版中国药典微生物培训菌种的保藏和管理

微生物菌（毒）种保藏及管理文章编号：1004-9231(2007)02-0087-02在微生物检验及研究工作中经常使用菌（毒）种。

菌（毒）种是一种重要的生物资源。

菌（毒）种保藏不仅有利于重现已经做过的实验，证实发现新的菌（毒）种，而且也是研究、推广、开发和实际应用科研成果的基础。

保藏的菌（毒）种有的是开发利用的对象，有的是悉心研究的成果，有从自然界分离得到的，有经生物技术修饰改造获得的，都是有着极大的研究价值和开发利用的潜力［1］。

因此，菌（毒）种的保藏工作至关重要。

菌（毒）种保藏和管理是微生物工作者普遍关注的问题，它要求菌（毒）种在保藏和管理过程中不死亡，不被污染，并保持较高的存活率及遗传稳定性，以便长期使用。

1 菌（毒）种保藏［2］菌（毒）种保藏就是对活体微生物群体进行有效的保藏。

保藏方法有20多种，从总体上可分为4大类：传代法、干燥法、冷冻法和冷冻干燥法［1］。

无论哪种方法，其原理都是创造一个抑制细胞代谢的环境，如低温，干燥，缺氧，营养缺乏等。

简易的方法有定期移植法、液体石蜡法、无菌蒸馏水法、硅胶干燥法、玻璃或瓷珠干燥法、滤纸法、麸皮法、沙土管法等。

不同类型或不同种属的菌（毒）种可根据生理特性选用不同的保藏方法。

如产芽孢或孢子的菌种适用于干燥法，无抗逆性结构的细胞如酵母菌或某些种属的细菌可用定期移植法和液体保藏等方法。

目前公认的长期保存微生物菌（毒）种的较安全、可靠的方法是冷冻法和冷冻干燥法，而其中制备和保存生物材料的最佳方法是冷冻干燥法，此法适用于大多数微生物菌（毒）种的保藏，因为它适用于大多数细胞结构的特点、生存环境及其生理状态，能满足微生物细胞结构和功能的统一性。

其基本原理是运用干燥、低温和隔绝空气的手段，降低细菌（或病毒）新陈代谢的速度，使细菌（或病毒）的生命活动处于半永久性休眠状态，以达到长期保藏的目的［3］。

另外，保藏效果良好的还有液氮保藏法等。

2 保藏方法菌（毒）种的保藏是微生物检验、教学科研和有关生产单位的一项重要工作［4］。

规程–Ⅳ微生物（细菌）菌种保藏库管理规程中国检验检疫微生物菌种保藏管理中心前言微生物菌种资源是自然科学资源的重要组成部分，是生物多样性的重要体现。

本规程是依据我单位的特点，现有的工作基础和实际需要制定的。

制定本规程是为了实现微生物菌种资源保藏管理程序的规范化、标准化，以有效的收藏微生物菌种资源，更好的为检验检疫、科研培训等服务。

本规程制定了4°C菌种库、低温库管理的基本原则，菌种的出入库流程及菌种库的日常管理。

规程起草单位：中国检验检疫微生物菌种保藏管理中心规程起草人：赵贵明、王娉、杨海荣、陈颖、赵勇胜版本：2014-07目录前言--------------------------------------------------------------------第 1 页1 范围------------------------------------------------------------------第 3 页2 规范性引用文件--------------------------------------------------------第3 页3 术语和定义------------------------------------------------------------第 3 页4 菌种保藏库管理的基本原则----------------------------------------------第 4 页5 菌种库的建设----------------------------------------------------------第 4 页6 菌种保藏库的日常管理--------------------------------------------------第 5 页附录A （资料性附录）菌种入库单、出库三联单------------------------------第7 页微生物（细菌）菌种保藏库管理规程1范围本规程规定了菌种保藏库管理的基本原则，菌种的出入库流程及种库的日常管理。

