紫外分光光度法测定胃蛋白酶片中蛋白酶活力

生物化学实验3.紫外法测定血清蛋白质的含量.血清转氨酶活性的测定

2、ALT主要存在于肝、肾、心肌、骨骼肌、胰腺、脾、肺、红细胞等组织细胞中,在肝细胞中含量较多，只有极少量释放入血，所以血清中此酶活力很低。当这些组织病变、细胞坏死或通透性增加时，细胞内的此类酶即可大量释放入血液中，使血清中该酶活力显著增高。故测定ALT常作为判断肝脏受损指标。
紫外分光光度法测定蛋白质含量
(二）仪器 722G型可见光分光光度计、恒温水浴箱
四、操作步骤
1.标准曲线的绘制（不做）。 2.血清ALT活力测定取两支试管按下表操作：
试剂（ml）
测定管
空白管
血清
0.1
0.1
ALT底物液
0.5
-
混匀，置37℃水浴保温30min
2,4-二硝基苯肼
0.5
0.5
AL保温20min
(一）试剂 1、0.9%Nacl溶液 2、小牛血清
(二）仪器
754型紫外分光光度计、刻度吸量管、微量移
液器
四、实验步骤
1、稀释血清
准确吸取0.1mL血清，置于50mL容量瓶中，用0.9%Nacl溶液稀释至标准刻度（即500倍）。
2、测定吸光度
检查→开机→预热（30min）→ 设置波长→放入比色皿
由于蛋白质样品中经常混有核酸，其最大吸收峰在260nm处但其在280nm处也有光吸收，可通过公式校正，以消除核酸的影响，而推算出蛋白质浓度。
蛋白质浓度(mg/mL) =（1.45×A280 – 0.74×A260）×500 =（1.55×A280 – 0.76×A260）×500
三、试剂和仪器
二、实验原理
生成的丙酮酸可与2,4二硝基苯肼（起终止和显色作用）发生加成反应，生成丙酮酸-2,4-二硝基苯腙，进而在碱性环境中生成红棕色的苯腙硝醌化合物，其颜色的深浅在一定范围内与丙酮酸的生成量成正比关系。

分光光度法测定蛋白酶酶活

分光光度法测定蛋白酶酶活1适用范围本方法适用于中性蛋白酶、酸性蛋白酶酶活得测定。

2测定原理蛋白酶在一定得温度与pＨ条件下，水解酪素（酪蛋白)底物，产生含有酚基得氨基酸（如:酪氨酸、色氨酸等),在碱性条件下，将福林试剂（Ｆolｉn）还原,生产钼蓝与钨蓝,用分光光度计于波长68０nm下测定溶液吸光度.酶活力与吸光度成正比，由此可以计算产品得酶活力。

酶活单位得定义:每１mL粗酶液，在一定温度与pＨ值条件下,10min水解酪素产生１μｇ酪氨酸为一个酶活力单位，以(u/mL)表示。

3仪器与设备3.1分析天平：精度为0、000１ｇ。

3.2紫外分光光度计.3.3恒温水浴锅:精度±０、2℃。

3.4ＰH计:精度为0、01PH单位.4试剂与溶液除非另有说明，在分析中仅使用分析纯试剂与蒸馏水。

4.1福林（Foliｎ）试剂市售分析纯福林试剂。

4.2福林使用溶液一份福林试剂与两份水混合，摇匀。

4.3碳酸钠溶液（42、4g/L）称取无水碳酸钠(Nａ2ＣＯ3）42、4g，用水溶解并定容至１000mｌ。

4.4三氯乙酸ｃ(ＣCl３COOH）=0、4ｍｏl/L称取三氯乙酸65、4g，用水溶解并定容至１000 mL。

4.5氢氧化钠溶液c(NａOH）=０、5mol/L称取氢氧化钠片剂20、0g，加水900ml并搅拌溶解，待溶液到室温后加水定容至10００ml,摇匀。

4.6盐酸溶液c（HCL)=1 mol/L及０、１ mol/L1 ｍol／L ＨCL:取90mL浓盐酸溶解于蒸馏水中,定容至１000ｍL.0、1 mｏl/ＬHCL:取9mL浓盐酸溶解于蒸馏水中,定容至1０00mL。

4.7缓冲溶液4.7.1磷酸缓冲液(pＨ=７、5,适用于中性蛋白酶)称取磷酸氢二钠(Nａ２HPO4•12H2O）6、02g与磷酸二氢钠（NaH2PO４•1２H2O)0、５g，加水溶解并定容至１０00mL。

