血凝试验(HA)及血凝抑制试验(HI)

⾎凝、⾎凝抑制试验红细胞凝集试验（HA）与红细胞凝集抑制试验（HI）⼀、实验⽤设备：1、离⼼机 1台*（3000转离⼼红细胞）2、冰箱 1台*（存放抗原）3、振荡器 1台*（振荡96孔V型板）4、抗原新城疫（ND）、减蛋（EDS）、流感（AI）抗原，从正规⼚家进。

5、96孔V型板稀释⾎清清洗后可重复使⽤6、⼋道移液器 1把（5-50微升稀释⾎清）7、吸头和⼋道移液器配套使⽤，清洗后重复使⽤）8、积液槽配制4个单位抗原及盛放⽣理盐⽔加样⽤9、⼀次性采⾎管采⾎⽤10、2毫升注射器采⾎⽤11、红细胞⾮免疫鸡⼼脏采⾎或免疫鸡也可，但需离⼼5次后使⽤。

12、柠檬酸三钠配制3.8％抗凝剂⽤13、重铬酸钾配制清洁液⽤14、硫酸配制清洁液⽤15、吸管 1毫升、10毫升16、吸⽿球和吸管配套使⽤17、针头 9*13（采雏鸡）、9*25（采⼤鸡）18、蒸馏⽔当地买。

清洗96孔V型板、吸头⽤19、10毫升离⼼管离⼼红细胞⽤（塑料制）20、⽣理盐⽔做⾎清稀释液⽤、配制4单位抗原⼆、实验前的准备：1.抗原：从指定⼚家购买稳定浓缩抗原。

2.抗凝剂的配制：⽤天平称量3.8克柠檬酸三钠，溶⼊100ml⽣理盐⽔中，待溶解完全后即可使⽤。

3.1％红细胞悬液：由鸡⼼脏或翅静脉采⾎，放⼊加有抗凝剂的离⼼管内（按抗凝剂：全⾎＝1：2的⽐例），迅速混匀。

在离⼼机中以3000转/分离⼼5分钟，⽤吸管吸去上清液和红细胞上层的⽩细胞薄膜，将沉淀的红细胞加⽣理盐⽔，慢慢混合均匀，再在离⼼机中3000转/分离⼼5分钟，弃去上清液，再加⽣理盐⽔混匀，如此反复离⼼4～5次，最后⼀次离⼼后的红细胞，弃去上清液，即为红细胞泥。

放⼊4℃冰箱中可保存2—3天。

使⽤时⽤1ml 吸管吸取0.1ml红细胞泥，然后加⼊9.9ml的⽣理盐⽔，此即1%红细胞悬液。

现⽤现配。

4.被检⾎清：每只鸡⼼脏或翼下采⾎0.5-1ml,静置或离⼼，待⾎清析出后备⽤。

5.吸管清洁液的配制：使⽤1%的稀硫酸溶液。

红细胞凝集试验（HA）与红细胞凝集抑制试验（HI）用疫苗按一定免疫程序进行免疫接种是控制鸡病流行的主要途径之一，这种观点已被广大养殖户接受并引起足够重视。

但鸡群免疫抗体的产生及维持时间受到鸡群免疫应答能力、所用疫苗种类、免疫方法、免疫次数、疫病流行状况等方面的影响，良好的免疫接种不等于鸡群能够产生良好的保护力。

因而通过对鸡群进行抗体监测，及时检查鸡群的免疫状态、疫苗使用效果，为制定合理的免疫程序提供依据就显得非常重要。

通过对广大养殖户的大量调查发现，由于缺乏有效的监测手段，养殖户普遍存在盲目免疫的现象。

因此，建立合理的抗体监测制度，开展免疫抗体监测工作，已经成为我们当前养鸡生产中急需开展的一项重要工作。

下面将抗体监测所需设备及监测过程向大家做一说明。

一、实验用设备：1、离心机 1台*（3000转离心红细胞）2、冰箱 1台*（存放抗原）3、振荡器 1台*（振荡96孔V型板）4、抗原新城疫（ND）、减蛋（EDS）、流感（AI）抗原，从正规厂家进。

5、96孔V型板稀释血清清洗后可重复使用6、八道移液器 1把（5-50微升稀释血清）7、吸头和八道移液器配套使用，清洗后重复使用）8、积液槽配制4个单位抗原及盛放生理盐水加样用9、一次性采血管采血用10、2毫升注射器采血用11、红细胞非免疫鸡心脏采血或免疫鸡也可，但需离心5次后使用。

