工业微生物菌种保藏技术.pptx
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《菌种传代与保藏》课件
通过菌种鉴定和纯化，可以了解菌种的属性和特征，如形态、染色、生化反应等，以确定其分类地位 和用途。这有助于保证实验结果的准确性和可靠性。
去除杂菌和变异株
在菌种传代和保藏过程中，难免会混入杂菌或产生变异株。通过鉴定和纯化，可以去除这些杂菌和变 异株，保持菌种的纯度和一致性。这有助于保证实验的可重复性和结果的可靠性。
02 菌种传代技术
液体培养传代法
总结词
通过液体培养基进行菌种传代的方法
详细描述
将菌种接种到液体培养基中，经过一定时间的培养后，再进行菌种分离和纯化 ，用于后续的实验和研究。该方法操作简便，适用于大规模生产。
固体培养传代法
总结词
在固体培养基上进行菌种传代的方法
详细描述
将菌种接种到固体培养基表面，经过一定时间的培养后，形成菌落并进行纯化。 该方法常用于分离和鉴定微生物，能够较好地保持菌种的特性。
真空冷冻干燥保藏法
结合低温与干燥两种保藏方法，通过 真空冷冻干燥技术延长菌种存活时间 的方法。
将菌种在低温下进行真空处理，去除 水分，然后保存在干燥的环境中，这 种方法可以显著延长菌种存活时间， 并保持菌种的活性和稳定性。
液氮保藏法
通过将菌种保存在极低温度的液氮中，以延长菌种存活时间 的方法。
将菌种悬浮在液氮中，利用液氮的超低温特性（-196°C）来 延长菌种存活时间。这种方法可以长期保存菌种，但需要专 业的设备和操作技术，且成本较高。
03
及时发现并处理变异菌株
在菌种传代过程中，应密切关注菌种的生长和性状变化。一旦发现变异
菌株，应及时进行分离和鉴定，并采取相应的措施进行处理，以防止其
扩散和影响后续实验结果。
保持菌种的纯度和活性
定期进行菌种鉴定和纯化
去除杂菌和变异株
在菌种传代和保藏过程中，难免会混入杂菌或产生变异株。通过鉴定和纯化，可以去除这些杂菌和变 异株，保持菌种的纯度和一致性。这有助于保证实验的可重复性和结果的可靠性。
02 菌种传代技术
液体培养传代法
总结词
通过液体培养基进行菌种传代的方法
详细描述
将菌种接种到液体培养基中，经过一定时间的培养后，再进行菌种分离和纯化 ，用于后续的实验和研究。该方法操作简便，适用于大规模生产。
固体培养传代法
总结词
在固体培养基上进行菌种传代的方法
详细描述
将菌种接种到固体培养基表面，经过一定时间的培养后，形成菌落并进行纯化。 该方法常用于分离和鉴定微生物，能够较好地保持菌种的特性。
真空冷冻干燥保藏法
结合低温与干燥两种保藏方法，通过 真空冷冻干燥技术延长菌种存活时间 的方法。
将菌种在低温下进行真空处理，去除 水分，然后保存在干燥的环境中，这 种方法可以显著延长菌种存活时间， 并保持菌种的活性和稳定性。
液氮保藏法
通过将菌种保存在极低温度的液氮中，以延长菌种存活时间 的方法。
将菌种悬浮在液氮中，利用液氮的超低温特性（-196°C）来 延长菌种存活时间。这种方法可以长期保存菌种，但需要专 业的设备和操作技术，且成本较高。
03
及时发现并处理变异菌株
在菌种传代过程中，应密切关注菌种的生长和性状变化。一旦发现变异
菌株，应及时进行分离和鉴定，并采取相应的措施进行处理，以防止其
扩散和影响后续实验结果。
保持菌种的纯度和活性
定期进行菌种鉴定和纯化
工业微生物的菌种选育与保藏优秀课件
采样的对象也可以是植物，腐败物品，某些水域等。
从自然界筛选
2、采样季节：以温度适中，雨量不多的秋初为好。
3、采土方式：在选好适当地点后，用小铲子除去 表土，取离地面5-15cm处的土约10g，盛入清洁的 牛皮纸袋或塑料袋中，扎好，标记，记录采样时 间、地点、环境条件等，以备查考。为了使土样 中微生物的数量和类型尽少变化，宜将样品逐步 分批寄回，以便及时分离。