4.7.2乳酸缓冲液（pH＝３、0,适用于酸性蛋白酶）甲液：称取乳酸(8０％～90％）10、6g，加水溶解并定容至1000 mL。

分光光度法测定蛋白酶酶活

分光光度法测定蛋白酶酶活1适用范围本方法适用于中性蛋白酶、酸性蛋白酶酶活的测定。

2测定原理蛋白酶在一定的温度与pH条件下，水解酪素（酪蛋白）底物，产生含有酚基的氨基酸（如：酪氨酸、色氨酸等），在碱性条件下，将福林试剂（Folin）还原，生产钼蓝和钨蓝，用分光光度计于波长680nm下测定溶液吸光度。

酶活力与吸光度成正比，由此可以计算产品的酶活力。

酶活单位的定义：每1mL粗酶液，在一定温度和pH值条件下，10min水解酪素产生1μg酪氨酸为一个酶活力单位，以（u/mL）表示。

3仪器和设备3.1分析天平：精度为0.0001g。

3.2紫外分光光度计。

3.3恒温水浴锅：精度±0.2℃。

3.4PH计：精度为0.01PH单位。

4试剂和溶液除非另有说明，在分析中仅使用分析纯试剂和蒸馏水。

4.1福林（Folin）试剂市售分析纯福林试剂。

4.2福林使用溶液一份福林试剂与两份水混合，摇匀。

4.3碳酸钠溶液（42.4g/L）称取无水碳酸钠（Na2CO3）42.4g，用水溶解并定容至1000ml。

4.4三氯乙酸c（CCl3COOH）=0.4mol/L称取三氯乙酸65.4g，用水溶解并定容至1000 mL。

4.5氢氧化钠溶液c（NaOH）=0.5mol/L称取氢氧化钠片剂20.0g，加水900ml并搅拌溶解，待溶液到室温后加水定容至1000ml，摇匀。

4.6盐酸溶液c（HCL）＝1 mol/L及0.1 mol/L1 mol/L HCL:取90mL浓盐酸溶解于蒸馏水中，定容至1000mL。

0.1 mol/L HCL：取9mL浓盐酸溶解于蒸馏水中，定容至1000mL。

4.7缓冲溶液4.7.1磷酸缓冲液（pH＝7.5，适用于中性蛋白酶）称取磷酸氢二钠（Na2HPO4•12H2O）6.02g和磷酸二氢钠（NaH2PO4•12H2O）0.5g，加水溶解并定容至1000mL。

4.7.2乳酸缓冲液（pH＝3.0，适用于酸性蛋白酶）甲液：称取乳酸（80％～90％）10.6g，加水溶解并定容至1000 mL。

紫外分光光度法测蛋白酶酶活

2013/05/13紫外分光光度法测蛋白酶酶活1、原理蛋白酶在一定的温度与pH条件下，水解酪素底物，然后加入三氯乙酸终止酶反应，并使未水解的酪素沉淀除去，滤液对紫外光有吸收，可用紫外分光光度法测定。

根据吸光度计算其酶活力。

酶活单位的定义：每1mL粗酶液，在一定温度和pH值条件下，1min水解酪素产生1ug酪氨酸为一个酶活力单位，以（u/mL）表示。

2、试剂和溶液三氯乙酸、氢氧化钠、盐酸、磷酸氢二钠、磷酸二氢钠、乳酸、乳酸钠、硼酸钠（硼砂）均为分析纯，酪素、酪氨酸为生化试剂。

2.1 三氯乙酸c（CCL3·COOH）=0.4mol/L称取三氯乙酸65.4g，用水溶解并定容至1000 mL。

2.2 氢氧化钠溶液c（NaOH）=0.5mol/L按GB601配制。

2.3 盐酸溶液c（HCL）＝1 mol/L及0.1 mol/L1 mol/L HＣＬ:取90mL浓盐酸溶解于去离子水中，定容至1000mL。

0.1 mol/L HＣＬ：取9mL浓盐酸溶解于去离子水中，定容至1000mL。

2.4 缓冲溶液a、磷酸缓冲液（pH＝7.5）适用于中性蛋白酶称取磷酸氢二钠（Na2HPO4·12H2O）6.02g和磷酸二氢钠（NaH2PO4·12H2O）0.5g，加水溶解并定容至1000mL。

b、乳酸缓冲液（pH＝3.0）适用于酸性蛋白酶甲液称取乳酸（80％～90％）10.6g，加水溶解并定容至1000 mL。

乙液称取乳酸钠（70％）16g，加水溶解并定容至1000 mL。

使用溶液取甲液8 mL，加乙液1 mL，混匀，稀释一倍，即成0.05moi/L乳酸缓冲溶液。

c、硼酸缓冲溶液（pH＝10.5）适用于碱性蛋白酶甲液称取硼酸钠（硼砂）19.08g，加水溶解并定容至1000 mL。

乙液称取氢氧化钠4.0g，加水溶解并定容至1000 mL。

使用溶液取甲液500 mL、乙液400 mL混匀，用水稀释至1000mL。

分光光度法测定蛋白酶酶活知识讲解

分光光度法测定蛋白酶酶活分光光度法测定蛋白酶酶活1适用范围本方法适用于中性蛋白酶、酸性蛋白酶酶活的测定。

2测定原理蛋白酶在一定的温度与pH条件下，水解酪素（酪蛋白）底物，产生含有酚基的氨基酸（如：酪氨酸、色氨酸等），在碱性条件下，将福林试剂（Folin）还原，生产钼蓝和钨蓝，用分光光度计于波长680nm下测定溶液吸光度。