12、柠檬酸三钠配制3.8％抗凝剂用13、重铬酸钾配制清洁液用14、硫酸配制清洁液用15、吸管 1毫升、10毫升16、吸耳球和吸管配套使用17、针头 9*13（采雏鸡）、9*25（采大鸡）18、蒸馏水当地买。

清洗96孔V型板、吸头用19、10毫升离心管离心红细胞用（塑料制）20、生理盐水做血清稀释液用、配制4单位抗原二、实验前的准备：1.抗原：从指定厂家购买稳定浓缩抗原。

2.抗凝剂的配制：用天平称量3.8克柠檬酸三钠，溶入100ml生理盐水中，待溶解完全后即可使用。

3.1％红细胞悬液：由鸡心脏或翅静脉采血，放入加有抗凝剂的离心管内（按抗凝剂：全血＝1：2的比例），迅速混匀。

实验三血凝和血凝抑制实验一、实验目的与要求掌握血凝和血凝抑制实验操作及应用二、实验内容H5亚型猪流感抗体检测与分析三、实验步骤（一）血凝（HA）试验1、用微量移液枪在微量反应板的第一排1-12孔均加入50μLPBS，换枪头；2、吸取50μL抗原，加入第一孔，反复吹打5次混匀；3、从第一孔吸取50μL加入第二孔，吹打混匀吸取50μL加入第三孔，如此稀释至第11孔，从第11孔吸取50μL丢弃，第12孔作为红细胞对照；4、各孔均加入50μL0.5%鸡红细胞悬液（已充分摇匀）；5、轻轻混匀，室温25℃静置20min观察结果；（二）血凝抑制（HI）试验1、血清样品处理：先加150μL胰酶溶液于300μL血清中，56℃水浴灭活30min 后冷却至室温；加900μL高碘酸钾，混合，室温孵育15min；加900μL丙三醇盐溶液，混合，室温孵育15min；加750μL生理盐水混合，4℃保存；2、根据HA试验中测定的HI抗原效价配制4单位抗原；3、在微量反应板第5-8排的2-11孔加入25μLPBS，第12孔加入50μLPBS；4、吸取50μL血清（编号为2-4血清、阳性血清、编号为1-4血清、阴性血清）加入第1孔，混匀后吸取25μL于第二孔，混匀后吸25μL于第三孔，依次稀释至第11孔，第11孔混匀后弃去25μL；5、各排前11孔均加入4单位抗原25μL，第12孔作为红细胞对照，室温下25℃静置30min；6、各孔均加入50μL0.5%的鸡红细胞悬液混匀，轻轻摇匀，室温下25℃静置30min。

四、实验结果及分析血凝（HA）试验，从第三个孔开始显示“滴泪”第一排为阳性对照第二排为阴性对照第三排，血清5-6第四排，血清6-6参考文献[1]GB/T 27535-2011，猪流感HI抗体检测方法[S].。

禽流感血凝（HA）和血凝抑制（HI）试验作业指导书1、血凝（HA）试验（微量法）1.1 材料准备1.1.1 96孔V型微量反应板，微量移液器（配有滴头）。

1.1.2 阿氏（Alsevers)液、鸡红细胞悬液，配制方法见附录B。

1.1.3 pH7.2、0.01mol/L PBS.1.1.4 高致病性禽流感病毒血凝素分型抗原和标准分型血清及阴性血清。

1.2 操作方法1.2.1 血凝(HA)试验（微量法）1.2.1.1 在微量反应板的1孔-12孔均加入0.25mLPBS,换滴头。

1.2.1.2 吸取0.25mL病毒悬液（如感染性鸡胚尿囊液）加入第1孔，混匀。

1.2.1.3从第1孔吸取0..25mL病毒液加入第2孔，混匀后吸取0.25mL加入第3孔如此进行对倍稀释至第11孔，从第11孔吸取0..25mL弃之，换滴头。

1.2.1.4 每孔再加入0.25mLPBS。

1.2.1.5 每孔均加入0.25mL体积分数为1%鸡红细胞悬液（蒋鸡红细胞悬液充分摇匀后加入）见附录B。

1.2.1.6 振荡混匀，在室温（20℃-25℃）下静置40min后观察结果（如果环境温度太高，可置4℃环境下）。

对照孔红细胞将成明显的纽扣状沉到孔底。

1.2.1.7 结果判定：将板倾斜，观察红细胞有无呈泪滴状流淌。

完全血凝（不流淌）的抗原或病毒最高稀释倍数代表一个些宁单位（HAU）2、血凝抑制（HI）试验（微量法）2.1 操作方法2.1.1 根据1.2.1试验结果配制4HUA的病毒抗原。

