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组织工程在皮肤再生中的研究进展皮肤是人体最大的器官，它不仅起到保护身体内部组织和器官的作用，还参与调节体温、感知外界环境等重要生理过程。
然而，由于烧伤、创伤、慢性疾病等原因，皮肤受损的情况屡见不鲜。
传统的治疗方法如自体皮肤移植、异体皮肤移植等存在着供体不足、免疫排斥等问题。
组织工程的出现为皮肤再生带来了新的希望，其在皮肤再生领域的研究取得了显著的进展。
组织工程是一门融合了生物学、工程学和医学的交叉学科，旨在通过构建生物活性替代物来修复、维持或改善受损组织或器官的功能。
在皮肤再生方面，组织工程主要涉及种子细胞、支架材料以及细胞与支架材料的相互作用等关键要素。
种子细胞是皮肤组织工程的基础。
成纤维细胞是皮肤真皮层的主要细胞类型，能够合成胶原蛋白、弹性纤维等细胞外基质成分，对于维持皮肤的结构和功能起着重要作用。
角质形成细胞则是表皮层的主要细胞，负责形成皮肤的屏障功能。
此外，干细胞如间充质干细胞、表皮干细胞等也因其具有自我更新和多向分化的潜能而成为研究的热点。
这些干细胞可以分化为成纤维细胞、角质形成细胞等皮肤细胞类型，为皮肤再生提供了丰富的细胞来源。
支架材料为种子细胞的生长和分化提供了三维空间和适宜的微环境。
天然材料如胶原蛋白、透明质酸、壳聚糖等具有良好的生物相容性和生物可降解性，但力学性能相对较差。
合成材料如聚乳酸、聚乙醇酸等具有较好的力学性能和可调控性，但生物相容性有待提高。
为了克服单一材料的局限性，研究人员开发了多种复合材料，如胶原蛋白/聚乳酸复合支架、透明质酸/壳聚糖复合支架等，以更好地满足皮肤再生的需求。
细胞与支架材料的相互作用对于皮肤再生至关重要。
支架材料的表面形貌、孔隙率、孔径大小等物理特性以及化学组成都会影响细胞的黏附、增殖和分化。
例如，具有适当粗糙度和孔隙结构的支架材料有利于细胞的黏附和迁移，而表面修饰特定的生物活性分子如生长因子、多肽等可以促进细胞的功能表达。
此外，细胞在支架材料上的接种密度、接种方式以及培养条件等也会对皮肤再生的效果产生影响。
1901年以来获得诺贝尔生理学或医学奖的免疫学家1. von Behring（Emil Adorf von Behring, 1854-1917, Germany）是第一届诺贝尔奖得主，因在血清免疫疗法，特别是将抗血清疗法用于抗白喉治疗中所取得的成就而获得1901年诺贝尔诺贝尔生理学医学奖。
von Behring曾在柏林Koch研究所师从Robert Koch。
在1883年Lfler分离出白喉杆菌及1888年Roux和Yersin鉴定白喉外毒素后，vonBehring 和他的同事Kitadato及Wermicke于1890 年至1892年间指出白喉和破伤风病人是经血液循环中的抗毒素而形成免疫力的，并指出主动给病人注射抗毒素血清具有治疗作用，从而开辟了免疫血清疗法新途径也为体液免疫理论的提出奠定了基础。
2. Koch (Robert Koch, 1843-1910, Germany)1905 年因“在结核方面的研究和发现”获得诺贝尔生理学医学奖。
Koch 早年因在炭疽杆菌的生活史和炭疽病因学上的研究而震动医疗界。
在柏林Koch创建了著名的Koch研究所，他和他的一些杰出的学生建立了严格的细菌分离和培养技术，并在病因学证据方面提出了著名的Koch假说，从而使细菌学成为一门真正的学科。
Koch一生中研究过几种疾病，而他对结核杆菌和结核菌素的鉴定以及对结核病的不懈研究尤为突出，结核菌素反应的诊断性实验及已致敏动物对过量皮下注射结核杆菌的皮肤反应被称为Koch现象，它为以后阐明细胞免疫机制发挥了重要作用。
3. Mechnikov ( Iya lyich Mechnikov, 1845-1916, Russa)1908年因“对免疫力认识方面所做出的杰出贡献”与Paul Ehrlich 分享该年度诺贝尔生理学医学奖。
Mechnikov 对免疫学的主要贡献是提出并证明了细胞(巨噬细胞)免疫理论。
早年他主要从事动物学的比较胚胎学方面的研究工作，在意大利的一家海洋生物实验室工作期间，Mechnikov观察到了海盘车幼虫巨噬细胞，为他的细胞(巨噬细胞)免疫理论奠定了基础。
2009年度南京师范大学国家自然科学基金资助项目清单学院姓名申请项目名称资助类别金额(万元)数科院（6项）纪春岗L-函数，二次域以及其它数论问题面上项目27魏加群有限维猜测及其相关问题与理论研究面上项目24陈二才动力系统中的拓扑压与维数理论面上项目26曹海涛二维光正交码及相关设计的研究面上项目25王丽大型稀疏非对称线性方程组的预处理及高效算法研究面上项目26赫海龙辛几何中的开“格罗莫夫-威腾”不变量青年基金16物科院（4项）童培庆准周期与非周期系统的若干动力学和相关问题的研究面上项目34马青玉基于声偶极振动矢量的磁感应磁声衍射层析成像技术研究面上项目36肖振军B介子物理高阶QCD修正计算和唯象研究面上项目36张宁异型（复合）铁磁∕铁电复合材料中的电致变磁导效应与微振发电面上项目42化科院（7项）黄晓华稀土作用于辣根细胞膜的若干生物无机化学行为研究面上项目35孙培培高活性纳米金属的制备及其催化有机反应的研究面上项目35魏少华酞菁/二氧化硅靶向给药体系的构建及其光动力活性研究面上项目35杨维本不同结构吸附树脂对典型抗生素类有机物的吸附行为与机理面上项目36韩敏金属纳米晶的可控合成、组装及多功能异质纳米结构的构筑青年基金18李卉卉环境中有机污染物分子与人类肿瘤相关DNA作用机制的研究青年基金19张卉纳米界面上蛋白质构象及其电化学性能青年基金20生科院（11项）陈双林黏菌代表种的DNA标识区段及遗传多样性的研究面上项目25戴亦军不同共代谢基质控制嗜麦芽寡养单胞菌的吡虫啉代谢途径的机理研究面上项目35邵蔚蓝一株嗜冷菌及镶嵌其细胞壁的大型颗粒的研究面上项目35蒋国芳黄脊雷篦蝗的