原代小鼠心肌成纤维细胞提取

分离小鼠原代心肌细胞与大鼠原代细胞分离有所不同方法：1、所有器械（四把镊子两把剪刀）放在75%酒精中浸泡6 h以上。

2、用PBS溶液（过滤灭菌）配制0.075%胰酶20mL备用（胰酶原液0.25%，6ml原液可以稀释至20ml）。

3、新生（1天）乳小鼠15-20只，器械在酒精灯上灼烧消毒备用。

4、准备两个冰盒，在其中一个冰盒中放两个平皿，皿内盛放PBS溶液（无色），把灼烧后的一把镊子倒插在该冰盒中（用于涮洗心脏）。

另一个冰盒中同样放两个平皿，其一放PBS溶液，其二放1 mL0.075%胰酶，同样把灼烧后的一把镊子和一把剪刀（用于剪碎心脏）倒插在该冰盒中，所剩的两把镊子和一把剪刀灼烧后倒置用于解剖，切勿污染。

5、乳鼠两只一组处死消毒取样，方法：将其轮流放入装有75%酒精的烧杯中6 s即可。

6、从胸骨下端开始向上解剖乳鼠，剪至颈部，打开胸腔，挤出心脏，用镊子取心脏心室部分放入第一个成有PBS溶液的平皿中，速度越快越好，以保持心肌细胞的活性。

7、待取完所有心脏后，在冰盒中使用冰盒中的镊子涮洗和挤压心脏以尽量除去心脏中的血液，置于冰盒中的另一个平皿中，继续洗去血液，若有心脏上存有心房则用镊子拔去，可使用第二个冰盒中的镊子，依次放入第三个皿（第二个冰盒）中洗净。

8、将洗净的心脏放入第四个放有1 mL 0.075%胰酶的平皿中，将皿倾斜，使心脏全部浸入胰酶的平皿中，将皿倾斜，使心脏全部浸入胰酶中，用剪刀剪碎心脏后，吸入所剩的149mL胰酶中4 ℃消化24h。

9、消化24h后，吸出11mL胰酶，加入9 mL0.1%的胶原酶Ⅱ（此时浓度为0.05%，配胶原酶需用0.2 μm滤器过滤），将18 mL的细胞液装入高压过的小烧杯中，加入磁力棒，在磁力搅拌器上搅拌30 min，温度维持在34-35 ℃左右，120 rpm。

10、配制两种培养液，DMEM-F12 10%FBS，DMEM-F12 15%FBS Brdu（10 mg/mL的Brdu母液，在DMEM-F12 15%FBS中每20mL加67μL，心肌细胞对Brdu的耐受性较其他细胞高，以保护心肌细胞减少其他细胞主要是成纤维细胞的污染）。

一、细胞室灭菌1.将酒精灯、止血钳、枪、滴管架子、离心管架子、器械饭盒等清点无误后置于超净台内，紫外照射20-30min。

2.（注：物品不可重叠放置，否则会遮挡射线。

培养细胞和培养用液不可照射紫外。

）3.将实验服等摊开置于培养室，打开紫外照射20-30min。

4.紫外照射结束后，打开超净台风机，吹10min，吹走O3。

5.（注：若超净台内物品不全，向台内拿取物品前，应先用75%酒精喷洒消毒。

）二、胶原酶1的配置分离心肌细胞的胶原酶1浓度为：10mg胶原酶/12ml PBS。

具体方法为：（以下过程均在超净台内操作）1.称取10mg胶原酶于小烧杯中。

2.加入12ml PBS溶液。

3.灼烧止血钳，夹出青霉素小瓶，灼烧备用。

4.用10ml一次性无菌注射器吸取小烧杯中溶液，用一次性无菌滤器过滤于青霉素小瓶中，即得到无菌的胶原酶1溶液，呈淡土黄色。

三、取材并分离心肌细胞1.用止血钳取5-6个平皿，分别加入适量PBS溶液。

2.用止血钳夹住小烧杯壁，从器械饭盒中取出剪刀、镊子等器械。

3.准备2个小烧杯，加入75%酒精适量，一个置于超净台外，一个置于超净台内。

先将乳鼠头朝下置于外面的小烧杯中消毒2min左右，取出，拿进超净台内，置于内部的小烧杯中消毒2min.4.左手捏住乳鼠背部皮肤，暴露出胸腔，右手拿一直的小剪刀，在中间靠左处剪开皮肤，左手轻轻一捏，其心脏即弹出来。