（三）培养分离
尽管通过增殖培养效果显著，但还是处于微生物 的混杂生长状态。因此还必须分离，纯化。在这— 步，增殖培养的选择性控制条件还应进一步应用， 而且控制得细一点，好一点。纯种分离的方法有划 线分离法、稀释分离法。
稀
划
释
线
分
分
离
离
法
法
（四）筛 选
这一步是采用与生产相近的培养基和培养条件， 通过三角瓶的容量进行小型发酵试验，以求得适 合于工业生产用菌种。
2．植物体采集方法
在采集叶面时，一般是用灭菌的剪刀、打孔 器、安全刀片等，由几片新鲜叶片的同一部位 切取一小块，并注意不要损伤周围边缘。
选择叶面时应考虑叶位、叶龄、叶片正反面和 在一片叶上的取样部位。
3、采好的样必须完整地标上样本的种类及采集 日期、地点以及采集地点的地理、生态参数 等；
4、应充分考虑采样的季节性和时间因素，因为 真正的原地菌群的出现可能是短暂的；
5、采好的样应及时处理，暂不能处理的也应 贮存于4℃下，但贮存时间不宜过长。这是因 为一旦采样结束，试样中的微生物群体就脱 离了原来的生态环境，其内部生态环境就会 发生变化，微生物群体之间就会出现消长
6．根据上述1-5项中所获得的数据，设计分离方法，即 选择适宜的稀释液、底物、试样、天然浸出汁和培养条 件；
从自然界筛选
2、采样季节：以温度适中，雨量不多的秋初为好。
3、采土方式：在选好适当地点后，用小铲子除去 表土，取离地面5-15cm处的土约10g，盛入清洁的 牛皮纸袋或塑料袋中，扎好，标记，记录采样时 间、地点、环境条件等，以备查考。为了使土样 中微生物的数量和类型尽少变化，宜将样品逐步 分批寄回，以便及时分离。
（三）培养分离
尽管通过增殖培养效果显著，但还是处于微生物 的混杂生长状态。因此还必须分离，纯化。在这— 步，增殖培养的选择性控制条件还应进一步应用， 而且控制得细一点，好一点。纯种分离的方法有划 线分离法、稀释分离法。
稀
划
释
线
分
分
离
离
法
法
（四）筛 选
这一步是采用与生产相近的培养基和培养条件， 通过三角瓶的容量进行小型发酵试验，以求得适 合于工业生产用菌种。
2．植物体采集方法
在采集叶面时，一般是用灭菌的剪刀、打孔 器、安全刀片等，由几片新鲜叶片的同一部位 切取一小块，并注意不要损伤周围边缘。
选择叶面时应考虑叶位、叶龄、叶片正反面和 在一片叶上的取样部位。
3、采好的样必须完整地标上样本的种类及采集 日期、地点以及采集地点的地理、生态参数 等；
4、应充分考虑采样的季节性和时间因素，因为 真正的原地菌群的出现可能是短暂的；
5、采好的样应及时处理，暂不能处理的也应 贮存于4℃下，但贮存时间不宜过长。这是因 为一旦采样结束，试样中的微生物群体就脱 离了原来的生态环境，其内部生态环境就会 发生变化，微生物群体之间就会出现消长
6．根据上述1-5项中所获得的数据，设计分离方法，即 选择适宜的稀释液、底物、试样、天然浸出汁和培养条 件；
《菌种的传代与保藏》课件
微生物菌种的保藏。
04
CATALOGUE
菌种传代与保藏的注意事项
防止菌种污染与变异
01
02
03
严格控制传代过程
在菌种传代过程中，应采 取无菌操作，避免污染。
选择适当的培养基
选择适当的培养基，以保 证菌种的正常生长和代谢 。
避免频繁传代
频繁传代会导致菌种变异 ，因此应合理控制传代次 数。
保持菌种遗传稳定性
通过菌种传代，可以持续获得相同特 性的菌株，为科学研究、产品开发、 质量控制等提供可靠的实验材料。
菌种保藏的原理与重要性
菌种保藏是长期保存菌种的有效方法，其原理在于创造不适宜菌种生长的环境条 件，使其处于休眠状态，从而延长菌种的保存期限。