种群遗传结构和系统地理格局研究面上项目31马飞脊椎动物miRNA基因的起源与进化分析面上项目32杨州微囊藻表型转化的野外原位研究面上项目32戴传超广谱植物内生菌优化花生连作土壤微生物区系的研究面上项目30陈龙镉激活神经细胞mTOR通路诱导凋亡及雷帕霉素靶向调控抗凋亡分子机理面上项目31陈华群内皮细胞肌球蛋白轻链激酶调节小鼠肾脏发育及其机制面上项目31裴建军嗜热厌氧乙醇杆菌中还原力感应蛋白介导乙醇代谢调控的分子机理青年基金20陈玉清抗菌肽CM4对癌细胞与正常细胞的选择性与机理青年基金20地科院（17项）汤国安基于DEM的黄土高原地貌形态空间格局研究重点项目150汪涛基于知识网络视角的高科技园区产业空间集聚研究——以苏南为例面上项目30黄震方基于文化视角的区域旅游发展机制与模式研究——以长江三角洲地区为例面上项目30方斌我国东部地区耕地利用的综合优化模式研究——以浙江省浦江县为例面上项目30李云梅面向湖泊水色遥感的多源数据融合与生成研究面上项目35刘学军融合地形结构的DEM质量分析研究面上项目35张雪英面向GIS的文本空间关系解析机制研究面上项目35赵媛中国石油资源流动空间格局演化规律与形成机制研究面上项目36吴江滢辽宁暖和洞年纹层状石笋全新世东亚季风气候记录与驱动机制研究面上项目49张茂恒中更新世以来大九湖盆地泥炭沉积的气候地层学研究面上项目50刘金娥互花米草对苏北盐沼沉积物有机碳库功能格局影响机理面上项目49齐相贞不同繁殖方式的外来入侵植物的扩散机制研究青年基金18周年兴旅游地景观格局演变机制及优化研究：以武陵源为例青年基金18刘会玉植物入侵对不同尺度栖息地时空变异的响应及其预测青年基金20杨昕基于DEM的黄土高原流域边界剖面谱研究青年基金18吴明光基于庞加莱对偶的三维自由拓扑模型青年基金18张卡基于非下采样Contourlet变换的多源影像自动匹配方法研究青年基金18电自院（1项）田恩刚网络控制系统的随机建模、分析与综合面上项目19动院（2项）杨宏旻烟气中单质汞的等离子放电协同光催化氧化特性研究面上项目30王延华生态土壤污水处理系统温室气体的量化和产生机制研究—太湖流域为例面上项目20请项目主持人按照国家自然科学基金项目及经费管理办法，填报项目计划书。
第一章细胞概述细胞生物学的发展经历了从细胞的发现、细胞学说的建立,以及对细胞分裂和细胞器做基本描述的经典时期；直到1953年DNA双螺旋分子结构的确立，伴随着研究手段的进展,细胞生物学才得以确立并得到突飞猛进的发展.近代分子生物学的迅速发展极大地促进了细胞生物学的进步，而分子生物学的研究离不开细胞这个平台。
在这两门生命科学前沿学科的相互促进协调发展中逐渐实现了细胞科学从细胞生物学到细胞分子生物学的转变。
无论是根据细胞的进化,细胞的功能和形态，都可以将细胞人为的分成三大系统:细胞的膜系统，细胞的核系统和细胞的骨架系统。
第二章细胞生物学技术细胞生物学是研究细胞结构与功能的学科，细胞生物学研究方法的建立与完善，促进了细胞生物学的发展.本章重点介绍了细胞生物学领域中最常用的技术方法与基本原理，并简要介绍了该技术的基本延伸。
细胞形态结构的观察依赖于显微镜技术。
复式光学显微镜是光镜下观察细胞结构的基础,适用于观察活体或固定染色的样品.荧光显微镜技术与免疫学技术相结合,实现了生物大分子在细胞内的定位与分布的观察。
相差显微镜和微分干涉显微镜技术，适用于观察活体细胞的结构，结合荧光标记技术可以对细胞活体示踪与观察。
激光共聚焦显微镜利用共焦光路和激光扫描技术,可排除焦平面以外光的干扰，增强图像反差和提高分辨率.但光学显微镜具有局限性，它不能分辨﹤0。
2 μm的物体,而利用电子束对样品成像而制成的电子显微镜,已成为研究机体微细结构的重要手段.根据观察样品的需要，可对观察样品采用特殊的制样方法,如超薄切片技术适于观察细胞内部精细结构，而扫描电镜则用来观察细胞表面形貌特征。
细胞组分的分析可以采用细胞化学、免疫荧光、免疫电镜、原位杂交等方法。
超速离心技术与生化提纯可用于细胞组分的分离与纯化.同位素标记技术与放射自显影技术结合,可应用于研究生物大分子在细胞内的动态变化。
细胞培养技术是细胞工程的基础，细胞融合、杂交瘤制备及组织工程都建立在良好的细胞培养技术基础之上。
网络出版时间：２０２４－０３－０９１８：２７：０７ 网络出版地址：ｈｔｔｐｓ：／／ｌｉｎｋ．ｃｎｋｉ．ｎｅｔ／ｕｒｌｉｄ／３４．１０８６．Ｒ．２０２４０３０６．１７２５．０２０藁本内酯通过抑制铁自噬延缓小鼠听皮层组织衰老周颖东１，张梦娴１，王青玲１，康浩然２，张治成２，王庆林３，刘亚敏４，郭向东２（１．河南中医药大学第一临床医学院，河南郑州 ４５００４６；２．河南中医药大学第一附属医院耳鼻喉科，河南郑州 ４５００００；３．河南医学高等专科学校，河南郑州 ４５１１９１；４．河南中医药大学药学院，河南郑州 ４５００４６）收稿日期：２０２３－１０－１５，修回日期：２０２４－０１－２２基金项目：国家自然科学基金资助项目（Ｎｏ８１４０３４３９）；河南省科技攻关计划（Ｎｏ２２２１０２３１０６０４，２３２１０２３１０４３０）；河南省中医药科学研究专项重点课题（Ｎｏ２０－２１ＺＹ１０４５）；河南省高等学校重点科研项目（Ｎｏ２３Ａ３６００２８）作者简介：周颖东（１９９８－），硕士生，研究方向：内耳疾病，Ｅ ｍａｉｌ：ｚｙｄ７８６７９４２４２＠１６３．ｃｏｍ；郭向东（１９８０－），硕士，副主任医师，硕士生导师，研究方向：内耳疾病，通信作者，Ｅ ｍａｉｌ：ｇｕｏｘｉａｎｇｄｏｎｇ０６１８＠１２６．ｃｏｍｄｏｉ：１０．１２３６０／ＣＰＢ２０２３０９０４３文献标识码：Ａ文章编号：１００１－１９７８（２０２４）０３－０４５５－０７中国图书分类号：Ｒ ３３２；Ｒ２８４ １；Ｒ３２２ ８１；Ｒ３３９ ３８；Ｒ５９１ １；Ｒ７６４ ４３６摘要：目的 探究藁本内酯（ｌｉｇｕｓｔｉｌｉｄｅ，ＬＩＧ）延缓听皮层组织衰老，治疗中枢性老年性聋的机制。
