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第十一章生物素-亲和素放大技术第一节生物素的理化性质与标记生物素（biotin）、亲和素（avidin）是一对具有高度亲和力的物质，它们的结合迅速、专一、稳定并具有多级放大效应。
生物素-亲和素系统（BAS）是一种以生物素和亲和素具有的多级放大结合特性为基础的实验技术，它既能偶联抗原抗体等大分子生物活性物质，又可被荧光素、酶、放射性核素等材料标记。
生物素（biotin，B）广泛分布于动、植物组织中，常从含量较高的卵黄和肝组织中提取。
一、活化生物素利用生物素的羧基加以化学修饰可制成各种活性基团的衍生物，称为活化生物素。
生物素活化后，可容易地与各种抗原、抗体、酶及核酸分子中相应基团偶联形成生物素化标志物。
（一）标记蛋白质氨基的活化生物素此种活化生物素的制备方法是将生物素与N-羟基丁二酰胺在碳二亚胺的作用下进行缩和，生成生物素N-羟基丁二酰亚胺醣（BLAHS）。
BLAHS分子酯键中的—C-=0基团可与蛋白质分子中赖氨酸的氨基形成肽键。
从而使蛋白质标记上生物素。
（二）标记蛋白质醛基的活化生物素用于此类标记的活化生物素有两种：生物素酰肼（BHZ）和肼化生物胞素（BGHZ）。
BHZ是水合肼与生物素的合成物，主要用于偏酸性糖蛋白的生物素标记。
（三）标记蛋白质巯基的活化生物素3-（N-马来酰亚胺-丙酰）-生物胞素（MPB）是能特异地与蛋白质巯基结合的活化生物素试剂。
（四）标记核酸的活化生物素活化生物素可通过缺口移位法、化学偶联法、光化学法及末端标记法等技术使生物素的戊酸侧链通过酰胺键与核酸分子相连，构成生物素标记的核酸探针。
二、生物素标记蛋白质（一）生物素化蛋白质衍生物的特性生物素化蛋白质衍生物有两类：1.生物素化的大分子活性物质，如抗原、抗体。
2.标记材料（如酶）结合生物素后制成的标志物。
（二）标记方法1.标记抗体、抗原选用第二抗体进行生物素标记，制备的标志物具有通用性。
2.标记酶生物素标记辣根过氧化物酶第二节亲和素、链霉亲和素的理化性质与标记亲和素和链霉亲和素是生物亲和素的天然特异性结合物。
主管检验师资格考试临床免疫学和免疫检验复习习题第十一章生物素-亲和素放大技术（附答案解析）一、A1型题1、每个亲和素能结合生物素分子的数目是（）A、4B、2C、1D、3E、82、以下关于生物素-亲和素系统（BAS）的说法错误的是（）A、1个亲和素分子可结合4个生物素分子B、1个生物素分子可以结合多个亲和素分子C、生物素易与抗体、酶、多聚核苷酸结合D、亲和素易与酶、铁蛋白、荧光素、核素结合E、亲和素和生物素.有极强的亲和力3、免疫组化技术的优点不包括（）A、高特异性B、高敏感性C、形态学的直观性D、精确定量分析E、能对抗原表达情况进行分析4、BAS在ELISA技术中应用最广泛的反应模式是（）A、ABAB、ABCC、BRABD、BAE、LAB5、免疫组化染色前，对标本进行固定的目的是（）A、保存组织细胞的抗原性B、防止细胞脱落C、防止细胞自溶D、终止胞内酶的活性E、使细胞内蛋白质凝固6、ABC-ELISA将酶标记在（）A、亲和素B、生物素C、抗体D、补体E、抗原7、关于亲和素-生物素系统的错误描述是（）A、用于间接包被B、用于终反应放大C、用于酶免疫测定D、用于胶体金测定E、不用于荧光免疫测定8、ABC-ELISA将酶标记在（）A、亲和素B、生物素C、抗体D、补体E、抗原9、关于生物素标记蛋白质的注意事项，下列说法错误的是（）A、根据抗原或抗体分子结构中所带可标记基团的种类以及分子的理化性质，选择相应的活化生物素和反应条件B、活化生物素与待标记抗原或抗体可以为任意比例C、在生物素与被标记物之间加入交联臂样结构可减少空间位阻影响D、生物素与抗原、抗体等蛋白质结合后，不影响后者的免疫活性E、生物素标记酶时会影响其免疫活性10、亲和素和生物素结合的特点是（）A、免疫反应B、不属于免疫反应C、特异性弱D、亲和力小E、不够稳定二、B型题1、 A.ABCBC.BABD.