以完全血凝的病毒最高稀释倍数作为终点，终点稀释倍数除以4即为含4HUA的抗原的稀释倍数。

例如，如果血凝的终点滴度为1:256，则4HAU抗原的稀释倍数应是1:64（256除以4）2.1.2 在微量反应板的1孔-12孔均加入0.25mLPBS,第12孔加入0.05 mLPBS。

2.1.3 吸取0.25mL血清加入第1孔内，充分混匀后吸0.025 mL于第2孔，依次对倍稀释至第10孔，从第10孔吸取0.025 mL 弃之。

实验HA与HI一、实验原理某些病毒（如新城疫病毒，减蛋综合症）能凝集某些动物的红细胞，这种现象虽非抗原抗体，但利用这一现象可检查样品中是否有病毒存在，测病毒滴度，病毒红细胞血凝由于能被相应抗体所抑制，因此可以通过病毒的血凝抑制试验测定抗体的效价。

二、实验试剂与器材1、实验器材小烧杯、电子天平、离心机、离心管、采血针、玻璃棒、微量移液器（50µl）、枪头（50µl）、培养皿、96孔板恒温箱2、实验材料免疫过的鸡3、实验试剂3*1 0.9%生理盐水（200ml）称取1.8gNaCl,溶解于200ml蒸馏水中，即可制成3*2 1%红细胞配制（1）、取抗体凝血，离心（1000~1500rpm,5min）（2）、弃上清，取5ml生理盐水，离心（1000~1500rmp,3~5min）（3）、弃上清，取5ml生理盐水，离心（3000rmp , 3~5mim）（4）、以红细胞体积，加入生理盐水，制成1%浓度3*3 抗体制备（1）、从鸡翅取血，放入离心管中（2000rmp , 3~5min）（2）、吸取上清，即为抗体（黄色清亮）3*4 抗原制备（1）、取新城疫病毒干粉，加生理盐水（灭菌过））、（2）、溶解，即为抗原三、实验步骤1、HA实验步骤（1）、前10孔与第12孔，每孔加50µl生理盐水（2）、第11孔加50µl病毒液，第12孔不加，前10空依次倍比（3）、每孔加入50µl 红细胞（4）、放37 ℃恒温箱20min ，观察结果 2、HI 实验步骤（1）、四单元抗原：取病毒滴度2^n /2^2 ,则取1ml 抗原液，加 入2^(n-2) —1ml 生理盐水。

(2)、前10孔与第12孔每孔加入50µl 生理盐水，第11孔50µl生理盐水12（3）、第11孔加入50µl 抗体，前10孔倍比稀释 （4）、每孔加入50µl 四单位抗原 （5）、放37 ℃恒温箱15min （6）、每孔加入50µl 1%细胞 （7）、放37 ℃恒温箱15min（8）、取出观察，记录抗体效价四、实验结果与分析1、HA实验结果与分析（1）实验结果第7孔（2）分析①第3排，第7列红细胞下滑可能是由于洗板的问题2、HI实验结果与分析(1) 实验结果第9孔（2）实验分析①取血清时，鸡的血脂太高，或者是由于该鸡血液中蛋白质含量偏高、血清黏稠，离心后不易分离。

鸡新城疫血凝（HA）及血凝抑制(H1)试验（一）目的意义：1.掌握血凝试验（HA）与血凝抑制试验（HAI）的基本方法；2.了解HA与HI在新城疫病毒及其它病毒诊断和鉴定中的应用。