方法 将４０只１３月龄Ｃ５７ＢＬ／６Ｊ小鼠随机分为ＬＩＧ低剂量组（Ｌ ＬＩＧ）、ＬＩＧ中剂量组（Ｍ ＬＩＧ）、ＬＩＧ高剂量组（Ｈ ＬＩＧ）和衰老组（Ａｇｅ），同品系２月龄小鼠１０只作为对照组（Ｃｔｒｌ）。
基金项目:国家自然科学基金项目(８１８７１６９７)作者简介:张莉(１９９１－)ꎬ女ꎬ硕士研究生ꎬ主要研究重症机制及防治研究ꎮ通信作者:雷迎峰ꎬ副教授ꎬＥ￣ｍａｉｌ:ｙｆｌｅｉ＠ｆｍｍｕ.ｅｄｕ.ｃｎꎻ侯立朝ꎬ博士生导师ꎬ教授ꎬＥ￣ｍａｉｌ:４５２７８４３６＠ｑｑ.ｃｏｍ 论㊀著ｃｘｃｒ２基因修饰小鼠骨髓间充质干细胞的构建与鉴定张莉１ꎬ刘永飞２ꎬ叶传涛３ꎬ边培育３ꎬ雷迎峰４ꎬ侯立朝１１.空军军医大学西京医院麻醉与围术期医学科ꎬ陕西西安７１００３２２.空军军医大学唐都医院麻醉科ꎬ陕西西安７１００３８３.空军军医大学唐都医院传染科ꎬ陕西西安７１００３８４.空军军医大学微生物学教研室ꎬ陕西西安７１００３２摘要:目的㊀构建小鼠ＣＸＣ型趋化因子受体２(ＣＸＣＲ２)基因ｃｘｃｒ２过表达的骨髓间充质干细胞(Ｂｏｎｅｍａｒｒｏｗｍｅｓ￣ｅｎｃｈｙｍａｌｓｔｅｍｃｅｌｌꎬＢＭＳＣ)并进行鉴定ꎮ方法㊀全骨髓贴壁法分离培养小鼠ＢＭＳＣꎬ采用流式细胞术检测干细胞抗原１(ｓｔｅｍｃｅｌｌａｎｔｉｇｅｎ￣１ꎬＳＣＡ￣１)㊁ＣＤ４４㊁ＣＤ４３㊁ＣＤ４５㊁ＩＡ/ＩＥ表达率ꎬ并诱导成骨分化ꎮ以含有小鼠ｃｘｃｒ２的质粒为模版进行ＰＣＲ扩增ꎬ将获得的ｃｘｃｒ２克隆到慢病毒载体ꎬ命名为ｐＬｅｎｔｉ￣ｃｘｃｒ２￣ＧＺꎻ将其与慢病毒包装质粒共转染ＨＥＫ￣２９３Ｔ细胞ꎬ收获慢病毒后ꎬ通过离心法感染ＢＭＳＣꎬ经过１μｇ/ｍＬｚｅｏｃｉｎ压力选择建立了稳定表达ＣＸＣＲ２的小鼠ＢＭＳＣ(ＣＸＣＲ２￣ＢＭＳＣ)ꎮ采用流式细胞术和ＲＴ￣ＰＣＲ分别检测其ＣＸＣＲ２蛋白和ｍＲＮＡ表达水平ꎬＴｒａｎｓｗｅｌｌ趋化实验检测其迁移能力ꎮ结果㊀９０％以上的第３代ＢＭＳＣ表达ＣＤ４４㊁ＳＣＡ￣１ꎬ几乎不表达ＩＡ/ＩＥ㊁ＣＤ３４㊁ＣＤ４５ꎬ且成功诱导成骨分化ꎮ菌液ＰＣＲ㊁质粒双酶切后ꎬ琼脂糖凝胶电泳鉴定结果得到特异㊁大小正确的条带及测序鉴定正确ꎬ表明成功构建了ｐＬｅｎｔｉ￣ｃｘｃｒ２￣ＧＺ表达质粒ꎮ流式细胞术和ＲＴ￣ＰＣＲ结果显示ꎬＣＸＣＲ２￣ＢＭＳＣ的ＣＸＣＲ２蛋白和ｍＲＮＡ表达水平均明显高于对照组ＢＭＳＣꎬ差异有统计学意义(Ｐ<０.００１)ꎮＴｒａｎｓｗｅｌｌ结果显示ꎬＣＸＣＲ２￣ＢＭＳＣ迁移能力高于对照组ＢＭＳＣꎬ差异有统计学意义(Ｐ<０.０１)ꎮ结论㊀利用慢病毒系统成功构建了稳定表达ＣＸＣＲ２的ＢＭ￣ＳＣꎬｃｘｃｒ２基因修饰ＢＭＳＣ后可明显增加ＢＭＳＣ的迁移能力ꎮ关键字:ＣＸＣ型趋化因子受体２ꎻ小鼠ꎻ骨髓间充质干细胞ꎻ细胞迁移中图分类号:Ｒ７８文献标志码:Ａ文章编号:１００５￣５６７３(２０１９)０１￣００１９￣０７ＤＯＩ:１０.１３３０９/ｊ.ｃｎｋｉ.ｐｍｉ.２０１９.０１.００４Ｃｏｎｓｔｒｕｃｔｉｏｎａｎｄｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎｏｆｃｘｃｒ２ｇｅｎｅｉｎｍｏｄｉｆｉｃａｔｉｏｎｍｏｕｓｅｂｏｎｅｍａｒｒｏｗｍｅｓｅｎｃｈｙｍａｌｓｔｅｍｃｅｌｌｓＺＨＡＮＧＬｉ∗ꎬＬＩＵＹｏｎｇ￣ｆｅｉꎬＹＥＣｈｕａｎ￣ｔａｏꎬＢｉａｎＰｅｉ￣ｙｕꎬＬＥＩＹｉｎｇ￣ｆｅｎｇꎬＨＯＵＬｉ￣ｃｈａｏ∗ＤｅｐａｒｔｍｅｎｔｏｆＡｎｅｓｔｈｅｓｉｏｌｏｇｙꎬＸｉｊｉｎｇＨｏｓｐｉｔａｌꎬＡｉｒＦｏｒｃｅＭｉｌｉｔａｒｙＭｅｄｉｃａｌＵｎｉｖｅｒｓｉｔｙꎬＸｉ'ａｎ７１００３２ꎬＳｈａａｎｘｉＰｒｏｖｉｎｃｅꎬＣｈｉｎａＣｏｒｒｅｓｐｏｎｄｉｎｇａｕｔｈｏｒ:ＬＥＩＹｉｎｇ￣ｆｅｎｇꎬＥ￣ｍａｉｌ:ｙｆｌｅｉ＠ｆｍｍｕ.ｅｄｕ.ｃｎꎻＨＯＵＬｉ￣ｃｈａｏꎬＥ￣ｍａｉｌ:４５２７８４３６＠ｑｑ.ｃｏｍＡｂｓｔｒａｃｔ:Ｏｂｊｅｃｔｉｖｅ㊀Ｔｏｃｏｎｓｔｒｕｃｔａｎｄｉｄｅｎｔｉｆｙｔｈｅｂｏｎｅｍａｒｒｏｗｍｅｓｅｎｃｈｙｍａｌｓｔｅｍｃｅｌｌｓ(ＢＭＳＣ)ｗｉｔｈｏｖｅｒｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎｏｆｍｏｕｓｅｃｈｅｍｏｋｉｎｅｒｅｃｅｐｔｏｒｃｘｃｒ２ｇｅｎｅ.Ｍｅｔｈｏｄｓ㊀ＢＭＳＣｗｅｒｅｉｓｏｌａｔｅｄａｎｄｃｕｌｔｕｒｅｄｂｙｗｈｏｌｅｂｏｎｅｍａｒｒｏｗａｄｈｅｒｅｎｔｍｅｔｈ￣ｏｄꎬａｎｄｔｈｅｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎｒａｔｅｓｏｆｓｔｅｍｃｅｌｌａｎｔｉｇｅｎ１(ＳＣＡ￣１)ꎬＣＤ４４ꎬＣＤ４３ꎬＣＤ４５ꎬＩＡ/ＩＥｗｅｒｅｄｅｔｅｃｔｅｄｂｙｆｌｏｗｃｙｔｏｍｅ￣ｔｒｙꎬａｎｄｔｈｅｏｓｔｅｏｇｅｎｉｃｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｉｏｎｗａｓｉｎｄｕｃｅｄ.Ｔｈｅｃｘｃｒ２ｃＤＮＡｗａｓａｍｐｌｉｆｉｅｄꎬａｎｄｔｈｅｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔｌｅｎｔｉｖｉｒａｌｖｅｃｔｏｒｏｆｔｈｅｏｖｅｒｅｘｐｒｅｓｓｅｄｍｏｕｓｅｃｘｃｒ２ｇｅｎｅｗａｓｃｏｎｓｔｒｕｃｔｅｄꎬａｎｄｎａｍｅｄａｓｐＬｅｎｔｉ￣ｃｘｃｒ２￣ＧＺ.ＨＥＫ￣２９３Ｔｃｅｌｌｓｗｅｒｅｃｏ￣ｔｒａｎｓｆｅｃｔｅｄｗｉｔｈｌｅｎｔｉｖｉｒａｌｐａｃｋａｇｉｎｇｐｌａｓｍｉｄｓａｎｄｐＬｅｎｔｉ￣ｃｘｃｒ２￣ＧＺ.ＴｈｅＣＸＣＲ２￣ＢＭＳＣｗｅｒｅｏｂｔａｉｎｅｄｔｈｒｏｕｇｈｃｅｎｔｒｉｆｕｇａｌｉｎｆｅｃｔｉｏｎｏｆＢＭＳＣｗｉｔｈｐＬｅｎｔｉ￣ｃｘｃｒ２￣ＧＺｖｉｒｕｓ.ＣＸＣＲ２ｐｒｏｔｅｉｎａｎｄｍＲＮＡｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎｗｅｒｅｄｅｔｅｃｔｅｄｂｙｆｌｏｗｃｙｔｏｍｅｔｒｙａｎｄＲＴ￣ＰＣＲ.