下载文档原格式
荧光分光光度法荧光分光光度法测定维生素B6的含量荧光分光光度法测定维生素B6的含量荧光分光光度计是用于扫描液相荧光标记物所发出的荧光光谱的一种仪器。
其能提供包括激发光谱、发射光谱以及荧光强度、量子产率、荧光寿命、荧光偏振等许多物理参数,从各个角度反映了分子的成键和结构情况。
通过对这些参数的测定, 不但可以做一般的定量分析, 而且还可以推断分子在各种环境下的构象变化, 从而阐明分子结构与功能之间的关系。
荧光分光光度计的激发波长扫描范围一般是190-650nm，发射波长扫描范围是200-800nm。
可用于液体、固体样品（如凝胶条）的光谱扫描。
荧光分光光度计的工作原理：物质荧光的产生是由在通常状况下处于基态的物质分子吸收激发光后变为激发态, 这些处于激发态的分子是不稳定的,在返回基态的过程中将一部分的能量又以光的形式放出，从而产生荧光．不同物质由于分子结构的不同,其激发态能级的分布具有各自不同的特征，这种特征反映在荧光上表现为各种物质都有其特征荧光激发和发射光谱；，因此可以用荧光激发和发射光谱的不同来定性地进行物质的鉴定。
在溶液中，当荧光物质的浓度较低时,其荧光强度与该物质的浓度通常有良好的正比关系,即IF=KC,利用这种关系可以进行荧光物质的定量分析,与紫外-可见分光光度法类似，荧光分析通常也采用标准曲线法进行。
荧光分光光度计基本结构：①光源：为高压汞蒸气灯或氙弧灯，后者能发射出强度较大的连续光谱，且在300nm～400nm 范围内强度几乎相等，故②激发单色器：置于光源和样品室之间的为激发单色器或第一单色器，筛选出特定的激发光谱。
③发射单色器：置于样品室和检测器之间的为发射单色器或第二单色器，常采用光栅为单色器。
筛选出特定的发射光谱。
④样品室：通常由石英池(液体样品用)或固体样品架(粉末或片状样品)组成。
测量液体时，光源与检测器成直角安排；测量固体时，光源与检测器成锐角安排。
⑤检测器：一般用光电管或光电倍增管作检测器。
荧光分光光度法一、实验目的1、学习荧光分光光度法的基本原理；2、学习荧光光谱仪的结构和操作方法；3、学习激发光谱、发射光谱曲线的绘制方法。
二、实验原理荧光分光光度法（fluorescence spectroscopy, FS）通常又叫荧光分析法，具有灵敏度高、选择性强、所需样品量少等特点，已成为一种重要的痕量分析技术。
荧光（fluorescence）是分子吸收了较短波长的光（通常是紫外光和可见光），在很短的时间内发射出比照射光波长较长的光。
由此可见，荧光是一种光致发光。
任何荧光物质都有两个特征光谱，即激发光谱（excitation spectrum）和发射光谱（emission spectrum）或称荧光光谱（fluorescence spectrum）。
激发光谱表示不同激发波长的辐射引起物质发射某一波长荧光的相对效率。
绘制激发光谱时，将发射单色器固定在某一波长，通过激发单色器扫描，以不同波长的入射光激发荧光物质，记录荧光强度对激发波长的关系曲线，即为激发光谱，其形状与吸收光谱极为相似。
荧光光谱表示在所发射的荧光中各种波长的相对强度。
绘制荧光光谱时，使激发光的波长和强度保持不变，通过发射单色器扫描以检测各种波长下相应的荧光强度，记录荧光强度对发射波长的关系曲线，即为荧光光谱。
激发光谱和荧光光谱可用于鉴别荧光物质，而且是选择测定波长的依据。
荧光强度（F）是表征荧光发射的相对强弱的物理量。
对于某一荧光物质的稀溶液，在一定波长和一定强度的入射光照射下，当液层的厚度不变时，所发生的荧光强度和该溶液的浓度成正比，即FKc该式即荧光分光光度法定量分析的依据。
使用时要注意该关系式只适用于稀溶液。
三、仪器与试剂F-4500荧光光谱仪；比色管（10mL）；牛血清白蛋白（BSA）四、实验内容1、开机准备：接通电源，启动电脑。
打开光谱仪主机电源，预热15分钟。
2、运行FL solution软件，设定检测方法和测量参数：EX（激发波长）：280nmEM（发射波长）：340nmEX扫描范围：210nm～330nmEM扫描范围：290nm～450nmEX缝宽：2.5nm，EM缝宽：2.5nm扫描速度：240nm/minPMT电压：700V3、激发光谱和发射光谱的绘制：先固定激发波长为280nm，在290～450nm测定荧光强度，获得溶液的发射光谱，在343nm附近为最大发射波长λem；再固定发射波长为λem，测定激发波长为200nm～λem 时的荧光强度，获得溶液的激发光谱，在280nm附近为最大激发波长λex。