(二)基本原理：许多病毒表面具血凝素，具有凝集某些动物或人红细胞的特性，称为血凝现象，可用于鉴定病毒。

血凝现象可以被特异性抗体所抑制，称为血凝抑制现象，利用这种特性可进行血清学试验，称为血凝抑制试验。

（三）器材及试剂:待检病毒:鸡新城疫病毒鸡胚尿囊液；待检血清：抗鸡新城疫病病毒阳性血清；生理盐水、1%鸡红细胞、96孔V形微量血凝板、加样器等。

（四）实验步骤：一、血凝试验（HA） 取96孔板，按以下步骤操作：1、第一排1-12孔各加生理盐水50ul，第二排1-12孔加生理盐水50ul 为红细胞对照；2、吸50ul病毒液于第一排第1孔，混匀后取50ul至第2孔，依次稀释至第12孔，弃去50ul，各孔经倍比稀释后稀释度依次为2-1~2-12 。

3、第一排1-12孔及第二排1-12孔各加1%鸡红细胞50ul，微型震荡器震荡2min混匀。

4、室温静置10-30分，观察结果（见下表）。

1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 121234567891011 对照PBS （ml ）0.25 0.25 0.25 0.25 0.25 0.25 0.25 0.25 0.25 0.25 0.25 0.25↓↘ ↓↘ ↓↘ ↓↘ ↓↘ ↓↘ ↓↘ ↓↘ ↓↘ ↓↘ ↓↘ ↓↘1:5稀释抗原（ml ） 0.25 0.25 0.25 0.25 0.25 0.25 0.25 0.25 0.25 0.25 0.25 0.251%鸡红细胞悬浮液（ml ） 0.25 0.25 0.25 0.25 0.25 0.25 0.25 0.25 0.25 0.25 0.25 0.25作用时间及温度37℃静置40分钟5、结果判定：红细胞对照组红细胞完全沉降，以试验排中能使等量红细胞发生完全凝集的病毒最高稀释倍数，作为病毒的血凝价，即HI 效价，用2n 表示。

鸡新城疫血凝（HA）和血凝抑制（HI）抗体水平测定法1．本次实验的目的和要求掌握鸡新城疫血凝（HA）和血凝抑制（HI）抗体水平测定法，以便检查疫苗使用效果和制定合理免疫程序。

2．实验内容或原理某些病毒(如新城疫病毒，禽流感病毒等)能够与动物的红细胞发生凝集，此即为红细胞凝集现象(HA)。

这种红细胞凝集现象可于病毒悬液中加入特异免疫血清所抑制，即为红细胞凝集抑制试验(HI)。

3．需用的仪器或试剂等动物健康成鸡2-5只，被检鸡15-25只。

器材高压灭菌器、滤纸、试管、试管架、离心机、离心管、三棱针、内径2mm聚乙烯塑料管100cm、酒精灯、石蜡、96孔V型微量凝集试验板、0.025mm微量吸液器、微型振荡器、微量移液器、脱脂棉等。

药剂（1）浓缩抗原；（2）生理盐水或磷酸缓冲盐水（PBS）；（3）Alsever细胞保存液；（4）红细胞悬液；（5）待检血清4．实验步骤(1)发现与鉴定病毒：鸡新城疫和禽流感病毒分离后，这些病毒能凝集鸡的红细胞，又能被特异性的已知免疫血清抑制其凝集反应，即可鉴定此病毒。

(2)诊断病毒性疾病：如取同一发病的动物早期和恢复期血清进行红细胞凝集抑制实验，如抗体效价有4倍以上升高，即有诊断意义。

（3）免疫机体抗体效价的测定：3.鸡新城疫（ND）的HA和HI（1）试验准备①抗原：一般以鸡新城疫Ⅱ系或LaUra系冻干苗作为已知抗原，进行试验。

② 0.7％细胞悬浮液：由鸡翅静脉或心脏采血，放入含有抗凝剂的灭菌试管(按每毫升血加入3.8％灭菌柠檬酸钠0.2毫升做抗凝剂)内，迅速混匀。

如当时不用，可直接采血放入红细胞保存液内(保存液2份，血液1份)于4℃冰箱内可保存两周。

红细胞悬液的配制：将血液注入离心管中，经3000转／分钟，离心5-10分钟，用吸管吸去上清液和红细胞上层的白细胞薄膜，将沉淀的红细胞加稀释液(生理盐水)洗涤。

再用离心机3000转／分钟离心5-10分钟，弃上清，再加稀释液洗涤，如此反复洗涤三次，将最后一次离心后的红细胞泥，按0.7％的稀释度加入稀释液(0.7毫升红细胞泥加99.3毫升稀释液)。