Ｔｈｅｍｉ￣ｇｒａｔｉｏｎａｂｉｌｉｔｙｏｆＣＸＣＲ２￣ＢＭＳＣｗａｓｔｅｓｔｅｄｂｙＴｒａｎｓｗｅｌｌｅｘｐｅｒｉ￣ｍｅｎｔ.Ｒｅｓｕｌｔｓ㊀ＣＤ４４ａｎｄＳＣＡ￣１ｗｅｒｅｅｘｐｒｅｓｓｅｄｂｙｏｖｅｒ９０％ｏｆｔｈｅｔｈｉｒｄｇｅｎｅｒａｔｉｏｎＢＭＳＣｃｅｌｌｓꎬｂｕｔＩＡ/ＩＥꎬＣＤ３４ａｎｄＣＤ４５ｈａｒｄｌｙｅｘｐｒｅｓｓｅｄꎬａｎｄｏｓｔｅｏｇｅｎｉｃｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｉｏｎｗａｓｓｕｃｃｅｓｓｆｕｌｌｙｉｎｄｕｃｅｄ.ＡｆｔｅｒＰＣＲａｎｄｄｏｕｂｌｅｅｎｚｙｍｅｄｉｇｅｓｔｉｏｎｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎꎬｔｈｅａｇａｒｏｓｅｇｅｌｅｌｅｃｔｒｏｐｈｏｒｅｓｉｓｓｈｏｗｅｄｔｈａｔｔｈｅｂａｎｄｓｗｅｒｅｓｐｅｃｉｆｉｃａｎｄｃｏｒｒｅｃｔ.ＴｈｅｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇｗａｓｉｄｅｎｔｉｃａｌꎬｉｎｄｉｃａｔｉｎｇｔｈａｔｔｈｅｐＬｅｎｔｉ￣ｃｘｃｒ２￣ＧＺｐｌａｓｍｉｄｗａｓｓｕｃｃｅｓｓｆｕｌｌｙｃｏｎｓｔｒｕｃ￣ｔｅｄ.ＦｌｏｗｃｙｔｏｍｅｔｒｙａｎｄＲＴ￣ＰＣＲａｎａｌｙｓｉｓｓｈｏｗｅｄｔｈａｔｔｈｅｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎｌｅｖｅｌｓｏｆＣＸＣＲ２ｐｒｏｔｅｉｎａｎｄｍＲＮＡｗｅｒｅｓｉｇｎｉｆｉｃａｎｔｌｙｈｉｇｈｅｒｔｈａｎｔｈａｔｏｆｎｏｒｍａｌｃｏｎｔｒｏｌＢＭＳＣ.ＴｈｅｔｒａｎｓｗｅｌｌｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔｓｈｏｗｅｄｔｈａｔｔｈｅｍｉｇｒａｔｉｏｎｃａｐａｃｉｔｙｏｆＣＸＣＲ２￣ＢＭＳＣｗａｓａｐｐａｒｅｎｔｌｙｈｉｇｈｅｒｔｈａｎｔｈａｔｏｆｎｏｒｍａｌｃｏｎｔｒｏｌＢＭＳＣ(Ｐ<０.００１).Ｃｏｎｃｌｕｓｉｏｎ㊀ＴｈｅＢＭＳＣｓｓｔａｂｌｙｅｘｐｒｅｓｓｉｎｇＣＸＣＲ２ｗｅｒｅｓｕｃｃｅｓｓｆｕｌｌｙｃｏｎｓｔｒｕｃｔｅｄｂｙｕｓｉｎｇｌｅｎｔｉｖｉｒａｌｓｙｓｔｅｍ.Ｔｈｅｏｖｅｒｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎｏｆｃｘｃｒ２ｃａｎｓｉｇｎｉｆｉｃａｎｔｌｙｉｎｃｒｅａｓｅｔｈｅｍｉｇｒａｔｉｏｎａｂｉｌｉ￣ｔｙｏｆＢＭＳＣ.Ｋｅｙｗｏｒｄｓ:ＣＸＣｃｈｅｍｏｋｉｎｅｒｅｃｅｐｔｏｒ２(ＣＸＣＲ２)ꎻＭｏｕｓｅꎻＢｏｎｅｍａｒｒｏｗｍｅｓｅｎｃｈｙｍａｌｓｔｅｍｃｅｌｌｓ(ＢＭＳＣ)ꎻＣｅｌｌｍｉｇｒａ￣ｔｉｏｎ㊀㊀间充质干细胞(ｍｅｓｅｎｃｈｙｍａｌｓｔｅｍｃｅｌｌꎬＭＳＣ)是一类具有自我增殖㊁多向分化潜能的成体干细胞[１]ꎮＭＳＣ具有很强的免疫调节功能ꎬ在免疫和炎症性疾病的治疗中具有良好的潜力[２－４]ꎮ鉴于ＭＳＣ移植后归巢靶组织的数量有限㊁产生的治疗性和抗炎分子效力不够强ꎬ最近多项研究对ＭＳＣ进行基因修饰ꎬ从而增加了ＭＳＣ的治疗效能[５－７]ꎮＣＸＣ型趋化因子受体２(ＣＸＣｃｈｅｍｏｋｉｎｅｒｅｃｅｐｔｏｒ２ꎬＣＸＣＲ２)属于Ｇ蛋白是偶联受体家族ꎬ是趋化因子ＣＸＣＬ１㊁ＣＸＣＬ２㊁ＣＸＣＬ３㊁ＣＸＣＬ５㊁ＣＸＣＬ６㊁ＣＸＣＬ７和ＣＸＣＬ８的配体[８]ꎮ趋化因子在炎症性疾病中广泛表达ꎬ趋化因子与趋化因子受体结合能调节中性粒细胞㊁单核细胞的迁移ꎬ将它们募集到炎症部位发挥相应的作用ꎮ研究通过构建ｃｘｃｒ２基因修饰的ＢＭＳＣꎬ并观察修饰后ＢＭＳＣ到达炎症部位的迁徙能力ꎬ为后续炎症性疾病的ＢＭＳＣ治疗策略奠定基础ꎮ１㊀材料与方法１.１㊀细胞与质粒㊀ＨＥＫ￣２９３Ｔ细胞株㊁Ｓｔｂｌ３感受态细胞㊁ｐＣＩ￣ｎｅｏ￣ＣＤ４０Ｌ￣ＧＺ㊁ｐＬｅｎｔｉ￣ＣＤ４０Ｌ￣ＧＺ㊁ｐＣＭＶ３￣ＧＦＰＳｐａｒｋ￣ＣＸＣＲ２载体质粒㊁辅助包装质粒ｐｓＰＡＸ２和ｐＭＤ２.Ｇ均由空军军医大学微生物实验室保存并提供ꎮ１.２㊀实验动物㊀ＳＰＦ级４~６周Ｃ５７ＢＬ/６小鼠４只ꎬ１６~１８ｇꎬ均购自空军军医大学动物实验中心ꎮ１.３㊀主要试剂及仪器㊀ＤＭＥＭ培养基㊁青霉素㊁链霉素均购自ｈｙｃｌｏｎｅ公司ꎻ胎牛血清购自Ｓｉｇｍａ公司ꎻ成骨诱导分化培养基试剂盒购自广州赛业公司ꎻＰＥ标记抗小鼠ＣＤ４４㊁ＳＣＡ￣１㊁ＩＡ/Ｅ㊁ＣＤ３４㊁ＣＤ４５抗体均购自ＢＤ公司ꎻＰＥ标记ＣＸＣＲ２抗体购自Ｂｉｏ￣ｌｅｇｅｎｄ公司ꎻ质粒大量提取ＤＮＡ试剂盒购自Ｏｍｅｇａ公司ꎻ先锋ＲＮＡ快速提取试剂盒㊁ＤＮＡ凝胶回收试剂盒㊁质粒小量提取ＤＮＡ试剂盒均购自Ａｘｙｇｅｎ公司ꎻＰｒｉｍｅＳＴＡＲＤＮＡ聚合酶㊁限制性内切酶ＮｈｅＩ㊁ＭｌｕＩ㊁ＢａｍＨＩ和ＳａｌＩ㊁Ｔ４ＤＮＡ连接酶㊁逆转录试剂盒㊁ＴａｋａｒａＳＹＢＲｇｒｅｅｎ试剂盒均购自Ｔａｋａｒａ公司ꎻ转染试剂ＭＡＸ由本室配制ꎻｍＣＸＣＬ２蛋白购自亿翘神州公司ꎮＣＯ２培养箱㊁Ｔ２５细胞培养瓶均购自Ｔｈｅｒｍｏｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ公司ꎻＩＸ７１倒置荧光显微镜购自Ｏｌｙｍｐｕｓ公司ꎻ流式细胞仪购自于美国ＢＤ公司ꎻ４ħ离心机购自德国Ｅｐｐｅｎｄｏｒｆ公司ꎻ超速离心机购自Ｂｅｃｋｍａｎ公司ꎻＬｉｇｈｔｃｙｃｌｅｒ４８０ＰＣＲ仪购自罗氏公司ꎮ１.