菌种保藏对于保护生物多样性、防止菌种丢失、保障实验结果的可靠性等方面具 有重要意义。
尊重他人的知识产权，不得侵犯他 人的合法权益。
05
CATALOGUE
菌种传代与保藏的应用前景
在生物科学研究中的应用
要点一
基础生物学研究
菌种传代与保藏技术对于基础生物学研究至关重要，如微 生物分类学、进化生物学和生态学等。通过菌种传代与保 藏，科学家可以深入研究微生物的生理生化特性、基因组 学和蛋白质组学等，以揭示微生物生命活动的奥秘。
03
CATALOGUE
菌种的保藏技术
低温保藏法
总结词
一种常用的菌种保藏方法，通过降低温 度来降低菌种的代谢活性，延长菌种存 活时间。
VS
详细描述
将菌种保存在低温环境下，如冰箱的冷藏 室或冷冻室内，使菌种处于休眠状态，降 低其代谢活性，减少菌种变异和污染的机 会。适用于大多数微生物菌种的短期保藏 。
业的发展。
生物农药和生物肥料
04
CATALOGUE
菌种传代与保藏的注意事项
防止菌种污染与变异
01
02
03
严格控制传代过程
在菌种传代过程中，应采 取无菌操作，避免污染。
选择适当的培养基
选择适当的培养基，以保 证菌种的正常生长和代谢 。
避免频繁传代
频繁传代会导致菌种变异 ，因此应合理控制传代次 数。
保持菌种遗传稳定性
通过菌种传代，可以持续获得相同特 性的菌株，为科学研究、产品开发、 质量控制等提供可靠的实验材料。
菌种保藏的原理与重要性
菌种保藏是长期保存菌种的有效方法，其原理在于创造不适宜菌种生长的环境条 件，使其处于休眠状态，从而延长菌种的保存期限。
菌种保藏对于保护生物多样性、防止菌种丢失、保障实验结果的可靠性等方面具 有重要意义。
尊重他人的知识产权，不得侵犯他 人的合法权益。
05
CATALOGUE
菌种传代与保藏的应用前景
在生物科学研究中的应用
要点一
基础生物学研究
菌种传代与保藏技术对于基础生物学研究至关重要，如微 生物分类学、进化生物学和生态学等。通过菌种传代与保 藏，科学家可以深入研究微生物的生理生化特性、基因组 学和蛋白质组学等，以揭示微生物生命活动的奥秘。
03
CATALOGUE
菌种的保藏技术
低温保藏法
总结词
一种常用的菌种保藏方法，通过降低温 度来降低菌种的代谢活性，延长菌种存 活时间。
VS
详细描述
将菌种保存在低温环境下，如冰箱的冷藏 室或冷冻室内，使菌种处于休眠状态，降 低其代谢活性，减少菌种变异和污染的机 会。适用于大多数微生物菌种的短期保藏 。
业的发展。
生物农药和生物肥料
微生物菌种的保藏_PPT幻灯片
低温定期移植法：
• 把培养好的斜面菌种放在低温干燥处保存， 定期移植，一般3～6个月移植一次(视菌种 特征而定)。也可以用穿刺培养，定期移植 法保藏细菌，其效果也较好。
• 穿刺培养是将含0.6％～0.8％的琼脂培养 基装试管灭菌后直立冷凝后，用接种针尖 挑取少量菌体，垂直刺入琼脂培养基中心， 放在适当温度下培养，待菌长好后即可放 低温保存，此法较斜面保存有利，大肠杆 菌可保藏2年以上不发生明显变异。
• 甘油管保藏法：是利用微生物在甘油中 生长和代谢受到抑制的原理达到保藏目 的。其方法是，将40%的甘油高压蒸汽灭 菌待用。将培养好的斜面菌种用无菌种 用 无 菌 水 制 成 高 浓 度 的 菌 悬 液 (108 ～ 1010/ml)。取1ml灭菌甘油放入与甘油充 分混匀，使甘油浓度约为20%，于-20℃ 下冻存。
菌种菌种保藏
伤细胞。 在缓慢冷冻时，胞外基质一般较快结冰而 形成冰晶使基质浓度增高，造成细胞水分 外渗而大量脱水，可能使细胞死亡。如快 速降温，胞内也很快形成冰晶，胞内外渗 透压基本平衡，同时胞内冰晶较小，对细 胞及原生质膜的损伤也较小，菌株不易死 亡，影响也较小。
• 菌种是从事微生物学及生命科学研究的 基本材料.