荧光分光光度法测定维生素 B2的含量维生素B2（核黄素）是一种黄色的水溶性维生素，参与人体多种代谢过程，如能量代谢、蛋白质合成及细胞呼吸等。
因此，对维生素B2的含量进行精确测量至关重要。
本文将介绍一种常用的荧光分光光度法测定维生素B2含量的方法。
一、测定原理荧光分光光度法是一种基于物质吸收光谱和荧光光谱的仪器分析法，它利用物质在受激光或外界光源激发下，发生荧光的特性来测定物质的含量。
维生素B2在紫外光530.0nm 处吸收，同时能在pH8.0的碳酸氢钠缓冲溶液中产生荧光。
因此，荧光分光光度法可以通过测定维生素B2产生的荧光强度来计算其含量。
二、测定步骤1.准备样品将要测定的维生素B2溶于50mL的碳酸氢钠缓冲液中，并将其均匀混合。
用已知浓度的维生素B2标准品分别配制成不同浓度的标准溶液，用于绘制标准曲线。
2.测定荧光光谱取适量的样品及标准溶液分别装入荧光分光光度计的比色皿中，然后在含有Excitation (Ex)波长为450.0nm、Emission (Em)波长为530.0nm的荧光滤光片下进行测量。
将标样及待测样荧光强度值分别记录下来。
3.制定标准曲线将已知浓度的维生素B2标准溶液按照步骤2测定，绘制标准曲线，根据数据进行回归分析，得出求出待测样品浓度的公式。
4.检测待测样品按照步骤2进行待测样品的测定，利用标准曲线计算出待测样品中维生素B2的含量。
三、测定注意点1.样品配制时要保持一定浓度，过高或过低都会影响分析结果；2.样品制备、实验条件及荧光光度计的使用必须保证一致性；3.测量结果可受色、浑浊等因素影响，需要有一定的操作经验、严守操作规程。
四、结论本文介绍了荧光分光光度法测定维生素B2含量的方法，并简要说明了测定原理及详细的操作步骤。
此种方法具有测量简便、操作方便、灵敏度高等优点，被广泛应用于维生素B2含量的测量。
实验一 荧光分光光度计的使用一、实验目的1.通过实验强化对荧光分光光度法的理解。
2.了解荧光分光光度计的结构和使用方法。
二、实验原理荧光分析法适宜一定强度的激发光经第一单色器分光，选择最佳波长的光去激发液池内的荧光物质。
该物质发出的荧光可射向四面八方，但通过液池后的激发余光是沿直线传播的。
为了准确的进行荧光测定，检测器不能直接对准光源通常在液池的一边，与激发光成直角关系。
1. 荧光激发光谱：将激发荧光的光源用单色器分光，连续改变激发光波长，固定荧光发射波长，测定不同波长激发光下物质溶液发射的荧光强度)(F ，作λ-F 光谱图称激发光谱。
从激发光谱图上可找到发生荧光强度最强的激发波长ex λ，选用 ex λ可得到强度最大的荧光。
2.荧光发射光谱：选择ex λ作激发光源，用另一单色器将物质发射的荧光分光，记录每一波长下的 F ，作 λ-F 光谱图称为荧光发射光谱。
荧光发射光谱中荧光强度最强的波长为em λ。
ex λ与 em λ一般为定量分析中所选用的最灵敏的波长。
三、仪器与试剂1.仪器：Cary Eclipse 型荧光分光光度计2.试剂：核黄素试剂四、实验步骤1.试剂配制：取适量核黄素加水配置成溶液。
将溶液加入荧光比色皿，再将比色皿放入荧光分光光度计中。
2.测定（1）荧光发射光谱打开程序，单击set up，跳出一个窗口，单击Emission，则Excitation 固定，设为350nm。
再将扫描波长设定为400~600nm。
狭缝定为5，单击OK，等Start变绿灯时单击，仪器扫描出图，此为荧光发射光谱。
如下图。
（2）荧光激发光谱打开程序，单击set up，跳出一个窗口，单击Excitation，则Emission 固定，设为370nm。
再将扫描波长设定为200~500nm。
狭缝定为5，单击OK，等Start变绿灯时单击，仪器扫描出图，此为荧光激发光谱。
如下图。
五、注意事项1.荧光比色皿四面均透光，用手拿取时应拿棱边，避免碰到透光面。
荧光分光光度法测定维生素B6的含量荧光分光光度法测定维生素B6的含量荧光分光光度计是用于扫描液相荧光标记物所发出的荧光光谱的一种仪器。
其能提供包括激发光谱、发射光谱以及荧光强度、量子产率、荧光寿命、荧光偏振等许多物理参数,从各个角度反映了分子的成键和结构情况。