微生物菌种常规保藏作业指导书1目的规范药品微生物学检定的管理，最大限度降低变异率，确保菌种的溯源性与稳定性，从而确保微生物学检定结果的准确可靠。

2范围本规程适用于检定用细菌菌种的管理，包括菌种的申购、保存、传代、使用及销毁等。

3职责实验人员严格按本管理规程的要求完成标准细菌菌种的申购、保存、传代、使用及销毁等工作。

4专业术语4.1标准菌种是指由中国药品生物制品检定所医学微生物菌种保藏中心提供的冷冻干燥菌。

4.2传代用菌种是指标准菌种制备的采用特定保存方法长期固定保存的菌种，用于传代及制备工作用菌种。

4.3菌种的代是指将其接种至一新鲜培养基上或培养基内，每萌发一次即称为一代，从菌种保藏中心获得的冷冻干燥菌种为第0代。

4.4菌种保藏微生物菌种用适宜的方法妥善保藏，避免死亡、污染，保持其原有性状基本稳定，以便于研究、交换和使用的目的。

4.5定期移植保藏法亦称传代培养保藏法，包括斜面培养、穿刺培养、液体培养等。

是指将菌种接种于适宜的培养基中，最适合的条件下培养，待菌种生长完全后，通常置于4～6℃进行保藏，并间隔一定时间进行移植培养的菌种保藏方法。

5检定菌种的申购由部门主管根据检定菌种的使用情况，提出购买计划，交由部门经理审批后，向中检所菌种保藏中心或省（市）药检所购买冻干菌种（标准菌种）；也可以直接向省（市）药检所购买传代用菌种，购买时，需询问与确定菌种的代数，以便传代时控制代数。

6定菌的接收菌种到达实验室后，由部门主管接收菌种，检查其名称和数量，以及每一支的完整性，同时将菌种的所有信息，填写在《检定菌接收记录》（附表1）上，内容包括：名称、数量、编号（无编号则按检定菌种的编号）、代数、来源、接收日期、接收人等，贴好标签并储存于2～8℃直到需要使用时。

储存期最长不超过5年。

7定菌的保存7.1工作用菌种的保存工作用菌种采用斜面低温保存法。

将菌种接种在适合的固体培养基上，待菌生长充分以后，转移至2～8℃冰箱中保存。

补充：菌种的传代和保藏美国药典（USP）中规定：“将微生物接种至一新鲜培养基上/内，每萌发一次即称为一代，因此，当原始菌种复溶并转至一培养基内生长，即认为已传代一次，”并规定“菌种的传代次数（自原始菌种冻干粉起）不得超过5代”。

我国的GMP认证中也如此要求，并且中国药典2005年版药典也已做出“菌种的传代次数（自原始菌种冻干粉起）不得超过5代”这个明确的规定。

实验室菌种的传代保藏过程1. 按菌种说明书要求复溶菌粉，转种于适当的增菌培养基内（G1），复壮后转接至平板上，并于适当温度下培养适当时间，分离出单个纯种菌落，此为第2代（G2）。