酶活力与吸光度成正比，由此可以计算产品的酶活力。

酶活单位的定义：每1mL粗酶液，在一定温度和pH值条件下，10min水解酪素产生1μg酪氨酸为一个酶活力单位，以（u/mL）表示。

3仪器和设备3.1分析天平：精度为0.0001g。

3.2紫外分光光度计。

3.3恒温水浴锅：精度±0.2℃。

3.4PH计：精度为0.01PH单位。

4试剂和溶液除非另有说明，在分析中仅使用分析纯试剂和蒸馏水。

4.1福林（Folin）试剂市售分析纯福林试剂。

4.2福林使用溶液一份福林试剂与两份水混合，摇匀。

4.3碳酸钠溶液（42.4g/L）称取无水碳酸钠（Na2CO3）42.4g，用水溶解并定容至1000ml。

4.4三氯乙酸c（CCl3COOH）=0.4mol/L称取三氯乙酸65.4g，用水溶解并定容至1000 mL。

4.5氢氧化钠溶液c（NaOH）=0.5mol/L称取氢氧化钠片剂20.0g，加水900ml并搅拌溶解，待溶液到室温后加水定容至1000ml，摇匀。

4.6盐酸溶液c（HCL）＝1 mol/L及0.1 mol/L1 mol/L HCL:取90mL浓盐酸溶解于蒸馏水中，定容至1000mL。

0.1 mol/L HCL：取9mL浓盐酸溶解于蒸馏水中，定容至1000mL。

4.7缓冲溶液4.7.1磷酸缓冲液（pH＝7.5，适用于中性蛋白酶）称取磷酸氢二钠（Na2HPO4•12H2O）6.02g和磷酸二氢钠（NaH2PO4•12H2O）0.5g，加水溶解并定容至1000mL。

4.7.2乳酸缓冲液（pH＝3.0，适用于酸性蛋白酶）甲液：称取乳酸（80％～90％）10.6g，加水溶解并定容至1000 mL。

紫外可见分光光度计法测定郫县豆瓣制曲过程中的蛋白酶活力

紫外可见分光光度计法测定郫县豆瓣制曲过程中的蛋白酶活力李璘佼,车振明3(西华大学生物工程学院,成都　610039)摘要:文章对紫外可见分光光度计法测定郫县豆瓣制曲过程中的蛋白酶活性进行了详述。

以蛋白酶的活力为指标,最终确定郫县豆瓣最佳制曲条件:制曲温度34℃、制曲时间3d、曲精量∶豆瓣量为1∶6666。

关键词:郫县豆瓣;蛋白酶活性;紫外分光光度计;制曲条件中图分类号:TS201.25 文献标识码:B 文章编号:1000-9973(2009)05-0098-03 Activity of protea se determination method for Pixian bean sauce starter propagation with UV2Visible sp ectrophotometerL I Lin2jiao,C H E Zhen2ming3(School of Bioengineering of Xi hua University,Chengdu610039,China)Abstract:The activity of protease determination met hod for pixian bean sauce starter propagation wit h UV2Visible spectrop hotometer has been p ro bed in t he article.t he activity of protease just as a norm,which make sure t he best factors of Pixian bean sauce starter propagation:temperat ure is 34℃;time is3d;t he proportion of Aspergillus oryzae and bean is1∶6666.Key words:Pixian bean sauce;t he activity of protease;UV2Visible pect rop hotometer;factors of starter p ropagation 郫县豆瓣属发酵调味品,具有二百余年悠久历史[1]。