通过对这些参数的测定, 不但可以做一般的定量分析, 而且还可以推断分子在各种环境下的构象变化, 从而阐明分子结构与功能之间的关系。
荧光分光光度计的激发波长扫描范围一般是190-650nm，发射波长扫描范围是200-800nm。
可用于液体、固体样品（如凝胶条）的光谱扫描。
荧光分光光度计的工作原理：物质荧光的产生是由在通常状况下处于基态的物质分子吸收激发光后变为激发态, 这些处于激发态的分子是不稳定的,在返回基态的过程中将一部分的能量又以光的形式放出，从而产生荧光．不同物质由于分子结构的不同,其激发态能级的分布具有各自不同的特征，这种特征反映在荧光上表现为各种物质都有其特征荧光激发和发射光谱；，因此可以用荧光激发和发射光谱的不同来定性地进行物质的鉴定。
在溶液中，当荧光物质的浓度较低时,其荧光强度与该物质的浓度通常有良好的正比关系,即IF=KC,利用这种关系可以进行荧光物质的定量分析,与紫外-可见分光光度法类似，荧光分析通常也采用标准曲线法进行。
荧光分光光度计基本结构：①光源：为高压汞蒸气灯或氙弧灯，后者能发射出强度较大的连续光谱，且在300nm～400nm 范围内强度几乎相等，故较常用。
②激发单色器：置于光源和样品室之间的为激发单色器或第一单色器，筛选出特定的激发光谱。
③发射单色器：置于样品室和检测器之间的为发射单色器或第二单色器，常采用光栅为单色器。
筛选出特定的发射光谱。
④样品室：通常由石英池(液体样品用)或固体样品架(粉末或片状样品)组成。
测量液体时，光源与检测器成直角安排；测量固体时，光源与检测器成锐角安排。
⑤检测器：一般用光电管或光电倍增管作检测器。
可将光信号放大并转为电信号。
荧光分光光度计是用于电子扫描液相荧光标志物所拍发的荧光光谱的一种摄谱仪。
应用于科学研究、化工、医疗药品、生化、环保和临床检验、食物检验、讲授实验等领域。
本次实验所用样品维生素B6（vitamin B6），又称吡哆素。
是一种水溶性维生素，遇光或碱易破坏，不耐高温。
一种含吡哆醇或吡哆醛或吡哆胺的B族维生素。
1936年定名为维生素B6。
维生素B6为无色晶体，易溶于水及乙醇，在酸液中稳定，在碱液中易破坏，吡哆醇耐热，吡哆醛和吡哆胺不耐高温。
维生素B6在酵母菌、肝脏、谷粒、肉、鱼、蛋、豆类及花生中含量较多。
维生素B6为人体内某些辅酶的组成成分，参与多种代谢反应，尤其是和氨基酸代谢有密切关系。
临床上应用维生素B6制剂防治妊娠呕吐和放射病呕吐。
维生素B6及其辅酶的结构式1 实验仪器与试剂1.1 仪器荧光分光光度计（RF-5301PC,日本岛津）、电子天平（AL204，梅特勒-托利多仪器（上海）有限公司METTLER TOLEDO）、微孔滤膜（尺寸25mm，孔径0.8μ，上海半岛实业有限公司净入器材厂）1.2 试剂片（10mg/片，新疆西域药业有限公司，批号10020402）：取20片维生素B6称重，并研磨成粉，备用，计算得药粉的平均片重为73.93/mg。
贮备液溶液（195.4μg/ml，实验室提供）维生素B6盐酸(0.01mol/ml，实验室提供)2 方法与结果2.1 方法2.1.1 标准溶液制备维生素B2的浓度线性范围为2μg/ml-10μg/ml，储备液的浓度为194.4μg/ml。
故分别移取0.25ml、0.50ml、0.75ml、1.00ml和1.25ml储备液。
用盐酸(0.01mol/ml）稀释至25ml即得。
2.1.2 样品溶液制备平行称量样品10.14mg、10.62mg、10.76mg，分别用盐酸溶液溶解，定容至25ml容量瓶中，再分别移取3ml稀释至25ml即得。
2.1.3 确定激发、发射波长根据UV光谱确定激发波长λex和发射光谱的范围，固定激发波长，再选定范围扫描发射光谱；再根据发射光谱确定发射波长λem和激发光谱的范围，固定发射波长，在选定范围扫描激发光谱。
最终确定激发波长与发射波长。
激发光谱与发射光谱图见图1、图2。
荧光定量分析维生素B的参数设定：激发波长λex＝290nm，发射波长λem6＝386nm，狭缝宽度(3,3)，纵坐标扩展0-200。
2.1.4 测量设定好参数后，转换进入计算模式。
重新进行空白调零，分别对5个不同浓度的标准溶液进行3次平行检测。
再将样品溶液过滤后进行荧光检测，同样平行测量3次。