• 微生物具有生命活力，在传代过程中易 发生变异甚至死亡，因此菌种保藏是一 项重要的基础工作，是微生物学基础工 作的一项重要内容，也是药品微生物工 作中的一项常用技术。
• 工业微生物菌种保藏，是要使菌 种生产能力和与生产工艺相适应 的优良性状保持稳定，当然做不 到绝对不变，只是力求把这种衰 退现象推迟减缓到最低限度。
工业微生物菌种保藏技术和发酵过程
1．离心收获对数生长中期至后期的微生物细胞； 2．用新鲜培养基重新悬浮所收获的细胞； 3．加入等体积的20％甘油或10％二甲亚砜； 4．混匀后分装入冷冻指管或安瓿中，于-70℃超低 温冰箱中保藏。
通过冷冻，使微生物代谢活动停止。一般而言， 冷冻温度愈低，效果愈好。为了获得满意的冷冻 结果，通常应在培养物中加入一定的冷冻保护剂 冷冻保藏时温度要求在-20℃以下，同时应认真掌 握好冷冻速度和解冻速变。 冷冻深藏的缺点之一是培养物运输较困难。
冷冻保藏种类
一、普通冷冻保藏技术(-20℃) 二、超低温冷冻保藏技术(-60一-80℃) 三、液氮冷冻保藏技术
NICPB
卫生部药品生物制品监察所
IV 中国医学科学院病毒研究所 CVCC 兽医微生物菌种保藏管理中心
CIVBP 中国兽医药品监察所
YM 云南省微生物研究所
中国微生物菌种保藏管理委员会组织机构
中 国 微 生 物 菌 种 保 藏 管 理 委 员 会 办 事 处 (CCCCM): 中 国 科 学 院 微 生 物 研 究 所 内 ,北 京 (AS),100080
应注意的是经过一次解冻的菌株培养物不宜再用 来保藏。
保藏过程中应注意控制保藏温度，培养瓶或试管 应严格密封。
这一方法虽简便易行，但不适宜多数微生物的长 期保藏。
二、超低温冷冻保藏技术(-60一-80℃)
要求长期保藏的微生物菌种，一般都要求在-60℃以下 进行保藏。 在超低温冷藏柜中保藏菌种的一般方法是：
普通冷冻保藏技术(-20℃)
将液体培养物或从琼脂斜面培养物收获的细胞分接到 试管或指管肉，然后贮藏于一冰箱的冷藏室中，或于 温度范围在-5～-20℃的普通冰箱(-20℃)中。或者， 将菌种培养在小的试管或培养瓶斜面上，待生长适度 后，将试管或瓶口用橡胶塞严格封好，同上置于冰箱 中保存。
通过冷冻，使微生物代谢活动停止。一般而言， 冷冻温度愈低，效果愈好。为了获得满意的冷冻 结果，通常应在培养物中加入一定的冷冻保护剂 冷冻保藏时温度要求在-20℃以下，同时应认真掌 握好冷冻速度和解冻速变。 冷冻深藏的缺点之一是培养物运输较困难。
冷冻保藏种类
一、普通冷冻保藏技术(-20℃) 二、超低温冷冻保藏技术(-60一-80℃) 三、液氮冷冻保藏技术
NICPB
卫生部药品生物制品监察所
IV 中国医学科学院病毒研究所 CVCC 兽医微生物菌种保藏管理中心
CIVBP 中国兽医药品监察所
YM 云南省微生物研究所
中国微生物菌种保藏管理委员会组织机构
中 国 微 生 物 菌 种 保 藏 管 理 委 员 会 办 事 处 (CCCCM): 中 国 科 学 院 微 生 物 研 究 所 内 ,北 京 (AS),100080
应注意的是经过一次解冻的菌株培养物不宜再用 来保藏。
保藏过程中应注意控制保藏温度，培养瓶或试管 应严格密封。
这一方法虽简便易行，但不适宜多数微生物的长 期保藏。
二、超低温冷冻保藏技术(-60一-80℃)
要求长期保藏的微生物菌种，一般都要求在-60℃以下 进行保藏。 在超低温冷藏柜中保藏菌种的一般方法是：
普通冷冻保藏技术(-20℃)