４㊀ＢＭＳＣ的分离、鉴定㊀采用全骨髓贴壁法培养小鼠ＢＭＳＣ[９]ꎮ将小鼠颈椎脱臼法处死ꎬ置于７５％乙醇中浸泡消毒５ｍｉｎꎻ于超净台中剪开皮肤ꎬ剥开肌肉ꎬ分离小鼠双侧股骨ꎬ剪去两端软骨ꎻ用１ｍＬ注射器吸取含１０％血清㊁１％双抗的ＤＭＥＭ培养基反复冲洗骨髓腔ꎬ直至骨髓腔发白ꎻ收集细胞悬液于Ｔ２５培养瓶中ꎮ将其放入３７ħ５％ＣＯ２培养箱中培养ꎬ首次４８ｈ后换液ꎬ以后视细胞状态而定ꎬ约２ｄ换液１次ꎮ传至第３代ꎬ常规消化细胞ꎻ按流式抗体说明书通过流式细胞术检测干细胞表面标志分子ＣＤ４５㊁ＣＤ３４㊁ＣＤ４４㊁ＳＣＡ￣１㊁ＩＡ/ＩＥꎬ并按诱导分化培养基试剂盒说明书诱导ＢＭＳＣ成骨分化ꎬ茜素红染色鉴定ꎮ１.５㊀ｃｘｃｒ２过表达的慢病毒载体构建及慢病毒包装１.５.１㊀ｃｘｃｒ２基因片段的制备㊀根据Ｇｅｎｂａｎｋ中的ｃｘｃｒ２设计引物ꎬ以质粒(ｐＣＭＶ３￣ＧＦＰＳｐａｒｋ￣ＣＸＣＲ２)为模板进行ＰＣＲ扩增ꎮ引物序列如下:Ｆ:ＧＡＣＧＴＣＧＣＴＡＧＣＧＧＡＴＣＣＧＧＣＴＴＣＣＡＣＣＡＴＧＧＧＡＧＡＡＴＴＣＡＡＧＧＴＧＧＡ(含ＮｈｅＩ和ＢａｍＨＩ酶切位点)ꎻＲ:ＧＡＣＧＴＣＡＣＧＣＧＴＧＡＧＧＧＴＡＧＴＡＧＡＧＧＴＧＴＴＴＧ(含ＭｌｕＩ酶切位点)ꎮ引物由擎科泽西生物技术公司合成ꎮＰＣＲ反应体系为模板ＤＮＡ２μＬꎬ上㊁下游引物各１.５μＬꎬ５ˑＰｒｉｍｅＳＴＡＲＢｕｆｆｅｒ１０μＬꎬｄＮＴＰＭｉｘｔｕｒｅ４μＬꎬＰｒｉｍｅＳＴＡＲＤＮＡ聚合酶０.５μＬꎬ加超纯水至５０μＬꎮＰＣＲ反应条件为:９８ħ变性１０ｓꎬ５５ħ退火５ｓꎬ７２ħ延伸７５ｓꎬ３０个循环ꎮＰＣＲ产物进行１.０％琼脂糖凝胶电泳鉴定后ꎬ按照ＤＮＡ凝胶回收试剂盒说明书回收ＤＮＡ片段ꎮ１.５.２㊀重组质粒ｐＬｅｎｔｉ￣ｃｘｃｒ２￣ＧＺ的构建及鉴定㊀用ＮｈｅＩ和ＭｌｕＩ分别对ｃｘｃｒ２ＰＣＲ产物和ｐＣＩ￣ｎｅｏ￣ＣＤ４０Ｌ￣ＧＺ进行双酶切ꎬ并分别进行胶回收ｃｘｃｒ２基因片段和ｐＣＩ￣ｎｅｏ￣ＧＺꎬ用Ｔ４ＤＮＡ连接酶连接后ꎬ用Ｓｔｂｌ３感受态细菌转化ꎬ涂布含有氨苄抗性的琼脂培养基ꎬ过夜培养后挑出单克隆并接种ꎬ３７ħ培养１２~１６ｈ后ꎬＰＣＲ鉴定得到阳性克隆保存甘油菌ꎬ并收集菌体沉淀ꎬ按质粒小量提取ＤＮＡ试剂盒说明书提取质粒ꎬ命名为ｐＣＩ￣ｎｅｏ￣ｃｘｃｒ２￣ＧＺꎮ之后ꎬ将其与ｐＬｅｎｔｉ￣ＣＤ４０Ｌ￣ＧＺ用ＢａｍＨＩ和ＳａｌＩ酶切ꎬ分别获得目的片段ｃｘｃｒ２￣ＧＺ和ｐＬｅｎｔｉ载体ꎬ连接后将连接产物转化Ｓｔｂｌ３感受态细菌ꎬ操作同前法ꎬ菌液ＰＣＲ鉴定单克隆菌落ꎬ鉴定正确菌落委托擎科泽西生物技术公司进行双向测序ꎬ测序结果于ＮＣＢＩ￣ＢＬＡＳＴ网站(ｈｔｔｐｓ://ｂｌａｓｔ.ｎｃｂｉ.ｎｌｍ.ｎｉｈ.ｇｏｖ/)进行比对ꎬ序列正确菌落命名为ｐＬｅｎｔｉ￣ｃｘｃｒ２￣ＧＺꎮ１.５.３㊀ｐＬｅｎｔｉ￣ｃｘｃｒ２￣ＧＺ慢病毒的包装㊀将重组质粒ｐＬｅｎｔｉ￣ｃｘｃｒ２￣ＧＺ１２μｇ与ｐｓＰＡＸ２９μｇ㊁ｐＭＤ２.Ｇ６μｇ混合后ꎬ加入转染试剂(ＭＡＸ溶液)８１μＬꎬ轻柔混匀ꎬ待其形成ＤＮＡ￣脂质体复合物后ꎬ转染ＨＥＫ￣２９３Ｔ细胞ꎮ将细胞放置于３７ħ５％ＣＯ２培养箱孵育４８ｈꎬ收集上清后加入ＤＭＥＭ培养液ꎬ７２ｈ后再次收集上清液ꎬ使用０.４５μｍ滤器过滤细胞碎片ꎬ收集病毒上清液ꎬ２０％蔗糖作为垫子ꎬ以１０００００ˑｇ离心４ｈꎬ超速离心法沉淀浓缩和纯化慢病毒ꎬ收集并分装ｐＬｅｎｔｉ￣ｃｘｃｒ２￣ＧＺ病毒液ꎬ于－８０ħ保存ꎮ１.６㊀ｐＬｅｎｔｉ￣ｃｘｃｒ２￣ＧＺ稳定转染ＢＭＳＣ的构建及筛选㊀将第３代的小鼠ＢＭＳＣ铺于６孔板中ꎬ培养至细胞汇合度达到６０％~７０％时ꎬ每孔加入２ｍＬｐＬｅｎｔｉ￣ｃｘｃｒ２￣ＧＺ病毒液和ＤＭＥＭ培养基的混合液(按１ʒ１比例)３７ħꎬ１０００ˑｇ离心感染２ｈꎬ弃去病毒液ꎬ加入含有１０％ＦＢＳ的ＤＭＥＭ培养基于３７ħ５％ＣＯ２培养箱中继续培养ꎬ４８ｈ后荧光显微镜下观察绿色荧光蛋白(ｇｒｅｅｎｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｔｐｒｏｔｅｉｎꎬＧＦＰ)的表达ꎮ然后加入含有１μｇ/ｍＬｚｅｏｃｉｎ的培养液２ｍＬ进行筛选ꎬ每３~４ｄ更换该培养液ꎬ直至不表达绿色荧光的细胞全部死亡ꎮ经过１４~２１ｄ的筛选后ꎬ获得了稳定表达ＣＸ￣ＣＲ２的小鼠ＢＭＳＣ(ＣＸＣＲ２￣ＢＭＳＣ)ꎬ同时设置未处理的ＢＭＳＣ作为对照组ꎮ１.７㊀稳定转染细胞系鉴定１.７.１㊀流式细胞术检测ＣＸＣＲ２蛋白表达㊀常规消化ＣＸＣＲ２￣ＢＭＳＣꎬ加入预冷的缓冲液(ＰＢＳ加入１％胎牛血清)洗涤２次后ꎬ调整细胞浓度为１ˑ１０５个/孔后加入１μＬＰＥ标记ＣＸＣＲ２抗体ꎬ避光冰浴３０ｍｉｎꎻ洗涤２次后ꎬ用２００μＬＰＢＳ重悬ꎬ用流式细胞仪检测ＣＸＣＲ２蛋白的表达ꎮ１.７.２㊀Ｒｅａｌ￣ｔｉｍｅＰＣＲ检测ｃｘｃｒ２ｍＲＮＡ的表达㊀按照先锋ＲＮＡ快速提取试剂盒说明书分别提取未感染正常ＢＭＳＣ和ＣＸＣＲ２￣ＢＭＳＣ的总ＲＮＡꎬ并用微黑子核酸测定仪定量ꎮ取５００ｎｇ总ＲＮＡ用逆转录试剂盒制备ｃＤＮＡꎬ然后按照ＴａｋａｒａＳＹＢＲｇｒｅｅｎ试剂盒说明书用Ｌｉｇｈｔｃｙｃｌｅｒ４８０ＰＣＲ仪进行荧光定量ＰＣＲꎮ根据目的基因设计Ｒｅａｌ￣ｔｉｍｅＰＣＲ引物ꎬ序列如下:ｃｘｃｒ２:Ｆ:ＡＴＧＣＣＣＴＣＣＴＡＴＴＣＴＧＣＣＡＧＡＴꎻＲ:ＧＴＧＣＴＣＣＧＧＴＴＧＴＡＴＡＡＧＡＴＧＡＣ￣３ꎻβ￣ａｃｔｉｎ:Ｆ:ＴＧＡＣＧＧＧＧＴＣＡＣＣＣＡＣＡＣＴＧꎻＲ:ＡＡＧＣＴＧＴＡＧＣＣＧＣＧＣＴＣＧＧＴꎮ以β￣ａｃｔｉｎ为内参基因ꎬ检测试验组(ＣＸＣＲ２￣ＢＭＳＣ)及对照组(ＢＭＳＣ)细胞中上述目的基因ｍＲ￣ＮＡ的相对表达量ꎮＰＣＲ引物由擎科泽西生物技术公司合成ꎮ１.８㊀Ｔｒａｎｓｗｅｌｌ趋化试验㊀在２４孔Ｔｒａｎｓｗｅｌｌ的上室中接种ＣＸＣＲ２￣ＢＭＳＣ或ＢＭＳＣꎬ接种密度为１ˑ１０５个/孔ꎬ下室加入６００μＬ趋化缓冲液或正常缓冲液ꎮ实验分为４组:①小室上室加入培养的ＣＸＣＲ２￣ＢＭ￣ＳＣꎬ下室加入含１００ｎｇ/ｍＬｍＣＸＣＬ２正常培养液ꎬ命名为ＣＸＣＲ２￣ＢＭＳＣ￣ｍＣＸＣＬ２组ꎻ②小室上室加入培养的ＣＸＣＲ２￣ＢＭＳＣꎬ下室不加任何刺激物ꎬ命名为ＣＸＣＲ２￣ＢＭＳＣ￣正常组ꎻ③小室上室加入培养的ＢＭ￣ＳＣꎬ下室加入含１００ｎｇ/ｍＬｍＣＸＣＬ２正常培养液ꎬ命名为ＢＭＳＣ￣ｍＣＸＣＬ２组ꎻ④小室上室加入培养的ＢＭＳＣꎬ下室不加任何刺激物ꎬ命名为ＢＭＳＣ￣正常组ꎮ每组均放置于３７ħ㊁５％ＣＯ２培养箱孵育１２ｈ后用棉签擦去上室内细胞ꎬ用４％多聚甲醛固定１５ｍｉｎꎬ倒置风干后用０.