳性血清显示凝集抗原颗粒。 (4分钟后观察颗粒凝集）

特性
抗原抗体反应具有特异性、可逆 性、比例性、阶段性等特点。
凝集反应的类型
直接凝集反应
间接凝集抑制反应
颗粒状抗原与相应抗体直接结合出现 的凝集现象。如玻片凝集试验、试管 凝集试验等。
在间接凝集反应的基础上，加入特异 性抗体，使原有的间接凝集现象受到 抑制。常用于测定激素、抗原等小分 子物质。
间接凝集反应
纳米技术
纳米技术与凝集反应的结合可以实现更精细的样本处理和检 测。纳米材料具有优异的物理化学性质，可以改善凝集反应 的条件和效果，为凝集反应的发展提供新的思路和方向。
THANKS
感谢您的观看
在最适pH值下，凝集反应的速 率和程度可能达到最大值。
pH值的改变可能影响分子的构 象和稳定性，从而影响凝集反 应的进行。
Part
04
凝集反应的实验操作与演示
实验前的准备
实验材料
试管、滴管、抗A血清、抗B血清、A型血、B型血、O型血等。
实验设备
显微镜、离心机、恒温水浴箱等。
实验试剂
生理盐水、洗涤液等。
细菌凝集试验可用于鉴定细菌种类、检测抗体水平以及诊断某些传染病 。
常见的细菌凝集试验包括伤寒沙门氏菌的肥达试验和副伤寒甲、乙的副 伤寒沙门氏菌的肥达试验等。
病毒凝集反应的实例
病毒凝集反应是指病毒颗粒与细胞表面 受体结合后，引起细胞聚集的现象。
病毒凝集反应可用于病毒的分离和鉴定 ，例如流感病毒的分离和鉴定。
准确性。
凝集反应的热力学
热力学研究反应的平衡常数、能 量变化和熵变等性质，对于理解 凝集反应的机理和性质非常重要
。
热力学参数如焓变、熵变和吉布 斯自由能变等可以描述反应的能
量变化和平衡状态。

免疫电泳试验
第1页，共11页。
实验原理
免疫电泳是一种将区带电泳和双向免疫扩散 相结合的免疫化学分析技术。
第2页，共11页。
实验原理
先将抗原样品在琼脂平板上进 行电泳，使其中的各种成分因 电泳迁移率的不同而被分离成 肉眼不可见的区带。
停止电泳后，在与电泳方向平 行的槽内加入相应抗血清，使 抗原和抗体呈双向扩散，已分 离的各抗原与相应抗体在琼脂 中扩散而相遇，在二者比例合 适处形成肉眼可见的沉淀弧。
双扩散 取出电泳后的琼脂板，挑出中间槽内的琼脂，取 100μι兔抗人全血清充满槽内，注意勿外溢。将琼脂板 放于湿盒内，水平置于37℃水浴箱中进行双扩散，24h 后观察结果。
第8页，共11页。
实验结果
观察沉淀弧的位置和条数，并画出沉淀弧。
第9页，共11页。
本卷须知
抗原与抗体浓度比例应适当，否则会使某些成分不出现沉淀线。 当蛋白质抗原浓度高于20g/L，应用缓冲液稀释后再进行电泳 和扩散。
第3页，共11页。
实验原理
根 进 及据行其沉 比 性淀 较 质弧 ， 。的 可数 分量 析、 、位 鉴置 定和 样形 品状 中与 所已 含知的标抗准原抗成原分 停在先加一6加制打浇0当 双0打扩停在打6将观抗停 在6粗双先一一0抗打打6加6先555巴 巴巴 巴 巴止二将样般样板孔板蛋扩孔散止二孔琼察原止二略扩将般般原孔孔样将mmm比比 比比比ooo电 者 抗 稳 挖 时 白散 挖 过 电 者 挖 脂 沉 与 电者 分 散 抗 稳 稳 与 及 挖 抗用用将用lll妥妥 妥妥妥///泳比原定槽要质 槽程泳比槽板淀抗泳 比析原定定抗开槽原LLL微微洁取取微缓缓 缓缓缓ppp后例样端时求抗 时中后例时放弧体后 例纯样端端体槽时样量量净出出量HHH冲冲 冲冲冲，合品电要厚原 要需，合要于的浓， 合化品电电浓，要品888进进玻电电进液液 液液液...在适在压求度浓 求要在适求湿位度在 适抗在压压度挑求在样样片泳泳样为为 为为为与处琼外均度 外在与处外盒置比与 处原琼比去外琼111器器置后后器电电 电电电000电形脂壁匀高 壁不电形壁内和例电 形或脂例孔壁脂000吸吸于的的吸泳泳 泳泳泳VVV泳成平整，于 整同泳成整，条应泳 成抗平应内整平取取水琼琼取， ， ，缓 缓缓 缓 缓方肉板齐无齐时方肉齐水数适方肉体板适的齐板2平脂脂111电电电0冲冲 冲冲冲000向眼上，气，间向眼，平，当向 眼的上当琼，上g台板板泳泳泳μμμ液液 液液液/Llll平可进防泡防进平可防置并，平 可纯进，脂防进稀稀稀面，，111，，， ，，，hhh行见行止。止行行见止于画否行 见度行否，止行释释释上挑挑，，，应将将 将将将的的电琼琼结的的琼出则的 的。电则槽琼电3的的的，出出即即即用加加 加加加7槽沉泳脂脂果槽沉脂沉会槽 沉泳会内脂泳℃正正正用中中可可可缓样样 样样样内淀，破破观内淀破淀使内 淀，使琼破，水常常常移间间终终终冲后后 后后后加弧使裂裂察加弧裂弧某加 弧使某脂裂使浴人人人液槽槽止止止液的的 的的的入。其。。，入。。。些入 。其些暂。其箱全全全管内内电电电稀琼琼 琼琼琼相中做相成相 中成不中中血血血吸的的泳泳泳释脂脂 脂脂脂应的好应分应 的分挑的进清清清取琼琼。 。 。后板板 板板板抗各记抗不抗 各不出各行于于于脂脂4再置置 置置置-血种录血出血 种出。种双4小小小，，进于于 于于于.清成。清现清 成现成扩孔孔孔取取行电电 电电电，分，沉， 分沉分散中中中11电泳泳 泳泳泳00使因使淀使 因淀因，。。。00泳槽槽 槽槽槽μμ抗电抗线抗 电线电2和ιι上上 上上上4兔兔原泳原。原 泳。泳h扩，， ，，，抗抗后和迁和和 迁迁散样样 样样样人人观抗移抗抗 移移。品品 品品品全全察体率体体 率率孔孔 孔孔孔血血结呈的呈呈 的的靠靠 靠靠靠清清果双不双双 不不近近 近近近充充。向同向向 同同阴阴 阴阴阴满满扩而扩扩 而而极极 极极极槽槽散被散散 被被端端 端端端内内，分，， 分分，， ，，，，，已离已已 离离用用 用用用注注分成分分 成成缓缓 缓缓缓意意离肉离离 肉肉冲冲 冲冲冲勿勿的眼的的 眼眼液液 液液液外外各不各各 不不浸 浸浸 浸 浸溢溢抗 可 抗 抗可 可湿湿 湿湿湿。。原见原原 见见的的 的的的与的与与 的的双双 双双双相区相相 区区层层 层层层应带应应 带带纱纱 纱纱纱抗。抗抗 。。布布 布布布体体体搭搭 搭搭搭在在在桥桥 桥桥桥琼琼琼电电 电电电脂脂脂泳泳 泳泳泳中中中。。 。。。扩扩扩散散散而而而相相相遇遇遇，，，