2. 菌种鉴定完成后，挑取纯菌落制成浓菌悬液用于制备甘油冷冻管，同时挑取纯菌落转接斜面菌种作为工作用菌种。

此时，保藏菌种为第2代，但工作用菌种则为第三代。

3. 将第2代菌种管冷冻保存，将工作用菌种于适当温度下培养适当时间后可用于试验。

4. 取一支冷冻保存的G2代菌种转种于平板和斜面培养基上，平板上的菌种制成冷冻保藏管第三代（G3），斜面培养基经适当温度下培养适当时间后用作工作用菌种（W3）。

5. 将第三代菌种（G3）冷冻或低温保存，将生长、转种后的G2菌种经灭菌处理后丢弃。

6. 当工作用菌种代数小于5时，可直接用上一代工作用菌种转接下一代工作用菌种，如W3可直接转接为W4。

7. 按上述程序操作，直至G4转为W5为止，需重新开启安瓿，再重复上述操作程序、保藏和使用菌种。

以上方法中，菌种被分为两类。

传代用菌种和工作用菌种，传代用菌种用于甘油冷冻管法保藏，工作用菌种用斜面低温保藏法保藏。

实验证明，甘油冷冻管的有效期至少为2年，但其主要适用于细菌（需氧）、酵母菌的传代、保藏、对厌氧菌、真菌和芽孢类细菌则需应用其它方法。

《中国医学微生物菌种保藏管理办法》中文名中国医学微生物菌种保藏管理办法颁布单位卫生部颁布时间1985.03.23实施时间1985.03.23中国医学微生物菌种保藏管理办法根据中国微生物菌种保藏委员会管理和组织条例的规定，为了加强医学微生物菌种（以下简称菌种）的保藏管理，特制定本管理办法。

第一条组织及任务在卫生部领导下，在中国微生物菌种保藏委员会指导下，设下列医学微生物菌种保藏管理中心：中国医学真菌菌种保藏管理中心：由中国医学科学院皮肤病防治研究所负责。

中国医学细菌菌种保藏管理中心：由卫生部药品生物制品检定所负责。

中国医学病毒菌种保藏管理中心：由中国预防医学中心病毒学研究所负责。

保藏管理中心的任务是：（一）负责本门类微生物菌种的选择、收集、鉴定、保藏、交换和供应；（二）开展菌种分类、鉴定及保藏管理的研究；（三）组织学术交流和经验交流；（四）办理国内外菌种交换；（五）编制保管的菌种目录。

保藏管理中心下设专业实验室，承担全国性的业务工作。

专业实验室对其直接领导机构和保藏管理中心负责，并定期向管理中心汇报工作情况。

其具体任务是：（一）负责本专业有关微生物菌种的选择、收集、鉴定、保藏、交换和供应；（二）承担本专业有关疑难菌种鉴定；（三）开展有关菌种分类、鉴定、保藏的研究，包括新技术、新方法的研究和应用；（四）办理对外交流和交换菌种。

各专业实验室科研技术人员的编制和经费由所属主管部门负责。

生物制品生产、检定用的菌种按“生物制品生产、检定用菌种、毒种管理规程”执行，统一由卫生部药品生物制品检定所办理。

第二条菌种的分类菌种的分类根据其危险性决定（包括实验室感染的可能性，感染后发病的可能性，症状轻重及愈后情况，有无致命危险及有效的防止实验室感染方法，用一般的微生物操作方法能否防止实验室感染、我国有否此种菌种及曾否引起流行、人群免疫力等情况）。

依其危险程度的大小，我国的菌种分为四类。

一类：实验室感染的机会多，感染后发病的可能性大，症状重并能危及生命，缺乏有效的预防方法，以及传染性强，对人群危害性大的烈性传染病，包括国内未发现或虽已发现，但无有效防治方法的烈性传染病菌种。

中国医学微生物菌种保藏管理办法根据中国微生物菌种保藏委员会管理和组织条例的规定，为了加强医学微生物菌种(以下简称菌种)的保藏管理，特制定本管理办法。

第一条组织及任务在卫生部领导下，在中国微生物菌种保藏委员会指导下，设下列医学微生物菌种保藏管理中心:中国医学真菌菌种保藏管理中心:由中国医学科学院皮肤病防治研究所负责。

中国医学细菌菌种保藏管理中心:由卫生部药品生物制品检定所负责。

中国医学病毒菌种保藏管理中心:由中国预防医学中心病毒学研究所负责。

保藏管理中心的任务是:(一)负责本门类微生物菌种的选择、收集、鉴定、保藏、交换和供应;(二)开展菌种分类、鉴定及保藏管理的研究;(三)组织学术交流和经验交流;(四)办理国内外菌种交换;(五)编制保管的菌种目录。