１％的结晶紫染色２０ｍｉｎꎬ在显微镜下对上室底部反面的细胞进行计数ꎬ每组设３个复孔ꎬ每孔随机计数５个视野(２００ˑ)下迁移至膜背面的细胞数ꎮ１.９㊀统计学方法㊀应用ＧｒａｐｈｐａｄＰｒｉｓｍ５和ＳＰＳＳ１７软件进行统计分析ꎮ基因ｍＲＮＡ的相对表达量采用ｔ检验进行比较ꎻ各组迁移的细胞数采用单因素方差分析进行比较ꎬ两两比较采用ＳＮＫ检验ꎬＰ<０.０５为差异有统计学意义ꎮ２㊀结㊀果２.１㊀ＢＭＳＣ分离及鉴定２.１.１㊀小鼠ＢＭＳＣ形态㊀在显微镜下可以看到ꎬ刚分离的骨髓细胞大多悬浮并呈圆形ꎬ２４ｈ后见大量贴壁细胞ꎬ７２ｈ后贴壁细胞大多呈纺锤型㊁梭形和圆形ꎬ大约１２ｄ细胞长满ꎮ随着培养时间和传代次数的增加ꎬ细胞形态逐渐形似呈梭形ꎬ见图１ꎮ㊀注:Ａ.培养３ｄ的细胞形态ꎻＢ.培养１２ｄ的细胞形态ꎮ图１㊀小鼠ＢＭＳＣ形态(２００ˑ)Ｆｉｇ.１㊀Ｍｏｒｐｈｏｌｏｇｙｏｆｍｏｕｓｅｂｏｎｅｍａｒｒｏｗｍｅｓｅｎｃｈｙｍａｌｓｔｅｍｃｅｌｌｓ(２００ˑ)２.１.２㊀ＢＭＳＣ表面标志分子流式鉴定㊀流式结果显示ꎬ超过９０％的细胞表达ＣＤ４４㊁ＳＣＡ￣１ꎬ但几乎不表达ＩＡ/ＩＥ㊁ＣＤ３４㊁ＣＤ４５ꎬＢＭＳＣ表面标志分子鉴定ꎬ见图２ꎮ㊀注:Ａ.ＣＤ４４ꎻＢ.ＳＣＡ￣１ꎻＣ.ＣＤ４５ꎻＤ.ＣＤ３４ꎻＥ.ＩＡ/ＩＥꎮ图２㊀ＢＭＳＣ表面标志分子鉴定Ｆｉｇ.２㊀Ｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎｏｆｓｕｒｆａｃｅｍａｒｋｅｒｆｏｒｍｏｕｓｅｂｏｎｅｍａｒｒｏｗｍｅｓｅｎｃｈｙｍａｌｓｔｅｍｃｅｌｌｓ２.１.３㊀诱导ＢＭＳＣ成骨分化㊀成骨诱导２１ｄ后ꎬ细胞呈结节状ꎬ茜素红染色呈红色ꎬ见图３ꎮ表明成骨分化诱导成功ꎮ提示分离获得的小鼠ＢＭＳＣ符合国际细胞治疗协会制定的间充质干细胞标准ꎮ图３㊀ＢＭＳＣ成骨诱导分化(２００ˑ)Ｆｉｇ.３㊀Ｉｎｄｕｃｔｉｏｎｏｆｏｓｔｅｏｇｅｎｉｃｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｉｏｎｆｏｒｍｏｕｓｅｂｏｎｅｍａｒｒｏｗｍｅｓｅｎｃｈｙｍａｌｓｔｅｍｃｅｌｌｓ(２００ˑ)２.２㊀ｃｘｃｒ２慢病毒载体的构建㊀琼脂糖电泳结果显示ꎬ扩增的目的条带单一㊁特异ꎬ之后菌液ＰＣＲ鉴定㊁酶切鉴定㊁测序分析结果均表明成功构建了慢病毒载体ｐＬｅｎｔｉ￣ｃｘｃｒ２￣ＧＺꎬ见图４ꎮ２.３㊀ｐＬｅｎｔｉ￣ｃｘｃｒ２￣ＧＺ稳定转染ＢＭＳＣ的构建及筛选㊀将ｐＬｅｎｔｉ￣ｃｘｃｒ２￣ＧＺ质粒与慢病毒包装质粒共同转染ＨＥＫ￣２９３Ｔ细胞ꎬ获得慢病毒后浓缩感染ＢＭ￣ＳＣꎬＢＭＳＣ经过Ｚｅｏｃｉｎ压力选择３周后ꎬ可在倒置荧光显微镜下观察到绿色荧光ꎬ对照组未见绿色荧光ꎬ见图５ꎮ２.４㊀稳定转染细胞系鉴定㊀流式鉴定大约７８.５％的细胞表达ＧＦＰꎬ７５.７％的细胞表达ＣＸＣＲ２ꎮＲｅａｌ￣ｔｉｍｅＰＣＲ结果显示ꎬ试验组的ｃｘｃｒ２ｍＲＮＡ表达水平明显高于对照组ꎬ差异具有统计学意义(Ｐ<０.００１)ꎮ提示ＣＸＣＲ２￣ＢＭＳＣ构建成功ꎬ见图６ꎮ㊀注:Ａ.ｃｘｃｒ２基因片段的制备ꎻＢ.ｐＬｅｎｔｉ￣ｃｘｃｒ２￣ＧＺ菌液ＰＣＲ鉴定ꎻＣ.ｐＬｅｎｔｉ￣ｃｘｃｒ２￣ＧＺ质粒双酶切鉴定ꎻＤ.测序结果在ＮＣＢＩＢＬＡＳＴ比对ꎮ图４㊀ｃｘｃｒ２真核表达载体的构建Ｆｉｇ.４㊀Ｃｏｎｓｔｒｕｃｔｉｏｎｏｆｃｘｃｒ２ｅｕｋａｒｙｏｔｉｃｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎｖｅｃｔｏｒ㊀注:Ａ.过表达ＣＸＣＲ２的ＢＭＳＣ的荧光图片ꎻＢ.未感染正常对照ＢＭＳＣ的荧光图片ꎮ图５㊀ｐＬｅｎｔｉ￣ｃｘｃｒ２￣ＧＺ稳定转染ＢＭＳＣ荧光表达(４００ˑ)Ｆｉｇ.５㊀ＦｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎｏｆＢＭＳＣｔｒａｎｓｆｅｃｔｅｄｂｙｐＬｅｎｔｉ￣ｃｘｃｒ２￣ＧＺ(４００ˑ)㊀注:Ａ.流式细胞仪检测ＧＦＰ表达ꎻＢ.流式细胞仪检测ＣＸＣＲ２表达ꎻＣ.Ｒｅａｌ￣ｔｉｍｅＰＣＲ检测过表达ＣＸＣＲ２的小鼠ＢＭＳＣ中ｃｘｃｒ２ｍＲＮＡ表达ꎮ∗∗∗.Ｐ<０.００１ꎮ图６㊀ＣＸＣＲ２修饰的ＢＭＳＣ的鉴定结果Ｆｉｇ.６㊀ＩｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎｏｆＣＸＣＲ２ｍｏｄｉｆｉｅｄＢＭＳＣ２.５㊀ｃｘｃｒ２基因修饰的ＢＭＳＣ迁移能力增强㊀Ｔｒａｎ￣ｓｗｅｌｌ结果显示ꎬＣＸＣＲ２￣ＢＭＳＣ￣ｍＣＸＣＬ２组在含有１００ｎｇ/ｍＬ的ｍＣＸＣＬ２的趋化液中穿过小室的数目明显高于ＢＭＳＣ￣ｍＣＸＣＬ２组ꎬＴｒａｎｓｗｅｌｌ实验检测细胞迁移ꎬ见图７ꎮ表明ｃｘｃｒ２基因修饰ＢＭＳＣ可增强其趋化潜能ꎮ㊀注:Ａ.ＣＸＣＲ２￣ＢＭＳＣ￣ｍＣＸＣＬ２组ꎻＢ.ＣＸＣＲ２￣ＢＭＳＣ￣正常组ꎻＣ.ＢＭＳＣ￣ｍＣＸＣＬ２组ꎻＤ.ＢＭＳＣ￣正常组ꎻＥ.２４ｈ后不同组别穿过膜下的细胞数ꎮ∗∗.Ｐ<０.０１ꎮ图７㊀Ｔｒａｎｓｗｅｌｌ实验检测细胞迁移(２００ˑ)Ｆｉｇ.