紫外分光光度法测定蛋白质浓度的原理

紫外分光光度法测定蛋白质浓度的原理介绍紫外分光光度法是常用的一种测定蛋白质浓度的方法。

本文将详细介绍紫外分光光度法的原理以及其在蛋白质浓度测定中的应用。

紫外分光光度法原理紫外分光光度法利用蛋白质溶液对紫外光的吸收特性进行测量，从而确定蛋白质的浓度。

蛋白质分子中的色氨酸（Trp）、苯丙氨酸（Phe）和酪氨酸（Tyr）等芳香族氨基酸在紫外光区域具有吸收峰，通过测量吸光度可以间接测定蛋白质的浓度。

实验步骤以下是使用紫外分光光度法测定蛋白质浓度的一般实验步骤：1. 制备蛋白质样品制备含有待测蛋白质的溶液样品。

确保溶液浓度适中，避免过高或过低浓度对测定结果产生影响。

2. 预热紫外分光光度计打开紫外分光光度计并进行预热，使其达到稳定的工作温度。

3. 校准光程使用标准样品校准紫外分光光度计的光程，确保准确测量待测样品的吸光度。

4. 测定吸光度将待测样品倒入光度池，使用紫外分光光度计测量样品溶液在特定波长下的吸光度。

常用波长为280nm，其对色氨酸具有最大吸收峰。

5. 绘制标准曲线制备一系列已知浓度的蛋白质标准溶液，分别测定它们的吸光度。

利用这些测定值绘制标准曲线，用于计算待测样品的蛋白质浓度。

6. 计算蛋白质浓度根据标准曲线，计算出待测样品的蛋白质浓度。

根据不同的光吸收系数和波长，可以得出不同氨基酸的摩尔吸光系数，再根据摩尔吸光系数进行计算。

紫外分光光度法的优势紫外分光光度法具有以下优势：1.灵敏度高：对浓度较低的蛋白质样品也能够进行准确测量。

2.快速便捷：测量过程简单，不需要复杂操作。

3.非破坏性：样品在测量过程中不受损伤，可以进行进一步的分析。

紫外分光光度法的局限性紫外分光光度法也存在一定的局限性：1.干扰物质：一些样品中可能含有其他吸收波长与蛋白质相近的物质，会对测定结果产生干扰。

2.重复性：在批量测定时，光度池的装填和清洗对结果的重复性有一定影响。

3.波长选择：根据不同蛋白质的吸收特性，选择适当的波长进行测量，否则会导致测定结果不准确。

胃蛋白酶活力测定

胃蛋白酶拼音名：Weidanbaimei英文名：Pepsin书页号：2005年版二部－389本品系自猪、羊或牛的胃黏膜中提取制得的胃蛋白酶。

每1g中含蛋白酶活力不得少于3800 单位。

【性状】本品为白色至淡黄色的粉末；无霉败臭；有引湿性；水溶液显酸性反应。

【鉴别】取本品的水溶液，加鞣酸、没食子酸或多数重金属盐的溶液，即生成沉淀。

【检查】干燥失重取本品，在100 ℃干燥4 小时，减失重量不得过5.0 ％（附录ⅧL）。

【效价测定】对照品溶液的制备精密称取酪氨酸对照品适量，加盐酸溶液〔取1mol/L 盐酸溶液65ml，加水至1000ml 〕制成每1ml 中含0.5mg 的溶液。

供试品溶液的制备取本品适量，精密称定，用上述盐酸溶液制成每1ml 中约含0.2 ～0.4单位的溶液。

测定法取试管6 支，其中3 支各精密加入对照品溶液1ml ，另3 支各精密加入供试品溶液1ml ，置37℃±0.5℃水浴中，保温5 分钟，精密加入预热至37℃±0.5℃的血红蛋白试液5ml ，摇匀，并准确计时，在37℃±0.5℃水浴中反应10分钟。

立即精密加入5%三氯醋酸溶液5ml ，摇匀，滤过，取续滤液备用。

另取试管2 支，各精密加入血红蛋白试液5ml ，置37℃±0.5℃水浴中保温10分钟，再精密加入5％三氯醋酸溶液5ml ，其中1支加供试品溶液1ml ，另1 支加上述盐酸溶液1ml ，摇匀，滤过，取续滤液，分别作为供试品和对照品的空白对照，照紫外-可见分光光度法（附录ⅣA），在275nm 的波长处测定吸光度，算出平均值ＡS和Ａ，按下式计算。

在上述条件下，每分钟能催化水解血红蛋白生成1μmol 酪氨酸的酶量，为一个蛋白酶活力单位。

【类别】助消化药。

【贮藏】密封，在干燥处保存。

【制剂】(1)胃蛋白酶片(2)胃蛋白酶颗粒(3)含糖胃蛋白酶。

分光光度法测定蛋白酶酶活

分光光度法测定蛋白酶酶活1适用范围本方法适用于中性蛋白酶、酸性蛋白酶酶活得测定。

2测定原理蛋白酶在一定得温度与pH条件下,水解酪素(酪蛋白)底物,产生含有酚基得氨基酸(如:酪氨酸、色氨酸等),在碱性条件下,将福林试剂(Ｆolin)还原,生产钼蓝与钨蓝,用分光光度计于波长680nm下测定溶液吸光度。