保藏管理中心下设专业实验室，承担全国性的业务工作。

专业实验室对其直接领导机构和保藏管理中心负责，并定期向管理中心汇报工作情况。

其具体任务是:(一)负责本专业有关微生物菌种的选择、收集、鉴定、保藏、交换和供应;(二)承担本专业有关疑难菌种鉴定;(三)开展有关菌种分类、鉴定、保藏的研究，包括新技术、新方法的研究和应用;(四)办理对外交流和交换菌种。

各专业实验室科研技术人员的编制和经费由所属主管部门负责。

生物制品生产、检定用的菌种按"生物制品生产、检定用菌种、毒种管理规程"执行，统一由卫生部药品生物制品检定所办理。

第二条菌种的分类菌种的分类根据其危险性决定(包括实验室感染的可能性，感染后发病的可能性，症状轻重及愈后情况，有无致命危险及有效的防止实验室感染方法，用一般的微生物操作方法能否防止实验室感染、我国有否此种菌种及曾否引起流行、人群免疫力等情况)。

依其危险程度的大小，我国的菌种分为四类。

一类:实验室感染的机会多，感染后发病的可能性大，症状重并能危及生命，缺乏有效的预防方法，以及传染性强，对人群危害性大的烈性传染病，包括国内未发现或虽已发现，但无有效防治方法的烈性传染病菌种。

病原微生物菌（毒）种和样本的重要性段丽莉. 菌种保管应有专人负责，保存于冰箱中，房门专人加锁，确保菌种安全。

保管人员变动时，必须严格交接手续。

2、菌种应有严格的登记，包括形态，分离日期，鉴定日期，签发者，主要鉴定性能（包括形态、染色、抗原结构、动物致病力等），并注明使用、转移、销毁情况及原因。

3、各种菌种应按规定时间接种，一般在接种三次后作一次全面的鉴定，注意菌种有无污染及变异，如发现变异时，应及时更换。

4、菌种保存范围及向外单位转移，应按国家卫生部规定执行。

5、所有存在菌种应具备清单。

编写：审核：批准：批准日期：主要内容病原微生物菌（毒）种和样本是国家重要生物资源，是保障生物安全和国家经济安全与稳定的重要战略资源。

是人类传染病预防、诊断和治疗以及医学科研和教学事业的基础和重要支撑条件，也是保障食品安全、生物安全以及抵御生物恐怖袭击的前提条件。

病原微生物菌（毒）种和样本病原微生物菌（毒）种和样本由于其本身所具有的特殊性，在其采集、携带、运输、保藏管理和使用过程中必须强调生物安全，必须符合国家传染病防治、医学微生物菌（毒）种管理有关法规的规定。

其管理不仅强调在硬件设备上要符合微生物安全防护的要求，更重要的是强调所有管理人员、工作人员在日常工作中要有常备不懈的防护意识和守法观念。

菌（毒）种分类按照微生物结构、组成分为三大类：原核细胞型微生物：细菌、支原体、立克次体、衣原体、螺旋体和放线菌。

真核细胞型微生物：真菌非细胞型微生物：病毒中国医学微生物菌种保藏管理办法第二条菌种的分类菌（毒）种的分类根据其危险性决定的对实验室感染的可能性；人体感染后发病的可能性；发病后症状轻重及愈后情况；有无致命危险及有效的防止实验室感染方法；用一般的微生物操作方法能否防止实验室污染；我国有否此种菌种及曾否引起流行人群免疫力等情况。

依其危险程度的大小，我国的菌(毒)种分为四类。

中国医学微生物菌种保藏管理办法第二条菌种的分类一类：实验室感染的机会多，感染后发病的可能性大，症状重并能危及生命，缺乏有效的预防方法，以及传染性强，对人群危害性大的烈性传染病，包括国内未发现或虽已发现，但无有效防治方法的烈性传染病菌（毒）种。