网织红细胞计数 (2)

一、实训背景网织红细胞是红细胞前体，其计数对于评估骨髓造血功能和红细胞生成情况具有重要意义。

本实训旨在通过学习网织红细胞计数的操作方法，掌握其计数原理和注意事项，提高对血液学检验的认识和技能。

二、实训目的1. 了解网织红细胞计数的基本原理和操作方法。

2. 掌握显微镜下观察和计数网织红细胞的技术。

3. 学会分析网织红细胞计数结果，并应用于临床实践。

三、实训内容1. 网织红细胞计数原理网织红细胞计数是通过染色技术将网织红细胞与成熟红细胞区分开来，然后进行计数。

常用的染色剂有煌焦油蓝、新亚甲蓝等。

染色后，网织红细胞呈现蓝绿色网状或点粒状物质，而成熟红细胞则呈红色。

2. 网织红细胞计数操作方法（1）制备血涂片：取新鲜血液2滴，加入10g/L煌焦油蓝生理盐水溶液2滴，立即混匀，置37℃下15～20分钟。

（2）制片：取1小滴制成薄血涂片，自然干燥。

（3）染色：将染好的血涂片放入染色缸中，用染液染色5～10分钟。

（4）观察：在低倍镜下选择红细胞分布均匀的部位进行观察。

（5）计数：在油镜下计数至少1000个红细胞中的网织红细胞数。

（6）计算：网织红细胞分数 = 计数的网织红细胞数 / 1000网织红细胞绝对值 = 红细胞数× 10^12 / L × 网织红细胞分数3. 注意事项（1）染色时间要适中，过长或过短都会影响计数结果。

（2）观察时要选择红细胞分布均匀的部位，避免计数误差。

（3）计数时要仔细区分网织红细胞与HbH包涵体。

（4）计算时要确保数值准确。

四、实训结果与分析本次实训，我们按照操作步骤进行了网织红细胞计数，并计算出网织红细胞分数和绝对值。

通过对计数结果的分析，我们了解到患者的骨髓造血功能和红细胞生成情况。

五、实训总结通过本次实训，我们掌握了网织红细胞计数的操作方法，了解了其计数原理和注意事项。

同时，我们也认识到，在实际操作中，要严格按照操作步骤进行，确保计数结果的准确性。

此外，我们还学习了如何分析计数结果，并将其应用于临床实践。

网织红细胞计数（Ret）【定义】网织红细胞是晚幼红细胞脱核后到完全成熟红细胞间的过渡细胞，属于尚未完全成熟的红细胞，其胞质中残存嗜碱性物质核糖核酸（RNA），经活体染色后，嗜碱性物质凝聚成蓝黑色颗粒，颗粒与颗粒连缀成线，线连接成网，故而得名。

【分型】根据网织红细胞发育阶段分为4型，分别是：Ⅰ型（丝球型）：红细胞充满网状物，见于骨髓。

Ⅱ型（网型）：红细胞网状物结构松散，见于骨髓。

Ⅲ型（破网型）：红细胞网状物结构稀少，呈不规则枝点状排列，见于外周血。

Ⅳ型（点粒型）：红细胞内为分散的细颗粒、短丝状网状物，见于外周血。

【检测原理】1.普通光学显微镜法2.网织细胞计数仪法和血液分析仪法【操作方法】1.显微镜试管法操作（1）加染液：于试管中加入10g/L煌焦油蓝生理盐水溶液2滴，再加新鲜血2滴，立即混匀，置37℃下15～20min。

（2）制片：取1小滴制成薄血涂片，自然干燥。

（3）观察：在低倍镜下选择红细胞分布均匀的部位进行观察。

（4）计数：在油镜下计数至少1000个红细胞中网织红细胞数。

（5）计算：网织红细胞分数=（计数的网织红细胞数）/1O00，网织红细胞绝对值（×109/L）=红细胞数×1012/L×网织红细胞分数。

2.显微镜法注意事项（1）网织红细胞必须活体染色，WH0推荐使用新亚甲蓝染液，其染色力强且稳定。

煌焦油蓝染液操作简单、费用低廉，但易产生沉淀、工作效率不高、精度差。

染液与血液比例以1:1为宜，严重贫血时，可适量增加血量。

（2）为提高网织红细胞计数精度和速度，ICSH推荐使用Miller窥盘，方法是将Miller 窥盘置于目镜内，选择红细胞散在且分布均匀的部位（3）用小方格（A）计数红细胞，大方格（B）计数网织红细胞，按下式计算：（4）注意鉴别网织红细胞与HbH包涵体。