直接法BASE.间接法BAS<1> 、标记亲和素-生物素的方法为（）；<2> 、亲和素-生物素化酶复合物技术为（）；<3> 、生物素化第二抗体为（）；<4> 、生物素化第一抗体为（）。
第十一章生物素 -亲和素免疫放大技术一、生物素 - 亲和素系统的特点灵敏度高，特异性好，稳定性高，适用广泛。
二、生物素的理化性质与标记（一）生物素及其活化1.标记蛋白质氨基的活化生物素N- 羟基丁二酰亚胺酯（ BNHS）2. 标记蛋白质醛基的活化生物素酰肼（BHZ）和肼化生物胞素（BCHZ）3.标记蛋白质巯基的活化生物素3- （ N-马来酰亚胺 - 丙酰） - 生物胞素（ MPB）4.标记蛋白质核酸的活化生物素常用于标记核酸分子的活化生物素有光生物素、生物素脱氧核苷三磷酸、BNHS和 BHZ。
（二）生物素标记蛋白质生物素化蛋白质衍生物的特性生物素化蛋白质衍生物有两类：一种是生物素化的大分子生物活性物质（如抗原、抗体），另一种是标记材料（如酶）结合生物素后制成的标记物。
标记方法：（ 1）标记抗体、抗原：常用于标记抗体的活化生物是BNHS；对于偏酸性的抗原，标记时多采用 BHZ。
（ 2）标记酶：以生物素标记HRP为例。
标记注意事项：（ 1）应根据抗原或抗体分子结构中所带可标记基团的种类以及分子的理化性质，选择相应的活化生物素和反应条件；（2）标记反应时，活化生物素与待标记抗原或抗体应有适当的比例；（3）为减少空间位阻影响，可在生物素与被标记物之间加入交联臂样结构；（4）生物素与抗原、抗体等蛋白质结合后，不影响后者的免疫活性；标记酶时则结果有不同。
三、亲和素、链霉亲和素理化性质与标记1.亲和素及其活性：活性基团 - 色氨酸。
2.链霉亲和素及其活性：活性基团- 色氨酸。
3.亲和素、链霉亲和素的标记：最常用的是酶、FITC 和胶体金。
亲和素的标记（链霉亲和素的标记）（1） HRP-亲和素结合物的制备：改良过碘酸钠法，戊二醛法；（2）亲和素 - 生物素化HRP复合物的制备；（3）亲和素 - 生物素化碱性磷酸酶复合物的制备。
四、生物素 - 亲和素系统的应用1.生物素 - 亲和素系统基本类型及原理：基本类型有两种，一类以游离亲和素为中间物，分别连接包含生物素大分子的待检反应体系和标记生物素，称为BAB法；后来又在此基础上发展了亲和素 - 生物素化酶复合物技术（ ABC）。
第十一章生物素-亲和素放大技术生物素、亲和素是一对具有高度亲和力的物质，它们的结合迅速、专一、稳定并具有多级放大效应。
生物素-亲和素系统（BAS）是一种以生物素和亲和素具有的多级放大结合特性为基础的实验技术，它既能偶联抗原抗体等大分子生物活性物质，又可被荧光素、酶、放射性核素等材料标记。
第一节生物素的理化性质与标记生物素（biotin，B）广泛分布于动、植物组织中，常从含量较高的卵黄和肝组织中提取，分子量244.31kD。
一、活化生物素利用生物素的羧基加以化学修饰可制成各种活性基团的衍生物，称为活化生物素。
（一）标记蛋白质氨基的活化生物素（二）标记蛋白质醛基的活化生物素有两种：生物素酰肼（BHZ）和肼化生物胞素（BGHZ）。
（三）标记蛋白质巯基的活化生物素：3-（N-马来酰亚胺-丙酰）-生物胞素（MPB）。