将液体培养物或从琼脂斜面培养物收获的细胞分接到 试管或指管肉，然后贮藏于一冰箱的冷藏室中，或于 温度范围在-5～-20℃的普通冰箱(-20℃)中。或者， 将菌种培养在小的试管或培养瓶斜面上，待生长适度 后，将试管或瓶口用橡胶塞严格封好，同上置于冰箱 中保存。
6工业微生物资源的保藏 ppt课件
2020/5/11
2020/5/11
2020/5/11
优点：低温、干燥、无氧、有保护剂，可保藏 各大类微生物，保藏时间可达几十年，是目前 使用最广、最有效的保藏方法。一般专业机构 大都使用此法保藏。 缺点：不能保藏真菌菌丝。
2020/5/11
（5）液氮保藏法 操作方法：
液氮温度可达－196℃。把菌悬液密封于安瓶中， 置液氮罐内保藏。
菌种保藏的温度、所用的培养基等可影响自发突变。
2020/5/11
（二）菌种的复壮（rejuvenation
）
1. 定义 狭义的复壮：
是指菌种已发生衰退后，通过纯种分离和测定典
型性状、生产性能等指标，从已衰退的群体中筛选 出少数尚未退化的个体，以达到恢复原菌株固有性 状的相应措施。
是一种消极的措施
2020/5/11
2020/5/11
低温可减缓生长速度，单细胞仍有一定的活动条件， 一般4～6个月必须传代一次。
优点：方便，不受条件限制，各类微生物均可。 缺点：时间短、传代多、易退化。
2020/5/11
（2）液体石蜡法 操作方法：
生长完全的斜面上覆盖无菌的液体石蜡， 液面高于斜面1cm，普通冰箱保藏。
2020/5/11
2020/5/11
优点：低温、干燥、无氧、无营养，保藏效果好， 时间可达几年至数十年。 缺点：只适用于产孢子的微生物，不能用于保藏营 养细胞。
2020/5/11
（4）冷冻干燥保藏法 操作方法：
是将液体样品（含保护剂的菌悬液）在冻结状态 下升华其中水分，最后达到干燥。培养物用无菌 脱脂牛奶—保护剂制成菌悬液，加入安瓶中，冷 冻、抽真空、封口。
再次，添加保护剂或酸碱中和剂，避免保藏过 程中细胞受伤。
2020/5/11
2020/5/11
优点：低温、干燥、无氧、有保护剂，可保藏 各大类微生物，保藏时间可达几十年，是目前 使用最广、最有效的保藏方法。一般专业机构 大都使用此法保藏。 缺点：不能保藏真菌菌丝。
2020/5/11
（5）液氮保藏法 操作方法：
液氮温度可达－196℃。把菌悬液密封于安瓶中， 置液氮罐内保藏。
菌种保藏的温度、所用的培养基等可影响自发突变。
2020/5/11
（二）菌种的复壮（rejuvenation
）
1. 定义 狭义的复壮：
是指菌种已发生衰退后，通过纯种分离和测定典
型性状、生产性能等指标，从已衰退的群体中筛选 出少数尚未退化的个体，以达到恢复原菌株固有性 状的相应措施。
是一种消极的措施
2020/5/11
2020/5/11
低温可减缓生长速度，单细胞仍有一定的活动条件， 一般4～6个月必须传代一次。
优点：方便，不受条件限制，各类微生物均可。 缺点：时间短、传代多、易退化。
2020/5/11
（2）液体石蜡法 操作方法：
生长完全的斜面上覆盖无菌的液体石蜡， 液面高于斜面1cm，普通冰箱保藏。
2020/5/11
2020/5/11
优点：低温、干燥、无氧、无营养，保藏效果好， 时间可达几年至数十年。 缺点：只适用于产孢子的微生物，不能用于保藏营 养细胞。
2020/5/11
（4）冷冻干燥保藏法 操作方法：
是将液体样品（含保护剂的菌悬液）在冻结状态 下升华其中水分，最后达到干燥。培养物用无菌 脱脂牛奶—保护剂制成菌悬液，加入安瓶中，冷 冻、抽真空、封口。
再次，添加保护剂或酸碱中和剂，避免保藏过 程中细胞受伤。
微生物菌种保藏原理与方法18页PPT