Ret为蓝绿色网状或点粒状物质，分布不均，HbH包涵体为蓝绿色圆形小体，均匀散布于整个红细胞内。

网织红细胞计数操作规程目的：本实验旨在规范网织红细胞计数的标准操作，以确保实验数据的准确性。

原理：网织红细胞是未完全成熟的红细胞，其包体较一般红细胞稍大，胞浆中尚有嗜碱性残留物质，可被煌焦油蓝等染成蓝色颗粒状、线状及网状结构物。

网织红细胞的数量可用百分率或每立方毫米血液中的绝对值数来表示。

材料：煌焦油蓝（灿烂甲酚蓝）、枸橼酸钠、生理盐水、香柏油、载物片（玻璃片）、推片（磨去边的玻璃片）、试管（2ml）、毛细吸管或枪头（200微升）、光学显微镜。

操作规程：染色液配制：将煌焦油蓝0.4g和3.5%枸橼酸钠20ml研磨溶解后加入生理盐水至100ml，过滤备用。

室温下可保存6个月。

血膜片制备：1.染色：取试管一支，用毛细管或枪头于其中加入染液2～5滴，然后再加入新鲜血液1滴轻摇混合，染色10～15min。

2.制片：取载物片一片，用毛细管或枪头吸取血液染色液1小滴于载物片上，并用推片约45度角推制成舌型血膜片，自然干燥备用。

3.观察：用显微镜观察，取血膜片滴入香柏油1滴，将血膜片置于显微镜载物台，用油镜观察网织红细胞。

4.计数：取计数器在油镜下检查计数红细胞，即计数红细胞中网织红细胞的数量，检查计数1000个红细胞中网织红细胞的数量，并得出千分率再除以10即为百分率。

计算公式：百分率=1000个红细胞中网织红细胞的数量/1000注意事项：1.载物片使用前必须经过酸或碱液浸泡脱脂处理后方可使用。

2.血膜片制备需要反复练推片，熟练推制血膜片的技巧。

3.血膜片的厚薄要适中，过厚或过薄均无法进行观察。

4.室温过低时，血液染色时间要适当延长，以确保细胞着色更充分。

5.血膜片需在3天内检查计数，否则其网状结构会褪色，不易观察清晰。

10-网织红细胞计数B D I S R et i c-C O U N T（Thi azol e O r ange）Catalog No. 349204简介早期红细胞细胞核丢失后，胞浆内仍残留有细胞器（如核糖体、线粒体），这样的早期红细胞就是网织红细胞，它有别于不含细胞器的成熟红细胞。

这些细胞器富含核酸物质（RNA和DNA），而在成熟红细胞中不含有此种物质。

正常人（非贫血者）中，网织红细胞在骨髓中三天成熟，第四天出现在外周循环血中。

网织红细胞计数可以评估红细胞造血系统活性，但是如果网织红细胞的骨髓成熟时间缩短而循环血成熟时间延长，这种评估方法就会有误差。

这时，外周血相中一至三天的网织红细胞（“漂移”网织红细胞）也会被当做第四天网织红细胞而计算在内。

如遇此种情况，应当对“漂移”网织红细胞做修正（修正公式见流式细胞仪分析一节）。

BD公司生产的Retic-COUNT试剂主要成分为噻唑橙（TO），与丫啶橙（AO）的作用类似。

TO 与DNA碱基对以1:2的比例结合，分解常数、正电荷数和膜通透性与AO相近。

Retic-COUNT试剂既可与DNA结合，也可与RAN结合，形成的荧光-核酸复合物，吸收光谱为475nm，荧光发射光谱为530nm，因此，适合在安装了488nm激光的流式细胞仪上使用，如FACSCalibur，FACSort，FACScan等。