酶活力与吸光度成正比,由此可以计算产品得酶活力。

酶活单位得定义:每１mL粗酶液,在一定温度与ｐH值条件下,10min水解酪素产生1μg酪氨酸为一个酶活力单位,以(u／ｍL)表示。

3仪器与设备3.1分析天平:精度为0。

0０01g。

3.2紫外分光光度计。

3.3恒温水浴锅:精度±0。

2℃。

3.4PＨ计:精度为0.0１PＨ单位。

4试剂与溶液除非另有说明,在分析中仅使用分析纯试剂与蒸馏水。

4.1福林(Foｌin)试剂市售分析纯福林试剂、4.2福林使用溶液一份福林试剂与两份水混合,摇匀。

4.3碳酸钠溶液(42、4ｇ／L)称取无水碳酸钠(Na2CＯ3)4２.4ｇ,用水溶解并定容至1０0０ml。

4.4三氯乙酸c(ＣCl3COOH)=0、4mｏｌ/Ｌ称取三氯乙酸６５、4g,用水溶解并定容至１000 mL、4.5氢氧化钠溶液ｃ(NaOH)＝0.5ｍol／L称取氢氧化钠片剂２0。

0g,加水90０ml并搅拌溶解,待溶液到室温后加水定容至1000ml,摇匀。

4.6盐酸溶液c(HCL)=1 mol/L及0。

１mol/L1 ｍol/L HＣL:取９０mL浓盐酸溶解于蒸馏水中,定容至1000mＬ。

０、1 ｍol/Ｌ HCL:取9mL浓盐酸溶解于蒸馏水中,定容至100０ｍＬ、4.7缓冲溶液4.7.1磷酸缓冲液(pH＝７。

5,适用于中性蛋白酶)称取磷酸氢二钠(Na２ＨPO4•12Ｈ2Ｏ)6、02ｇ与磷酸二氢钠(NaＨ2ＰO4•1２Ｈ2O)0、5ｇ,加水溶解并定容至1000mL。

4.7.2乳酸缓冲液(ｐH=3。

0,适用于酸性蛋白酶)甲液:称取乳酸(80％～９0％)10、6g,加水溶解并定容至1000 ｍL。

啤酒中蛋白酶A活性的紫外分光光度检测法优化

啤酒中蛋白酶A活性的紫外分光光度检测法优化目前,啤酒行业中蛋白酶A活性检测的方法主要包括紫外分光光度法、Lowry 法、Bradford法、底物荧光法和RLS法(共振散射法),它们都适用于较高蛋白酶A浓度样品的检测。

大量的研究证明,线性范围在为200~2000μg/mL内,紫外分光光度法获得的结果还是可信的,但仍旧有可待完善之处。

结合四川南充燕京啤酒厂的实际情况,本研究主要是针对啤酒中蛋白酶A活性的紫外分光光度检测法进行优化,以期实现对啤酒蛋白酶A活性的快速而又准确的测定。

本报告以9.5°P啤酒(包括鲜啤和普啤)和8°P啤酒(包括鲜啤和普啤)作为研究对象,在采用原有紫外分光光度法检测其蛋白酶A活性时,结果出现随着稀释倍数的增加而吸光值呈现负数、吸光值波动较大以及无法正确确定啤酒中的实际酶活等问题。

因此,本研究分别从空白对照组的更改、最佳波长、反应时长、试剂反应浓度等几个方面对原方法进行优化,最后总结归纳得到改良过后的方法。

其改良方法为:酪素浓度更改为5000mg/L,三氯乙酸的浓度为1.25mol/L,反应时长仍为10min,检测波长仍为275nm。

最后,为了验证改良后的方法是否优于改良前的方法,对酒体稀释2、3、4倍后,分别采用前后两种方法检测蛋白酶A的活性。

结果表明,改良后的方法所测定的吸光值均为正数,计算得到的蛋白酶A酶活接近实际生产啤酒中的蛋白酶A 酶活。

同时,在本文最后,结合自身的研究结果和查阅相关参考文献,对提高啤酒泡沫稳定性这一问题上,在实际生产中的操作以及啤酒储藏等方面提出了相应的建议,并对于今后的发展情况进行了展望。