46、我们若已接受最坏的，就再没有什么损失。——卡耐基 47、书到用时方恨少、事非经过不知难。——陆游 48、书籍把我们引入最美好的社会，使我们认识各个时代的伟大智者。——史美尔斯 49、熟读唐诗三百首，不会作诗也会吟。——孙洙 50、谁和我一样用功，谁就会和我一样成功。——莫扎特
33、如果惧怕前面跌宕的山岩，生命 就永远 只能是 死水一 潭。 34、当你眼泪忍不住要流出来的时候 ，睁大 眼睛， 千万别 眨眼!你会看到 世界由 清晰变 模糊的 全过程 ，心会 在你泪 水落下 的那一 刻变得 清澈明 晰。盐 。注定 要融化 的，也 许是用 眼泪的 方式。
35、不要以为自己成功一次就可以了 ，也不 要以为 过去的 光荣可 以被永 远肯定 。
微生物菌种保藏原理与方法
31、别人笑我太疯癫，我笑他人看不 穿。(名 言网) 32、我不想听失意者的哭泣， 传染。 我要尽 量避免 绝望， 辛勤耕 耘，忍 受苦楚 。我一 试再试 ，争取 每天的 成功， 避免以 失败收 常在别 人停滞 不前时 ，我继 续拼搏 。
1-微生物保藏及基本操作技术-37页PPT资料
干燥完结
预冻
医疗器械无菌检验员操作实务与洁净室管理，北京，2012
制备菌悬液、经分装到进行预冻之间的时间不宜超过1h； 分装完成后将安瓿管立刻放入－35～－40℃冰箱预冻1h，
使菌液完全冻结； 可采用分段式预冻，先将分装好的安瓿管置－20℃冻30
分钟，再放入－80℃冰箱冻30min； 采用离心式冻干装置时勿需预冻。
医疗器械无菌检验员操作实务与洁净室管理，北京，2012
冻干样品制备
制备斜面培养物； 将保护剂用无菌吸管注入到斜面培养物上，用吸管刮取斜
面上的菌体，使菌体均匀地悬浮在保护剂内。 用长毛细滴管将菌悬液分装到安瓿管内，0.1～0.2ml/管，
操作时要把带有菌悬液的长毛细滴管直接插入安瓿管的底 部，勿使菌液沾在管壁上。
医疗器械无菌检验员操作实务与洁净室管理，北京，2012
微生物菌种保藏
微生物菌种保藏方法
基本原理是在挑选优良纯培养物并使其处于休 眠状态基础上，人为地创造一个有利于休眠的 环境，使其长期保存后仍能保持菌种原有的优 良特性。
基本措施是低温、真空、干燥。
医疗器械无菌检验员操作实务与洁净室管理，北京，2012
医疗器械无菌检验员操作实务与洁净室管理，北京，2012
安瓿管的准备
清洗
选用中性玻璃材质的安瓿管； 2%盐酸浸泡8～10h，自来水冲洗至中性，蒸馏水冲洗2～3次； 置于烘箱中烘干。
棉塞
打棉塞，160℃定型2h；
标签
激光打印标签，标明菌株编号和保藏日期，大小约10×20mm。 喷码于安瓿管外，160℃固定20min。
熔封
医疗器械无菌检验员操作实务与洁净室管理，北京，2012
将安瓿管的中上部用火焰烧软，拉成细颈； 将安瓿管装到多歧管上，用火焰在细颈处熔封； 拉管时注意火焰不要离菌体太近。
预冻
医疗器械无菌检验员操作实务与洁净室管理，北京，2012
制备菌悬液、经分装到进行预冻之间的时间不宜超过1h； 分装完成后将安瓿管立刻放入－35～－40℃冰箱预冻1h，
使菌液完全冻结； 可采用分段式预冻，先将分装好的安瓿管置－20℃冻30
分钟，再放入－80℃冰箱冻30min； 采用离心式冻干装置时勿需预冻。
医疗器械无菌检验员操作实务与洁净室管理，北京，2012
冻干样品制备
制备斜面培养物； 将保护剂用无菌吸管注入到斜面培养物上，用吸管刮取斜
面上的菌体，使菌体均匀地悬浮在保护剂内。 用长毛细滴管将菌悬液分装到安瓿管内，0.1～0.2ml/管，
操作时要把带有菌悬液的长毛细滴管直接插入安瓿管的底 部，勿使菌液沾在管壁上。