（四）标记核酸的活化生物素：生物素戊酸侧链通过酰胺键与核酸分子相连，构成生物素标记的核酸探针。
1.光敏生物素：用于DNA或RNA的标记。
2.生物素脱氧核苷三磷酸：将生物素与某种脱氧核苷酸连接成活化生物素。
用缺口移位法掺入到双链DNA中。
3.BNHS和BHZ：与核酸胞嘧啶分子中的N-4氨基交联，使核酸分子生物素化。
二、生物素标记蛋白质（一）生物素化蛋白质衍生物的特性生物素化蛋白质衍生物有两类，一种是生物素化的大分子活性物质（如抗原、抗体），另一种是标记材料（如酶）结合生物素后制成的标记物。
（二）标记方法1.标记抗体、抗原：由于一个抗体分子可连接多个生物素分子，因此一个生物素化的抗体分子在反应时可与多个亲和素分子结合。
通常选用第二抗体进行生物素标记，制备的标记物具有通用性。
2.标记酶：如生物素标记辣根过氧化物酶（HRP）。
（三）标记注意事项1.应根据抗原或抗体分子结构中所带可标记基团的种类（氨基、醛基或巯基）以及分子的理化性质（酸性、中性或碱性），选择相应的活化生物素和反应条件。
2.标记反应时，活化生物素与待标记抗原或抗体应有适当的比例，使每个蛋白质分子上标记的生物素分子数量控制在一定范围，以免影响标记物的活性。
生物素-亲和素放大技术生物素与亲和素之间结合的亲和力高、特异性强，各自均可以与各型大小分子结合，以及两者在结合反应时具有的多级放大作用等优越性。
生物素的理化性质与标记亲和素、链霉亲和素的理化性质与标记生物素-亲和素系统的特点生物素-亲和素系统的应用生物素的理化性质与标记生物素（biotin，B）广泛分布于动、植物组织中，常从含量较高的卵黄和肝组织中提取，分子量244.31kD。
活化生物素利用生物素的羧基加以化学修饰可制成各种活性基团的衍生物，使之容易地与各种抗原、抗体、酶及核酸分子中相应基团偶联形成生物素化标志物。
包括能标记蛋白质氨基、醛基、巯基和核酸的活化生物素。
常用于标记核酸分子的活化生物素有以下几种：1.光敏生物素它是一种化学合成的生物素衍生物，用于DNA或RNA的标记。
2.生物素脱氧核苷三磷酸先将生物素与某种脱氧核苷酸连接成活化生物素。
可采用缺口移位法掺入到双链DNA中。
3.BNHS和BHZ 二者均可以在一定条件下与核酸胞嘧啶分子中的N-4氨基交联，使核酸分子生物素化。
生物素标记蛋白质（一）生物素化蛋白质衍生物有两类，一种是生物素化的大分子活性物质（如抗原、抗体），另一种是标记材料（如酶）结合生物素后制成的标志物。
而且一个蛋白质分子可连接多个生物素分子，从而使其具有较高的比活性，在与亲和素的反应中成为多价。
生物素化大分子的多价性，是BAS多级放大作用的物质基础。
生物素化蛋白质衍生物有两类，一种是生物素化的大分子活性物质（如抗原、抗体），另一种是标记材料（如酶）结合生物素后制成的标志物。
（二）标记注意事项1.选择正确的活化生物素和反应条件；2.应有适当的比例，以免影响被标志物的活性；3.可在生物素与被标志物间加入交联臂样结构；4.不影响被标记物的免疫活性。
亲和素、链霉亲和素的理化性质与标记亲和素（AV）和链霉亲和素（SA）是生物亲和素的天然特异性结合物。
而且，二者均为大分子蛋白，几乎所有用于标记的物质均可以与之结合。
第十一章生物素—亲和素免疫放大技术第一部分目的要求和教学内容一、目的要求掌握：生物素—亲和素免疫放大技术、生物素、亲和素的概念，生物素—亲和素免疫放大技术的主要类型，原理和临床应用；熟悉：生物素—亲和素免疫放大技术的类型、原理及临床应用；了解：生物素及亲和素特性及其结合抗体的制备方法，各检测技术方法的技术要点。