紫外光谱法定量测定不同种蛋白酶活力的研究

［４］彭崇惠，冯建誊．张锡瑜定转化学分析简明教私ｆＭ）．北』ｉ：北
京大学出版社，１９９３．
（责任编辑：黄小平）
万方数据
０．６
蚕ｎ４
憾芸督０．２
０
图３不同浓度的酪氨酸标准溶液标准曲线
２．３分析结果和比较【４１
取丹麦诺维信公司，卜产的４种蛋白酶作样品分析试验，
并与福林一酚法的测定结果进行比较，结果见表２。
≮罢盖薯嘉鬻擎甚），ｔ１．－Ｉ表２两种测定方法的结果比较
５ｆ１
．ｇ‰－ｔ
ｃ／ｃ
．ｆ，Ｎ｛
２８．８６
６·。蓦：署２９蛋＂１ＴＭ门ＩＩ酶ｔ
本方法与福林一酚法相比较，数据的准确度高，重现性好，且操作简单，广泛适用于市售蛋白酶的活力测定。
［参考文献］
［１］郭勇．酶［程［Ｍ］．北京：Ｉ｛Ｊ闲轻１．、Ｉｐ出版礼．１９９４．｛２］ＺＢＹ４００１８～１９８９．加酶洗涤刹中碱性蛋￡ｆ酶活力的测定ｆｓ］．
［３］冯健雯．紫外吸光光度法测定化妆－Ｉ＾巾术瓜蛋ｆＩ酶的活力［Ｊ１．理化检验一化学分册．２００１，３７（６）：２７７～２７８．
先将酪素溶液放入（４０±ｏ．２）ｏＣ恒温水浴中，预热５ｍｉｎ。然后按下列步骤操作：
收稿日期：２００４—０５—１３作者简介：张寒俊（１９７５一），女，实验师，硕士，主要从事仪器分析课程的教学及相关的科研工作。
万方数据
张寒俊等：紫外光谱法定量测定不同种蛋白酶活力的研究／２００４年■９期
试铃Ａ（夸｜，１）一，加酶液１．００ｍｌ（印＿土‘卜２汽～ｎｆｉ．＋ｎ加二二
本文利用蛋白酶在一定的温度与ｐＨ值条件下，水解酪素底物，水浴６０℃灭酶，然后加入三氯乙酸使未水解的酪素沉淀除去，滤液对紫外光有吸收，可采用紫外光谱法测定。根据吸光度计算蛋白酶活力。本方法采用不同ｐＨ值的磷酸氢二钠和柠檬酸溶液作为缓冲溶液，使繁琐的操作步骤大为简化，较福林一酚法【２Ｊ便捷、快速，且试剂易得，广泛适用于市售蛋白酶的活力测定。

酶制剂发酵产品检验—蛋白酶活力测定

❖ 存在：动物内脏、植物茎叶、果实微生物细胞
❖ 不同种类的生物，分泌蛋白酶的种类和性质不同，因此，利用外源蛋白质类物质的能力也不同。
人体内外源蛋白质的消化过程
❖ 食物中的大分子蛋白质经胃蛋白酶分解成较小分子的多肽经十二指肠分泌胰蛋白酶、糜蛋白酶、羧肽酶和氨肽酶等分解成短链的肽和部分游离
子情境：酶制剂发酵产品检验- 蛋白酶活力测定
蛋白质：由20多种天然氨基酸通过肽键（―CO―NH― ）连接成为多肽，再由多肽聚合成生物大分子的物质。外源蛋白质—胞外蛋白酶内源蛋白质—溶酶体中的蛋白酶
蛋白酶：催化蛋白质类化合物中肽键水解，分解蛋白质生成胨、腙、多肽、氨基酸的一类酶的总称。
蛋白酶：催化蛋白质类化合物中肽键水解，分解蛋白质生成胨、月示、多肽、氨基酸的一类酶的总称。
10
酪氨酸含量
（μg、K）
吸光度（A540nm）
1
9
2
5
5
用紫外6 分光光度计测4 定其275nm吸光度，
绘制标7 准曲线，酪氨3 酸微克数（K）。
并计算6 K值。
2
步骤二、蛋白酶活性测定过程
酶2ml
1
2
3
空白
1、2、3、空白
酪蛋白
预热（5min） 40℃恒温水浴
1、2、3 1、2、3 1、2、3
氨基酸。
❖ 短链的肽经羧肽酶和氨肽酶分解成游离氨基酸。
❖ 外源蛋白质经上述消化器官内各种酶的协同作用，最后全部转变为游离氨基酸。
蛋白酶分类：按来源分类
（1）动物蛋白酶: 如胰蛋白酶、胃蛋白酶、凝乳酶（2）植物蛋白酶：木瓜蛋白酶：最适pH5-7，作用pH范围3-9 ；最适温度
65℃，作用温度范围30-70℃，生成产物：氨基酸。菠萝蛋白酶、无花果蛋白酶（3）微生物蛋白酶：霉菌蛋白酶、细菌蛋白酶

蛋白酶活力的测定

实验三蛋白酶活力的测定一、目的掌握用分光光度计法测定蛋白酶活力的原理与操作技术。

二、原理蛋白酶水解酪蛋白，其产物酪氨酸能在碱性条件下使福林——酚试剂还原，生成鉬蓝与钨蓝，以比色法测定。

三、试剂及仪器1．福林—酚试剂称取50g钨酸钠(Na2WO4•2H2O)，12.5g钼酸钠(Na2MoO4•2H2O)，置入1000mL原底烧瓶中，加350mL水，25mL85%磷酸，50mL浓盐酸，文火微沸回流10h，取下回流冷凝器，加50g硫酸锂(Li2SO4)和25mL水，混匀后，加溴水脱色，直至溶液呈金黄色，再微沸15min，驱除残余的溴，冷却，用4号耐酸玻璃过滤器抽滤，滤液用水稀释至500mL。