图1 维生素B6激发光谱图2 维生素B6发射光谱2.2. 方法学研究2.2.1标准曲线的建立分别精密量取该维生素B6储备液（194.4μg/ml）0.25、0.50、0.75、1.00、1.25ml置25ml容量瓶中，加盐酸溶液(0.01mol/ml)稀释至刻度，摇匀，即得系列浓度的对照品溶液，照荧光分光光度法，在上述条件下测定荧光强度F，分别测3次，取平均值，以荧光强度（F）对浓度（C）回归处理，得标准曲线和回归方程。
表1 标准曲线实验编号浓度（μg/ml）F1 F2 F3F（平均值）RSD%1 1.954 158.302 157.140 157.406 157.616 0.49712 3.908 266.392 265.242 263.602 265.079 1.14453 5.862 398.063 395.364 392.663 395.363 2.20454 7.816 455.308 453.260 450.710 453.093 1.88095 9.770 524.874 524.026 521.300 523.412 1.5247图3 维生素B6的浓度与荧光强度的标准曲线在2μg/ml-10μg/ml浓度范围内，维生素B6的浓度与荧光强度成线性，标准曲线方程：F=47.063C+83.0308，相关系数：r=0.9883。
2.2.2 精密度试验分别精密量取该维生素B6储备液（194.4μg/ml）0.25、0.5、0.75ml 置25ml容量瓶中，加盐酸溶液(0.01mol/ml)稀释至刻度，摇匀即得，照荧光分光光度法，在上述条件下测定荧光强度F。
平行操作3份。
表2 精密度实验浓度（μg/ml）荧光强度F 测定浓度（μg/ml）均值±RSD16.2832.5748.852.2.3 回收率实验本底值加入量测得值回收率平均值±RSD 高浓度 1.954ug/ml 2.954ug/ml中浓度 3.908ug/ml 4.908ug/ml低浓度 5.826ug/ml 6.826ug/mlF1F2F3F平均值浓度（μg/ml）计算质量（mg）标示量%417.458 417.518 415.053 416.676 7.089 1.477 107.7 418.543 415.743 414.332 416.206 7.079 1.475 102.6 448.587 448.309 446.397 447.764 7.752 1.615 110.9 计算标示量百分含量的RSD%=3.43，平均标示量B%=107.1%。
药典规定制剂规格范围为95%-105%，所以该药品不合格。
3 讨论（1）溶剂能够影响荧光效率, 改变荧光强度，测定时必须采用同一溶剂, 实验标准溶液和样品溶液都采用盐酸作为溶剂。
（2）荧光强度与分子结构的关系：①共轭体系越大，离域大，π键的电子越易激发，荧光越易产生；②荧光物质的刚性和平面性越强，越有利于荧光发射；③给电子取代基加强荧光，吸电子取代基减弱荧光。
④在一定浓度范围内，随着溶液浓度增大，荧光强度增强，超过此范围，浓度的增大，荧光强度反而下降，这是由于荧光试剂浓度增大发生的自猝灭现象。
（3）影响荧光强度的因素除了浓度因素外，还有温度、溶剂、溶液pH、猝灭剂等。
样品在低温下测定，灵敏度提高，因为介质黏度增大，分子间相互碰撞减少；荧光物质在不同溶剂中，介电常数增大λem长移，极性增加，荧光强度增大；pH对酸碱性化合物的荧光强度有很大影响。
（4）样品回收率实验是对检测方法学的考察，目的是衡量检测器的准确性。
原理是对检测液中加入已知量的待测物。
测得值减去本底值，从而计算出加入量。
用检测得到的量比实际的加入量，所得值即为回收率。
通常设定高中低三个剂量组，一般选择线性范围内的1/3,1/2,2/3处浓度值为检测量。
分别进行三次实验，对高中低三个剂量组的方法合理性进行考察。
注意供试品溶液浓度应在线性范围内，中浓度中供试品与对照品的量约为1:1，中间浓度溶液一半的浓度为本底浓度。
（5）维生素B6易发生光降解，应避光保存。
本次实验样品可能是由于长时间未避光保存导致检测结果不合格。
（6）室内温度较高可能降低荧光效率和荧光强度。
（7）溶剂的拉曼光对荧光测定也有一定的影响，应根据溶剂拉曼光的波长，选择合适的激发光波长，以消除拉曼光的干扰。