网织红细胞计数的传统方法是使用新亚甲基蓝染料，染色涂片后，光镜下计数。

但此方法费时，且由于只计数1000个细胞，因而存在固有的取样误差。

使用Retic-COUNT流式细胞术方法进行网织红细胞计数，与传统的新亚甲基蓝方法相比，存在很多优势。

使用流式细胞术，可以检测上万个细胞，具有很好的取样精确性。

由于使用的是细胞悬液，可以消除涂片时的分布误差。

同时，它还具有省时、操作简便等优点。

另外，由于可以使用配套的Retic-COUNT自动软件，不需要做阴性对照，还可以减少操作的变异性。

网织红细胞计数标准操作程序1.检验目的通过对网织红细胞计数，判断机体造血功能的旺盛程度。

2.检验原理网织红细胞是尚未完全成熟的红细胞，其胞质内尚有嗜碱性的RNA物质，经新亚甲蓝或煌焦油蓝活体染色后呈浅蓝色或深蓝色网状结构。

3.标本ETDA-K2抗凝血或新鲜外周血。

4.试剂新亚甲蓝枸橼酸氯化钠染色液。

5.操作步骤5.1在小试管中加入染色液2滴；再加入静脉血（或末梢血）2滴，混匀后放置37℃恒温水箱中。

5.2 温育15分钟后取1滴混悬液制成涂片。

5.3在油镜下直接观察1000个红细胞中Ret数。

6.结果计算直接观察法：网织红细胞比例=计数1000个红细胞中的网织红细胞数/10007.生物学参考区间网织红细胞比例：成年人：0.005~0.015；新生儿：0.03~0.06；儿童:0.005~0.015。

8.实验室解释8.1增加表示骨髓造血功能旺盛。

见于各类增生性贫血，溶血性贫血增加尤为显著；巨幼细胞贫血、缺铁性贫血分别应用维生素B12、叶酸或铁剂治疗后显著增多，表示有治疗效果；也是放疗和化疗以及骨髓移植和EPO治疗后骨髓造血功能恢复的指标。

8.2减少常见于骨髓增生受抑抑制、再生障碍性贫血和纯红细胞再生障碍。

9.变异的潜在来源标本应在4小时内进行处理。

置于清洁的棕色瓶中保存，染色液应无沉淀。

新亚甲蓝染料为WHO所推荐，着色强且稳定，背景清晰，利于计数；室温<15℃时，放37℃恒温水箱；用瑞士-吉姆萨染液复染后，可使Ret计数结果减少。

10.参考文献10.1尚红、王毓三、申子瑜《全国临床检验操作程序》，第四版，人民卫生出版社。

最新血细胞分析仪的应用，为网织红细胞计数提供了更进的测试手段。

这类仪器采用荧光染色和激光测量的原理，不但能客观地测量大量网织红细胞，而且还能将其分为高荧光强度、中荧光强度、低荧光强度三类，这种分类法对估计化疗后骨髓造血功能的恢复及骨髓移植效果有较重要的意义。

[方法学评价] 由于玻片法容易使混合血液中的水分蒸发，染色时间偏短，因此结果偏低。

试管法容易掌握，重复性效好，必要时还可以从混合血液中再取标本重新涂片复查，避免再次给被检者穿刺造成不必要的痛苦，被列为手工法网织红细胞计数的方法。

近年来，国内使用米勒窥盘进行计数，规范了计算区域，减少了实验误差，使结果准确性有所提高。

目前，国外逐步使用网织红细胞仪器法测定大致有流式细胞仪法，网织红细胞计数仪法和多参数血液分析仪法。

流式细胞仪法是将红细胞染色后使含 RNA网织红细胞可被计数，进而得出网织红细胞的百分比和绝对值，此法是只能计数网织红细胞当选目，不能分析其成熟程度，网只红细胞计数仪是专门进行网织红细胞测定的仪器操作简单，只需将抗凝血液吸入仪器内，仪器可自动染色、自动分析，自动找印各阶段网织红细胞的分布图。

结果准确。

仪器法的优点是测量细胞多，避免主观因素，方法易于标准化。

但仪器价格昂贵，尚难以广泛应用。

[参考值] 成人：0.008-0.02或(25-75)×109/L初生儿：0.02-0.06[临床意义]1．网织红细胞计数可以判断骨髓红细胞系统造血情况。

溶血性贫血时由于大量网织红细胞进入血循环，可使网织红细胞高达0.20或更高。

急性失血后5-10天，网织红细胞达高峰。

2周后恢复正常。

典型再生障碍性贫血病例。

网织红细胞百分比常0.005。

网织红细胞数低于5×109/L为诊断再生障碍性贫血的标准之一。

2．网织红细胞可作为疗效观察指标。

凡是骨髓增生功能良好的病人，在给予有关抗贫血药物后，其网织红细胞在1周左右可百家高峰，贫血严重，网织红细胞数升得越高，而且其升高往往在红细胞恢复之前。