使用时用2倍体积的水稀释。

2．0.4mol/L碳酸钠溶液：称取42.4g碳酸钠，用水溶解并定容至1000mL。

3．0.4mol/L三氯乙酸溶液：称取65.5g三氯乙酸，用水溶解并定容至1000mL。

4．2%酪蛋白溶液称取2.00g酪蛋白(又名干酪素)，加约40mL水和2~3滴浓氨水，于沸水浴中加热溶解，冷却后，用pH7.2磷酸缓冲溶液稀释定容至100mL，贮存于冰箱中。

5．pH7.2磷酸缓冲液0.2mol/L 磷酸二氢钠溶液：称取31.2g磷酸二氢钠(NaH2PO4•2H2O)，用水溶解稀释至1000mL；0.2mol/L 磷酸氢二钠溶液：称取71.6g磷酸氢二钠(Na2HPO4•12H2O)，用水溶解稀释至1000mL；pH7.2磷酸缓冲溶液：取28mL 0.2mol/L磷酸二氢钠溶液和72mL 0.2mol/L磷酸氢二钠溶液，用水稀释至1000mL。

6．标准酪氨酸溶液：准确称取0.1g DL-酪氨酸，加少量0.2mol/L盐酸溶液(取1.7mL浓盐酸，用水稀释至100mL)，加热溶解，用水定容至1000mL，每毫升含DL-酪氨酸100微克。

7．仪器：分光光度计、试管四、操作步骤1．标准曲线绘制标准酪氨酸溶液(mL)[100 g/mL]稀释酪氨酸溶液浓度(g/mL)在上述各管中各取1mL，分别加入5mL 0.4mol/L碳酸钠溶液，1mL福林—酚试剂，于400C水浴显色20min，在680nm波长下测吸光度，绘制标准曲线，在标准曲线上求得吸光度为1时相当的酪氨酸g 数，即为K 值。

紫外可见光分光光度计酶活性测定的实验流程和方法

2
文献参考
3A
4
图 4：“单波长λ- 连续”（Singleλ- cont）方法中己糖激酶测定初步实验的参数设置
3B
为测试己糖激酶反应的进程，先使用 “单波长λ- 连续”
（Singleλ- cont）方法进行初步反应。选择的参数可以对反
应混合液的吸光度在一定持续时间内（10 分钟）的变化进
再加入葡萄糖 -6- 磷酸脱氢酶和己糖激酶，充分混匀溶液，分别在 22 °C、30 °C 和 37 °C 进行测定。
通过己糖激酶测试测定底物为测定底物，使用与己糖激酶活性检测相同的成分。为测定样品中未知浓度的 ATP，使用 1 mM 和 0.1 mM 的 ATP 作为标准品。
BioSpectrometer kinetic 的设置 BioSpectrometer kinetic 紫外／可见光分光光度计（动力学款）提供三种方法测定酶的活性（图 3）：
图 2 中描述的检测反应是本用户指南中的一个样例反应。其目的是为了演示使用 Eppendorf BioSpectrometer kinetic 紫外／可见光分光光度计（动力学款）进行酶动力学测定的两种应用：
1) ATP 浓度的酶测定底物的浓度通过 37 ° C 下定量 ATP 的两点校准法来确定。这一过程中，在底物转化的线性范围内进行两次测定。该转化的线性范围需在初步测定中确定。 2) 酶活性的测定如图 2 所示，己糖激酶反应对温度的依赖性。在 Eppendorf BioSpectrometer kinetic 紫外／可见光分光光度计（动力学款）具备可加热比色皿槽，可以对样品进行温度控制：可选温度范围在 20 °C 到 42 °C 之间。由于酶活性与孵育温度相关，所以温度调节对于酶活性的精确测定至关重要。因此，分别在 22 ° C、30 ° C 以及 37 ° C 下测定己糖激酶的酶活性。根据曲线的线性回归确定准确的酶活性。

蛋白酶活力测定法

蛋白酶活力测定法中华人民共和国专业标准蛋白酶活力测定法SB/T 10317-1999Measurement of proteinase activity━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━本方法适用于酿造酱油时在制品菌种、成曲的蛋白酶活力测定。

1 福林法1.1 试剂及溶液: 以下试剂都为分析纯1.1.1 福林试剂(Folin试剂):于2000mL磨口回流装置内,加入钨酸钠(Na2WO4·2H2O) 100g,钼酸钠(Na2MoO4·2H2O)25g,蒸馏水700mL,85%磷酸50mL,浓盐酸100mL,文火回流10h。