医疗器械无菌检验员操作实务与洁净室管理，北京，2012
微生物菌种保藏
微生物菌种保藏方法
基本原理是在挑选优良纯培养物并使其处于休 眠状态基础上，人为地创造一个有利于休眠的 环境，使其长期保存后仍能保持菌种原有的优 良特性。
基本措施是低温、真空、干燥。
医疗器械无菌检验员操作实务与洁净室管理，北京，2012
医疗器械无菌检验员操作实务与洁净室管理，北京，2012
安瓿管的准备
清洗
选用中性玻璃材质的安瓿管； 2%盐酸浸泡8～10h，自来水冲洗至中性，蒸馏水冲洗2～3次； 置于烘箱中烘干。
棉塞
打棉塞，160℃定型2h；
标签
激光打印标签，标明菌株编号和保藏日期，大小约10×20mm。 喷码于安瓿管外，160℃固定20min。
熔封
医疗器械无菌检验员操作实务与洁净室管理，北京，2012
将安瓿管的中上部用火焰烧软，拉成细颈； 将安瓿管装到多歧管上，用火焰在细颈处熔封； 拉管时注意火焰不要离菌体太近。
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YM 云南省微生物研究所
中国微生物菌种保藏管理委员会组织机构
中国微生物菌种保藏管理委员会办事处(CCCCM): 中国科学院微生物研究所内,北京(AS),100080
1. 普通微生物菌种保藏管理中心(CCGMC) 中国科学院微生物研究所,北京(AS),100080:真菌、细菌 中国科学院武汉病毒研究所,武汉(AS-IV),430071:病毒
名称
缩写
名称
中国农业微生物菌种保藏管
中国农业科学院土壤肥料研究
ACCC 理中心
ISF 所
SH
上海市农业科学院食用菌研 究所
CACC
抗菌素菌种保藏管理中心
IA
中国医学科学院抗菌素研究 所
SIA
四川抗菌素工业研究所
CCGM 普通微生物菌种保藏管理中 C心
AS
中国科学院微生物研究所
AS-IV 中国科学院武汉病毒研究所 CFCC 林业微生物菌种保藏管理中心
2.农业微生物菌种保藏管理中心(ACCC) 中国农业科学院土壤肥料研究所,北京(ISF),100081
3.工业微生物菌种保藏管理中心(CICC) 轻工业部食品发酵工业科学研究所,北京(IFFI),100027
4.医学微生物菌种保藏管理中心(CMCC) 中国医学科学院皮肤病研究所,南京(ID),210042:真菌 中国药品生物制品检定所,北京(NICPBP),100050:细菌 中国医学科学院病毒研究所,北京(IV),100052:病毒
第九节 工业微生物菌种保藏技术
在生产发酵中，具有高产有重要经济价值 的某一期待代谢产物主能力的微生物菌种的保 存和长期保藏，对于一成功的工业发酵过程极 为重要。
一、理想的菌种保藏方法应具备 的条件
(1) 经长期保藏后菌种存活健在； (2) 保证高产突变株不改变表型和基因型，特别
是不改变初级代谢产物和次级代谢产物生产的 高产能力。 (3)菌种保藏的基本措施是低温、干燥、真空。
冷冻保藏种类
一、普通冷冻保藏技术(-20℃) 二、超低温冷冻保藏技术(-60一-80℃) 三、液氮冷冻保藏技术
普通冷冻保藏技术(-20℃)
将液体培养物或从琼脂斜面培养物收获的细胞分接 到试管或指管肉，然后贮藏于一冰箱的冷藏室中， 或于温度范围在-5～-20℃的普通冰箱(-20℃)中。 或者，将菌种培养在小的试管或培养瓶斜面上，待 生长适度后，将试管或瓶口用橡胶塞严格封好，同 上置于冰箱中保存。 用此方法可以维持若干微生物的活力1—2年。
对于一些比较重要的微生物菌株，则要尽可能 多的采用各种不同的手段进行保藏，以免因某种方 法的失败而导致菌种的丧失。