5.剪下心室部分置于含PBS的平皿中。

6.待8只乳鼠心脏全部取定后，换手套，喷酒精。

7.左手拿镊子，右手拿剪刀，在心脏中间部位剪一刀，成“肉夹馍”形，在PBS中冲洗干净，洗去血细胞。

8.将心室转移到另一新的培养皿中，继续清洗，此时可继续打开心室，取出余血。

9.继续冲洗2-3遍，10.将洗好的心脏置于含转子的带盖玻璃瓶中（提前将转子取出置于干净处），加入2ml PBS溶液。

11.灼烧剪刀，左手拿玻璃瓶，右手拿剪刀剪碎心脏成不能再剪的碎片。

12.用枪吸掉上清，只留碎片，将转子放入玻璃瓶中，盖好盖子备用。

成年小鼠心肌成纤维细胞的分离和原代培养物品准备：6-8周成年小鼠、眼科剪、眼科镊、75%酒精、PBS缓冲液、细胞培养皿、细胞培养瓶、15ml细胞离心管、恒温水平摇床、低速水平离心机、倒置显微镜、DMEM/F12细胞培养基、胎牛血清、胶原酶II、胰蛋白酶等。

操作步骤：（1）取出2只成年小鼠心脏，并将它们置于含有冰冷的PBS的培养皿中。

（2）将心脏置于无菌细胞培养皿中，并在无菌条件下进行操作。

使用剪刀将心脏切成10块，使用解剖刀将它们缩小至1mm的尺寸。

（3）将组织小块移到盛有PBS的无菌细胞培养皿中，清洗后弃去PBS。

（4）加入2ml消化缓冲液并在37℃恒速水平摇床下消化组织5分钟。

注意：摇床速度应调整至80r，以使所有组织片流动并且不会坐在底部，但不应太强以至不能破坏细胞。

消化酶（胶原酶II: 1mg/ml，胰酶: 0.75mg/ml）（5）将混合物放置1分钟，使组织沉淀并丢弃含有碎片和血细胞的上清液。

（6）加入2ml消化缓冲液并在37℃恒速水平摇床下消化组织30分钟。

（7）将混合物放置１分钟使组织沉淀到底部，并用移液管收集上清液。

不要收集倾向于漂浮的组织碎片。

（8）将上清放入含有2ml成纤维细胞培养基的15ml细胞离心管中。

（9）800r，离心5min。

（10）将细胞重悬于3-4ml培养基中。

（11）重复步骤6-10，直到所有组织溶解（通常7-10次）。

（12）将细胞悬液平铺到细胞培养皿瓶中，并在37℃下在具有5%二氧化碳的细胞培养箱中培养２小时。

（13）２ｈ后显微镜下观察细胞汇合。

此时成纤维细胞类似于小圆点。

（14）收集并丢弃上清液。

用2.5ml温热的PBS洗涤３次，并用10ml 新鲜的成纤维细胞培养基补充。

在37℃和5%二氧化碳的细胞培养箱中培养。

实验-小鼠成纤维细胞的原代培养一、实验目的1.掌握哺乳动物细胞原代培养与传代培养中的取材、消化及无菌操作等基本实验技术与操作过程。

2.熟悉在倒置相差显微镜下观察培养细胞的形态与生长状况的方法。

3.了解细胞原代培养与传代培养的原理与方法。

二、实验原理自17世纪下半叶Robert Hooke提出“细胞”概念直至20世纪中叶,细胞培养(Cell culture)才逐渐发展起来。

现代生命科学以及相关领域的研究前提就是细胞的维持与增殖,因此,细胞培养不仅就是细胞生物学的密不可分的组成部分,而且已经成为生物化学、生物物理学、遗传学、免疫学、肿瘤学、生理学、分子生物学与神经科学、甚至临床医学的重要内容。

细胞培养也就是细胞生物学延伸至相关学科的一条主要途径。

如今,细胞培养已经成为生命科学与医学研究最常用的基础技术之一。

细胞培养就是模拟机体内生理条件,将细胞从机体中取出,在人工条件下,使其生存、生长、繁殖与传代,进行细胞生命过程、细胞癌变、细胞工程等问题的研究。

细胞培养的直接目的就是维持或扩增细胞数量。

依据取材于动物组织或培养细胞,细胞培养分为原代培养与传代培养。

1.原代培养(primary culture)就是从供体取得组织或细胞后在体外进行首次培养直至成功地进行首次传代之前的培养。

但实际上通常把第一代至第十代以内的培养细胞统称为原代细胞培养。

原代培养就是建立细胞系的第一步,其最基本的方法有两种:组织块培养法与消化培养法。

组织块培养法就是指直接从机体取下组织与器官,通过组织块直接长出单层细胞,该培养法就是最常用的原代培养方法,其将刚刚离体的、生长活力旺盛的组织剪成小块接种在培养瓶中作为实验材料,一天后细胞可从贴壁的组织块四周游出并生长。