取去冷凝器,加入硫酸锂(Li2SO4)50g,蒸馏水50mL,混匀,加入几滴液体溴,再煮沸15min,以驱逐残溴及除去颜色,溶液应呈黄色而非绿色。

若溶液仍有绿色,需要再加几滴溴液,再煮沸除去之。

冷却后,定容至1000mL,用细菌漏斗(No4～5)过滤,置于棕色瓶中保存。

此溶液使用时加2倍蒸馏水稀释。

即成已稀释的福林试剂。

1.1.2 0.4mol碳酸钠溶液: 称取无水碳酸钠(Na2CO3)42.4g,定容至1000mL。

1.1.3 0.4mol三氯乙酸(T C A)溶液: 称取三氯乙酸(CCL3COOH)65.4g,定容至1000mL。

1.1.4 pH7.2磷酸盐缓冲液:称取磷酸二氢钠(NaH2PO4·2H2O)31.2g,定容至1000mL,即成0.2mol溶液(A液)。

称取磷酸氢二钠(Na2HPO4·12H2O)71.63g,定容至1000mL,即成0.2mol溶液(B液)。

取A 液28mL 和B 液72mL,再用蒸馏水稀释1倍,即成0.1mol pH7.2的磷酸盐缓冲液。

1.1.5 2%酪蛋白溶液:准确称取干酪素2g,称准至0.002g,加入0.1N氢氧化钠10mL,在水浴中加热使溶解(必要时用小火加热煮沸),然后用pH7.2磷酸盐缓冲液定容至100mL 即成。

蛋白酶及其活力的测定

分别吸取１００μｇ／ｍＬ的酪氨酸标液：０、１．００、２．００、３．００、
４．００、５．００、６．００ｍＬ各稀释１０倍，得浓度分别为０、１０．０、２０．０、
３０．０、４０．０、５０．０、６０．０μｇ／ｍＬ标准系列。
５．５．５样品及标准系列处理（列表）
表２
样品及标准系列处理
ｍＬ
标１标２标３标４标５标６样１样２空白０
５．６样品计算以１ｇ绝干曲粉，在ｐＨ３溶液中，４０℃每分钟水解酪蛋白生成酪氨酸微克数表示试样的蛋白质被分解情况：
蛋白酶分解力（酪氨酸．μｇ／ｇ．ｍｉｎ）＝（ｃ×４．００×ｎ）（／ｍＳ×ｔ）ｃ：从标准曲线上由试样平均吸光度求得酪氨酸的浓度 μｇ／ｍＬｎ：酶液稀释倍数（视具体情况而定）ｍｓ：试样以绝干物质计的质量１０．０ｇｔ：酶水解时间１０ｍｉｎ４．００：酶水解液总体ｍＬ５．７测定注意事项５．７．１缓冲液ｐＨ的配制必须准确（该法用ｐＨ３的缓冲液，因检测对象不同，缓冲液ｐＨ不同），恒温水浴锅的温度应恒定，并且终止酶反应加入的ＣＣｌ３ＣＯＯＨ应相当迅速、及时、准确，以减少人为误差。５．７．２酪蛋白的质量对测定结果影响较大，配制此标准液应保存于４℃冰箱中，以防变质，保质期为３ｄ。在配制标准溶液时，若泡沫过多，无法看清定容刻度时，可加入几滴酒精消泡［５］。５．７．３结果报告单上应注明底物酪蛋白的生产厂名和牌号，不同生产厂生产的酪素，用于测定结果会有差异，一般推荐上海乳品一厂生产的化学试剂，同时对不同生产厂的产品应进行对照试验［５］。结果报告时应注明测定条件如：ｐＨ、温度等。因为蛋白质分解力与测定温度、缓冲液ｐＨ、酶解时间、酶液用量等均有关系。５．７．４由于试样（酿酒大曲）本身含有蛋白质及少量的氨基酸等，所以酪蛋白在保温无酶的作用下，也有少量的氨基酸，故必做空白试验，否则测定结果将会高于实际具体的蛋白酶分解力。５．７．５常用终止酶反应的方法：①反应时间一到，立即取出适量反应液，置于沸水浴中，加热使酶失活。②加入适量酶变性剂如：三氯醋酸等，使酶变性失活。③立即加入酸或碱，使反应液ｐＨ迅速远离酶反应ｐＨ。④立即置于冰堆或冰盐溶液中，使反应温度迅速降低到１０℃以下［４］。５．７．６对于标准曲线的求证，应用二次回归方程，多点校正法。本人曾做过相关实验，求出回归方程ｙ＝０．００９９ｘ＋０．０６９９ｒ＝０．９８９５具有很好的线性关系［６］。６影响（蛋白）酶活力的因素６．１底物浓度在一定底物浓度范围内，Ｖ反应与Ｃ底物成正比关系，当底物浓度过高时，反应速度反而降低，是由于高Ｃ底物引起的抑制作用。