国际重要菌种保藏机构
缩写
名称
ATCC 美国标准菌种保藏所，美国马里兰州，罗克维尔市
CBS 真菌中心收藏所，荷兰，巴尔恩市
NCT 国立标准菌种保藏所，英国，伦敦 C
中国菌种保藏单位
缩写
一、微生物菌种保藏
基本要求：
在一定时间内使菌种不死、不变、不乱
基本方法：
生活态
培养基传代培养 斜面、平板 寄主传代培养
休眠态
冷冻 干燥
液氮、低温冰箱 沙土管、冷冻真空干燥
由于微生物的多样性，不同的微生物往往对不 同的保藏方法有不同的适应性，因此，在具体选择 保藏方法时必须对被保藏菌株的特性、保藏物的使 用特点及现有条件等进行综合考虑。
三、液氮冷冻保藏技术
(一)冷冻保护剂
在液氮冷冻保藏中，最常用的冷冻保护剂是 二甲亚砜和甘油，最终使用浓度一般为甘油 10％、二甲亚砜5％。所使用的甘油—般用高 压蒸汽灭菌，而二甲亚砜最好为过滤灭菌。
(二)液氮冷冻保藏微生物菌种的步骤
1．待冷冻保藏菌种悬液的制备
(1)从生长斜面制备菌悬液：每一斜面加入5ml含 10％甘油的营养液体培养；用巴氏吸管吹吸斜面制 成孢子及菌体细胞悬液；0.5～lml分装玻璃安瓿或 液氮冷藏专用塑料瓶。
液体石蜡法 甘油管法 砂管保藏法 砂土管保藏法 滤纸片保藏法 冷冻干燥保藏法 液氮冷冻法
2.1 冷冻保藏
冷冻保藏为保藏微生物菌种的最简单而有效的 方法。 通过冷冻，使微生物代谢活动停止。一般而言， 冷冻温度愈低，效果愈好。为了获得满意的冷 冻结果，通常应在培养物中加入一定的冷冻保 护剂。冷冻保藏时温度要求在-20℃以下，同 时应认真掌握好冷冻速度和解冻速变。 冷冻深藏的缺点之一是培养物运输较困难。
5.抗菌素菌种保藏管理中心(CACC) 中国医学科学院抗菌素研究所,北京(IA),100050 四川抗菌素工业研究所,成都(SIA),610051:新抗菌素菌种 华北制药厂抗菌素研究所,石家庄(IANP),050015:生产用抗菌素菌种
6.兽医微生物菌种保藏管理中心(CVCC) 农业部兽医药品监察所,北京(CIVBP),100081
应注意的是经过一次解冻的菌株培养物不宜再 用来保藏。
保藏过程中应注意控制保藏温度，培养瓶或试 管应严格密封。
这一方法虽简便易行，但不适宜多数微生物的 长期保藏。
二、超低温冷冻保藏技术(-60一-80℃)
要求长期保藏的微生物菌种，一般都要求在-60℃以 下进行保藏。 在超低温冷藏柜中保藏菌种的一般方法是：
1．离心收获对数生长中期至后期的微生物细胞； 2．用新鲜培养基重新悬浮所收获的细胞； 3．加入等体积的20％甘油或10％二甲亚砜； 4．混匀后分装入冷冻指管或安瓿中，于-70℃超 低温冰箱中保藏。
如果待保藏菌种生长在斜面上，则可用含10％ 甘油的新配制液体培养基洗涤收获。超低温冰 箱的冷冻速度一般控制在1-2℃／min。若干细 菌和真菌菌种可通过此保藏方法保藏5年而活 力不受影响。
CAF
中国林业科学院菌种保藏管 理中心
CICC
工业微生物菌种保藏管理中心
IFFI
轻工业部食品发酵藏管理中心
ID
中国医学科学院皮肤病研究 所
NICPB
卫生部药品生物制品监察所
IV 中国医学科学院病毒研究所 CVCC 兽医微生物菌种保藏管理中心
CIVBP 中国兽医药品监察所
7.林业微生物菌种保藏管理中心(CFCC)
中国林业科学院,北京(CAF),100091
二、工业微生物菌种保藏技术
(1)超低温或在液氮中冷冻保藏； (2)冷冻干燥或真空干燥保藏； (3) 转接培养或斜面传代保藏； (4)土壤或陶瓷珠等载体于燥保藏。
菌种保藏方法
暂时保藏法
斜面传代法 穿刺法
长期保藏法