７㊀Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎｏｆｃｅｌｌｍｉｇｒａｔｉｏｎｂｙｔｒａｎｓｗｅｌｌａｓｓａｙ(２００ˑ)３㊀讨㊀论２０世纪７０年代ꎬＦＲＩＥＤＥＮＳＴＥＩＮ等[１０]首次利用贴壁法从骨髓分离得到ＢＭＳＣꎮ由于其来源方便ꎬ易于分离培养ꎬ且具有多向分化㊁免疫调节㊁输送治疗剂的能力ꎬ是较好的组织工程细胞和基因载体细胞ꎬ常被用于免疫与炎症性疾病的基础和临床研究[１１－１２]ꎮ通过静脉或腹腔移植的ＭＳＣ会沿着趋化梯度向受损组织迁移ꎬ在靶组织中检出率有限(只有不到１％)ꎬ大大降低了其治疗效应ꎮ可能的原因是ＭＳＣ表面趋化因子受体的表达较低ꎮ研究发现ꎬ趋化因子及其受体在ＢＭＳＣ的归巢中起着重要作用ꎬＢＭＳＣ表面的趋化因子受体通常支配着血管内循环细胞的黏附和滚动[１３－１４]ꎮＣＨＥＮ等[１５]研究发现ꎬｃｘｃｒ４过表达的ＢＭＳＣ在小鼠结肠炎模型中可增强ＢＭＳＣ向受损肠黏膜的归巢ꎬ对治疗结肠炎有较好的疗效ꎮＨＯＥＧＬ等[１６]研究发现ꎬ在内毒素所致的肺损伤中趋化因子ＣＸＣＬ１㊁ＣＸＣＬ２高表达ꎬＮＫ细胞通过ＣＸＣＲ２介导参与中性粒细胞向肺部炎症部位的募集ꎮ因此ꎬ对ＢＭＳＣ基因修饰趋化因子受体成为提高归巢能力的新策略[１７－１８]ꎮ研究通过全骨髓贴壁法分离培养ＢＭＳＣꎬ使用ＤＭＥＭ培养基进行培养ꎬ经过换液㊁传代去除了杂细胞ꎬ从而获得了纯度较高的ＢＭＳＣꎮ为了检测其是否符合干细胞标准ꎬ通过流式检测干细胞表面标志ＳＣＡ￣１㊁ＣＤ４４㊁ＣＤ４３㊁ＣＤ４５㊁ＩＡ/ＩＥꎬ结果显示ꎬ其高表达ＣＤ４４㊁ＳＣＡ￣１ꎬ几乎不表达ＩＡ/ＩＥ㊁ＣＤ３４㊁ＣＤ４５ꎬ通过诱导成骨分化观察到茜素红染色阳性的钙结节沉积ꎮ上述结果表明通过全骨髓贴壁法培养出符合细胞表型㊁具有分化潜能的ＢＭＳＣꎮ由于小鼠的ＢＭＳＣ具有感染率低的特点ꎬ研究通过慢病毒载体与慢病毒包装质粒共转染至ＨＥＫ￣２９３Ｔ细胞获得慢病毒ꎬ经超速离心沉淀法浓缩纯化ꎬ获得ｃｘｃｒ２过表达的慢病毒ꎮ通过离心法进行感染ꎬ利用抗性筛选提高阳性细胞的比例ꎬ从而使得ＣＸＣＲ２能稳定表达ꎮ荧光显微镜可以观察到稳定表达ＣＸＣＲ２的ＢＭＳＣ具有绿色荧光ꎻ流式细胞和ＲＴ￣ＰＣＲ结果显示ꎬＣＸＣＲ２蛋白和ｍＲＮＡ表达水平均明显高于正常ＢＭＳＣꎬ证实成功构建稳定表达ＣＸ￣ＣＲ２的ＢＭＳＣꎮ通过Ｔｒａｎｓｗｅｌｌ趋化试验比较了ｃｘｃｒ２修饰的ＢＭＳＣ与普通ＢＭＳＣ的迁移和归巢ꎮ结果表明ꎬｃｘ￣ｃｒ２修饰的ＢＭＳＣ更容易迁移ꎬ提示ＣＸＣＲ２参与了ＢＭＳＣ的迁移与归巢ꎮ综上所述ꎬ研究成功构建了ｃｘｃｒ２修饰的ＢＭ￣ＳＣꎬ为进一步研究其直接移植治疗临床疾病及其作用机制奠定了基础ꎮ参考文献[１]㊀ＵＬＬＡＨＩꎬＳＵＢＢＡＲＡＯＲＢꎬＲＨＯＧＪ.Ｈｕｍａｎｍｅｓｅｎｃｈｙｍａｌｓｔｅｍｃｅｌｌｓ￣ｃｕｒｒｅｎｔｔｒｅｎｄｓａｎｄｆｕｔｕｒｅｐｒｏｓｐｅｃｔｉｖｅ[Ｊ].ＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅＲｅｐꎬ２０１５ꎬ３５(２):１￣１８.[２]㊀ＲＯＳＴＡＭＩＭꎬＨＡＩＤＡＲＩＫꎬＳＨＡＨＢＡＺＩＭ.Ｇｅｎｅｔｉｃａｌｌｙｅｎｇｉ￣ｎｅｅｒｅｄａｄｉｐｏｓｅｍｓｅｎｃｈｙｍａｌｓｔｅｍｃｅｌｌｓｕｓｉｎｇＨＩＶ￣ｂａｓｅｄｌｅｎｔｉｖｉｒａｌｖｅｃｔｏｒｓａｓｇｅｎｅｔｈｅｒａｐｙｆｏｒａｕｔｏｉｍｍｕｎｅｄｉｓｅａｓｅｓ[Ｊ].ＣｅｌｌＲｅｐｒｏ￣ｇｒａｍꎬ２０１８.ＤＯＩ:１０.１０８９/ｃｅｌｌ.２０１８.０００６.[３]㊀ＳＨＡＨＫꎬＺＨＡＯＡＧꎬＳＵＭＥＲＨ.Ｎｅｗａｐｐｒｏａｃｈｅｓｔｏｔｒｅａｔｏｓｔｅｏ￣ａｒｔｈｒｉｔｉｓｗｉｔｈｍｅｓｅｎｃｈｙｍａｌｓｔｅｍｃｅｌｌｓ[Ｊ].ＳｔｅｍＣｅｌｌｓＩｎｔꎬ２０１８ꎬ２０１８:５３７３２９４.[４]㊀ＬＥＢＬＡＮＣＫꎬＭＯＵＧＩＡＫＡＫＯＳＤ.Ｍｕｌｔｉｐｏｔｅｎｔｍｅｓｅｎｃｈｙｍａｌｓｔｒｏｍａｌｃｅｌｌｓａｎｄｔｈｅｉｎｎａｔｅｉｍｍｕｎｅｓｙｓｔｅｍ[Ｊ].ＮａｔＲｅｖＩｍｍｕ￣ｎｏｌꎬ２０１２ꎬ１２(５):３８３￣３９６.[５]㊀ＣＨＥＮＸꎬＺＨＡＮＧＹꎬＷＡＮＧＷꎬｅｔａｌ.Ｍｅｓｅｎｃｈｙｍａｌｓｔｅｍｃｅｌｌｓｍｏｄｉｆｉｅｄｗｉｔｈｈｅｍｅｏｘｙｇｅｎａｓｅ￣１ｈａｖｅｅｎｈａｎｃｅｄｐａｒａｃｒｉｎｅｆｕｎｃｔｉｏｎａｎｄａｔｔｅｎｕａｔｅｌｉｐｏｐｏｌｙｓａｃｃｈａｒｉｄｅ￣ｉｎｄｕｃｅｄｉｎｆｌａｍｍａｔｏｒｙａｎｄｏｘｉｄａ￣ｔｉｖｅｄａｍａｇｅｉｎｐｕｌｍｏｎａｒｙｍｉｃｒｏｖａｓｃｕｌａｒｅｎｄｏｔｈｅｌｉａｌｃｅｌｌｓ[Ｊ].ＣｅｌｌＰｈｙｓｉｏｌＢｉｏｃｈｅｍꎬ２０１８ꎬ４９(１):１０１￣１２２.[６]㊀ＸＵＸＰꎬＨＵＡＮＧＬＬꎬＨＵＳＬꎬｅｔａｌ.ＧｅｎｅｔｉｃｍｏｄｉｆｉｃａｔｉｏｎｏｆｍｅｓｅｎｃｈｙｍａｌｓｔｅｍｃｅｌｌｓｏｖｅｒｅｘｐｒｅｓｓｉｎｇａｎｇｉｏｔｅｎｓｉｎＩＩｔｙｐｅ２ｒｅｃｅｐ￣ｔｏｒｉｎｃｒｅａｓｅｓｃｅｌｌｍｉｇｒａｔｉｏｎｔｏｉｎｊｕｒｅｄｌｕｎｇｉｎＬＰＳ￣ｉｎｄｕｃｅｄａｃｕｔｅｌｕｎｇｉｎｊｕｒｙｍｉｃｅ[Ｊ].ＳｔｅｍＣｅｌｌｓＴｒａｎｓｌＭｅｄꎬ２０１８ꎬ７(１０):７２１￣７３０.[７]㊀ＳＴＥＷＡＲＴＡＮꎬＭＡＴＹＡＳＪＪꎬＷＥＬＣＨＫＯＲＭꎬｅｔａｌ.ＳＤＦ￣１ｏｖｅｒｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎｂｙｍｅｓｅｎｃｈｙｍａｌｓｔｅｍｃｅｌｌｓｅｎｈａｎｃｅｓＧＡＰ￣４３￣ｐｏｓｉ￣ｔｉｖｅａｘｏｎａｌｇｒｏｗｔｈｆｏｌｌｏｗｉｎｇｓｐｉｎａｌｃｏｒｄｉｎｊｕｒｙ[Ｊ].ＲｅｓｔｏｒＮｅｕｒｏｌＮｅｕｒｏｓｃｉꎬ２０１７ꎬ３５(４):３９５￣４１１.[８]㊀ＨＥＲＴＺＥＲＫＭꎬＤＯＮＡＬＤＧＷꎬＨＩＮＥＳＯＪ.ＣＸＣＲ２:ａｔａｒｇｅｔｆｏｒｐａｎｃｒｅａｔｉｃｃａｎｃｅｒｔｒｅａｔｍｅｎｔ?[Ｊ].ＥｘｐｅｒｔＯｐｉｎＴｈｅｒＴａｒｇｅｔｓꎬ２０１３ꎬ１７(６):６６７￣６８０.[９]㊀ＳＯＬＥＩＭＡＮＩＭꎬＮＡＤＲＩＳ.Ａｐｒｏｔｏｃｏｌｆｏｒｉｓｏｌａｔｉｏｎａｎｄｃｕｌｔｕｒｅｏｆｍｅｓｅｎｃｈｙｍａｌｓｔｅｍｃｅｌｌｓｆｒｏｍｍｏｕｓｅｂｏｎｅｍａｒｒｏｗ[Ｊ].ＮａｔＰｒｏｔｏｃꎬ２００９ꎬ４(１):１０２￣１０６.[１０]㊀ＦＲＩＥＤＥＮＳＴＥＩＮＡＪꎬＣＨＡＩＬＡＫＨＪＡＮＲＫꎬＬＡＬＹＫＩＮＡＫＳ.Ｔｅｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔｏｆｆｂｒｏｂｌａｓｔｃｏｌｏｎｉｅｓｉｎｍｏｎｏｌａｙｅｒｃｕｌｔｕｒｅｓｏｆｇｕｉｎｅａ￣ｐｉｇｂｏｎｅｍａｒｒｏｗａｎｄｓｐｌｅｅｎｃｅｌｌｓ[Ｊ].ＣｅｌｌａｎｄＴｉｓｓｕｅＫｉ￣ｎｅｔｉｃｓꎬ１９７０ꎬ３:３９５￣４０３.[１１]㊀ＦＲＥＮＥＴＴＥＰＳꎬＰＩＮＨＯＳꎬＬＵＣＡＳＤꎬｅｔａｌ.Ｍｅｓｅｎｃｈｙｍａｌｓｔｅｍｃｅｌｌ:ｋｅｙｓｔｏｎｅｏｆｔｈｅｈｅｍａｔｏｐｏｉｅｔｉｃｓｔｅｍｃｅｌｌｎｉｃｈｅａｎｄａｓｔｅｐ￣ｐｉｎｇ￣ｓｔｏｎｅｆｏｒｒｅｇｅｎｅｒａｔｉｖｅｍｅｄｉｃｉｎｅ[Ｊ].ＡｎｎｕＲｅｖＩｍｍｕｎｏｌꎬ２０１３ꎬ３１:２８５￣３１６.[１２]㊀ＬＩＸꎬＷＡＮＧＭꎬＪＩＮＧＸꎬｅｔａｌ.Ｂｏｎｅｍａｒｒｏｗａｎｄａｄｉｐｏｓｅｔｉｓｓｕｅ￣ｄｅｒｉｖｅｄｍｅｓｅｎｃｈｙｍａｌｓｔｅｍｃｅｌｌｓ:ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎꎬｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａ￣ｔｉｏｎꎬａｎｄａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓｉｎｃａｒｔｉｌａｇｅｔｉｓｓｕｅｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ[Ｊ].ＣｒｉｔＲｅｖＥｕｋａｒｙｏｔＧｅｎｅＥｘｐｒꎬ２０１８ꎬ２８(４):２８５￣３１０.[１３]㊀ＩＤＯＲＮＭꎬＴＨＯＲＳＰ.Ｃｈｅｍｏｋｉｎｅｒｅｃｅｐｔｏｒｓａｎｄｅｘｅｒｃｉｓｅｔｏｔａｃｋ￣ｌｅｔｈｅｉｎａｄｅｑｕａｃｙｏｆＴｃｅｌｌｈｏｍｉｎｇｔｏｔｈｅｔｕｍｏｒｓｉｔｅ[Ｊ].Ｃｅｌｌｓꎬ２０１８ꎬ７(８):Ｅ１０８.[１４]㊀ＺＨＡＮＧＸꎬＨＵＡＮＧＷꎬＣＨＥＮＸꎬｅｔａｌ.ＣＸＣＲ５￣ｏｖｅｒｅｘｐｒｅｓｓｉｎｇｍｅｓｅｎｃｈｙｍａｌｓｔｒｏｍａｌｃｅｌｌｓｅｘｈｉｂｉｔｅｎｈａｎｃｅｄｈｏｍｉｎｇａｎｄｃａｎｄｅ￣ｃｒｅａｓｅｃｏｎｔａｃｔｈｙｐｅｒｓｅｎｓｉｔｉｖｉｔｙ[Ｊ].ＭｏｌＴｈｅｒꎬ２０１７ꎬ２５(６):１４３４￣１４４７.[１５]㊀ＣＨＥＮＺꎬＣＨＥＮＱꎬＤＵＨꎬｅｔａｌ.ＭｅｓｅｎｃｈｙｍａｌｓｔｅｍｃｅｌｌｓａｎｄＣＸＣｃｈｅｍｏｋｉｎｅｒｅｃｅｐｔｏｒ４ｏｖｅｒｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎｉｍｐｒｏｖｅｄｔｈｅｔｈｅｒａｐｅｕ￣ｔｉｃｅｆｆｅｃｔｏｎｃｏｌｉｔｉｓｖｉａｍｕｃｏｓａｒｅｐａｉｒ[Ｊ].ＥｘｐＴｈｅｒＭｅｄꎬ２０１８ꎬ１６(２):８２１￣８２９.[１６]㊀ＨＯＥＧＬＳꎬＥＨＲＥＮＴＲＡＵＴＨꎬＢＲＯＤＳＫＹＫＳꎬｅｔａｌ.ＮＫｃｅｌｌｓｒｅｇｕｌａｔｅＣＸＣＲ２＋ｎｅｕｔｒｏｐｈｉｌｒｅｃｒｕｉｔｍｅｎｔｄｕｒｉｎｇａｃｕｔｅｌｕｎｇｉｎｊｕｒｙ[Ｊ].ＪＬｅｕｋｏｃｙｔｅＢｉｏｌꎬ２０１７ꎬ１０１(２):４７１￣４８０.[１７]㊀ＧＯＬＣＨＩＮＡꎬＲＥＫＡＢＧＡＲＤＡＮＭꎬＴＡＨＥＲＩＲＡꎬｅｔａｌ.Ｐｒｏ￣ｍｏｔｉｏｎｏｆｃｅｌｌ￣ｂａｓｅｄｔｈｅｒａｐｙ:ｓｐｅｃｉａｌｆｏｃｕｓｏｎｔｈｅｃｏｏｐｅｒａｔｉｏｎｏｆｍｅｓｅｎｃｈｙｍａｌｓｔｅｍｃｅｌｌｔｈｅｒａｐｙａｎｄｇｅｎｅｔｈｅｒａｐｙｆｏｒｃｌｉｎｉｃａｌｔｒｉａｌｓｔｕｄｉｅｓ[Ｊ].ＡｄｖＥｘｐＭｅｄＢｉｏｌꎬ２０１８.ＤＯＩ:１０.１００７/５５８４＿２０１８＿２５６.[１８]㊀ＫＡＲＰＪＭꎬＬＥＮＧＴＧ.Ｍｅｓｅｎｃｈｙｍａｌｓｔｅｍｃｅｌｌｈｏｍｉｎｇ:ｔｈｅｄｅｖｉｌｉｓｉｎｔｈｅｄｅｔａｉｌｓ[Ｊ].ＣｅｌｌＳｔｅｍＣｅｌｌꎬ２００９ꎬ４(３):２０６￣２１６.收稿日期:２０１８￣１０￣１６㊀修回日期:２０１８￣１２￣１２编辑:陈凌云。
第 49 卷第 4 期2023年 7 月吉林大学学报（医学版）Journal of Jilin University（Medicine Edition）Vol.49 No.4Jul.2023DOI：10.13481/j.1671‐587X.20230421Dectin-1过表达对树突状细胞成熟的抑制作用及其对小鼠心脏移植物免疫耐受的诱导作用张轶西1, 宋飞玉2, 郭义文3, 曾志贵1（1. 首都医科大学附属北京友谊医院普通外科，北京100050；2. 吉林康乃尔药业有限公司，吉林吉林132013；3. 中山大学附属第一医院器官移植科，广东广州510080）［摘要］目的目的：探讨过表达Dectin-1基因对树突状细胞（DCs）功能的影响，阐明Dectin-1基因抑制DCs成熟活化发挥免疫学功能的机制及对小鼠心脏移植物的免疫保护作用。
方法方法：小鼠骨髓干细胞诱导形成DCs后进行体外培养扩增，采用带有绿色荧光蛋白（GFP）标签的腺病毒载体将Dectin-1基因转染至DCs，经过Dectin-1基因修饰的未成熟DCs（imDCs）为DC-Dectin-1组，同时设未经病毒转染的DCs组和转染GFP（DC-GFP）组，24 h后采用免疫荧光染色法检测腺病毒转染情况，采用Western blotting法检测各组DCs中Dectin-1蛋白表达情况，采用流式细胞术和酶联免疫吸附试验（ELISA）法检测脂多糖（LPS）刺激前后各组DCs表型、功能和细胞培养上清液中白细胞介素10（IL-10）和白细胞介素12（IL-12）水平。
建立同种异体小鼠腹部异位心脏移植模型，分为DCs组、DC-GFP组和DC-Dectin-1组，于移植术后第1、3和5天分别输入DCs、DC-GFP和DC-Dectin-1，移植术后第7天HE染色观察各组小鼠心脏移植物病理形态表现，TUNEL染色观察各组小鼠心脏移植物细胞凋亡情况，观察各组小鼠心脏移植物中位存活时间（MST）。