二、教学内容1．胶体金与免疫金制备：生物素及亲和素特性及其制备，生物素的制备。
2．生物素—亲和素免疫放大技术的类型、原理。
3．生物素—亲和素免疫放大技术临床应用与评价。
第二部分测试题一、选择题(一)单项选择题(A型题)1.既能用于标记蛋白质氨基,又能标记蛋白质醛基的活化生物素是A.BNHSB.BCHZC.BHZD.MPBE.BCNHS2.间接法BA的反应模式为A.Ag-(Ab-B)-A*B.Ag-Ab1-(Ab2-B)-A*C.Ag-(Ab-B)-A-B*D.Ag-(Ab-B)-AB*CE.Ag-Ab1-(Ab2-B)-A-B*3 下列哪一项属于长臂活化生物素A.BNHSB.BHZC.BCNHSD.BCHZE.MPB4.MPB是氯化生物胞素与3-(N-马来酰亚胺-丙酰)-N-BNHS在什么溶液中反应后制得的A.二甲基甲酰胺B.碳二亚胺C.N-羟基丁二酰亚胺D.马来酰亚胺E.水合肼5.每个亲和素能结合多少个分子的生物素A.1B.2C.3D.4E.56.生物素通过噻吩环戊酸侧链上的什么部位与多种大分子偶联A.羰基B.-NHC.羧基D.-CH3E.-NH27.常用于标记抗体的活化生物素是A.BNHSB.BHZC.BCNHSD.BCHZE.MPB8.在生物素标记抗体时,生物素:IgG 的比例(mg/mg)为多少时,效果较好A.1:1B.3:1C.4:1D.2:1E.5:19.在用生物素标记酶时,酶活性会降低的是A.HRPB.葡萄糖氧化酶C.β-GalD.APE.LDH10.亲和素-生物素化碱性磷酸酶(ABAP)复合物的制备是将亲和素溶液与生物素化AP按多少浓度比反应后制得A.1:1B.2:1C.3:1D.4:1E.5:111.标记蛋白质氨基的活化生物素是A.BHZB.MPBC.光生物素D.生物素脱氧核苷三磷酸E.BNHS12.标记蛋白质巯基的活化生物素是A.MPBB.BNHSC.BHZD.光生物素E.生物素脱氧核苷三磷酸13.制备ABC复合物时,亲和素的浓度不能高于A.10ug/mlB.20ug/mlC.30ug/mlD.35ug/mlE.40ug/ml14.标记核酸的活化生物素,下列哪项除外A.MPBB.光生物素C.生物素脱氧核苷三磷酸D.BNHSE.BHZ15.用活化生物素标记核酸的方法,下列哪项除外A.缺口移位法B.光化学法C.化学偶联法D.放射免疫法E.末端标记法16.下列说法不正确的是A.标记反应时,活化生物素与待标记抗原或抗体应有适当比例B.一般每个抗原或抗体分子标记1-3或3-5个生物素分子较为适宜C.生物素与抗原、抗体等蛋白质结合后,不影响后者的免疫活性D.生物素与酶结合后,酶活性不受影响E.为减少空间位阻影响,常在生物素与被标记物间加入交联臂样结构17.下列哪种方法不能用于制备生物素标记的核酸探针A.缺口移位法B.化学偶联法C.光化学法D.末端标记法E.电化学法二、填空题1.不受位阻效应影响,更易发挥生物素活性作用的是（）。
生物素亲和素放大系统
生物素亲和素放大系统（Biotin-Avidin Amplification System）是免疫组织化学技术中常用的增强方法。
其原理是生物素与链霉亲和素（Avidin）结合后形成生物素-链霉亲和素复合物，生物素-链霉亲和素复合物与连接荧光素等物质的新化学实体进一步增强了检测灵敏度。
在该系统中，样品经过初级抗体与标记试剂（如酶标记抗体或荧光标记抗体）结合后，再加上与标记试剂相称的生物素化二抗，使生物素化二抗与标记试剂结合。
最后，加入与生物素结合的标记试剂（如辣根过氧化物酶（HRP）偶联的荧光素）来检测目标分子。
这种方法在检测抗原、蛋白质、核酸等方面具有广泛应用。