组织块培养法操作过程简便、易行,培养的细胞较易存活,适用于一些来源有限、数量较少的组织的原代培养。

消化培养法利用酶或机械方法将组织分散成单个细胞后,在不加任何粘附剂的情况下,直接移植在培养瓶壁上,加入培养基立即进行培养的方法。

心包膜成纤维细胞的分离、培养和鉴定材料和试剂：来源：c57小鼠心脏手术器材：手术剪（镊）、解剖镊、眼科剪（镊）清洗液：PBS培养液：DMEM添加20%FBS 200IU双抗破红液：常规配方具体操作：1、将100uL的4％戊巴比妥注入C57小鼠体内，待小鼠麻醉至昏厥状态时，将小鼠转入75%的酒精最浸泡5min。

2、在无菌条件下，将小鼠放置于泡沫板上，四肢用针头固定。

3、用左手持直头眼科镊子夹住小鼠腹部最下方的皮毛，右手拿手术剪将小鼠的皮剪开，沿着腹部下方一直剪至小鼠下颚。

4、左手换一个无菌的弯头眼科镊子夹住最下方的腹腔，右手拿另一个无菌的手术剪将小鼠的腹腔剪开，剪开胸膜，找到心脏。

5、在无菌条件下，左手拿弯头眼科镊子将心脏轻轻固定，右手拿手术剪，剪去连在心脏上的结缔组织，取C57小鼠心脏，去除多余的组织，用预冷的PBS清洗3次。

6、左手拿直头眼科镊子，轻轻心脏固定，右手拿弯头眼科镊子撕取心脏的两层外包膜，尽量不带其他组织，若不小心带上其他组织，可用镊子轻轻的将其他组织捋去。

7、左手拿直头眼科镊子将分离的心包膜轻轻固定，右手用动脉剪剪成1mm³大小的组织块后，用破红液浸泡2分钟，去除血细胞，再用PBS清洗2-3次。

8、将组织块植入6孔板，组织块之间的间隙在3 mm³左右，用枪头吸取多余的液体，将6孔板倒扣在培养箱中2小时，加入培养液1mL静置培养7天，7天即可观察到心包膜成纤维细胞爬出，如图所示。

9、7天后移去组织块，待细胞长满6孔板后，用时差贴壁法纯化细胞，细胞纯度达90%以上后，可冻存保种。

结果展示：1.从细胞形态学：成纤维细胞为长梭形状，且从心包膜组织块中爬出，知道长满整瓶图1.成纤维细胞正从心包膜组织块中爬出2、荧光鉴定：使用波形蛋白Vimentin抗体进行荧光鉴定图2，用波形蛋白抗体对成纤维细胞进行免疫荧光鉴定结果图3，用波形蛋白抗体对成纤维细胞进行免疫荧光鉴定结果武汉云克隆诊断试剂研究所。

(19)中华人民共和国国家知识产权局(12)发明专利申请(10)申请公布号 (43)申请公布日 (21)申请号 202010680696.2(22)申请日 2020.07.15(71)申请人 四川大学华西医院地址 610041 四川省成都市武侯区国学巷37号(72)发明人 黄方洋　李君丽　田格尔　周骏腾　(74)专利代理机构 成都虹桥专利事务所(普通合伙) 51124代理人 伍云萍(51)Int.Cl.C12N 5/077(2010.01)(54)发明名称高效分离培养乳鼠心肌细胞和心肌成纤维细胞的方法(57)摘要本发明属于细胞分离培养技术领域，具体涉及一种高效分离培养乳鼠心肌细胞和心肌成纤维细胞的方法。

针对现有大/小鼠乳鼠心肌细胞及心肌成纤维细胞分离效率低、活性差、操作条件不易控制的问题，本发明提供了一种方法，包括以下步骤：a、取乳鼠心脏，清洗后转移至含胰蛋白酶的分离液中，剪碎；b、组织块在分离液中消化后，吸走上清，剩余物中加入消化液，消化；c、移液管吹打混匀，静置，转移上部悬浮液，对下部的组织块再加入消化液消化；d、悬浮液混合，离心，弃上清，重悬细胞，孵育，成纤维细胞和心肌细胞。

本方法能够高效分离心肌细胞，得到的心肌细胞活性高，得率高；还能同时获得心肌成纤维细胞，适宜工业化生产。

权利要求书1页 说明书6页 附图2页CN 111876378 A 2020.11.03C N 111876378A1.高效分离培养乳鼠心肌细胞及心肌成纤维细胞的方法，其特征在于，包括以下步骤：a、取乳鼠心脏，置于含Blebbistatin的PBS溶液中清洗后，转移至含胰蛋白酶的分离液中，剪碎心脏成小的组织块；b、将步骤a所述组织块在10～15ml分离液中消化，2～8℃消化4～12小时后，吸走上清，剩余物中加入消化液，在37℃下消化20～30min；c、步骤b消化完成后，采用移液管吹打混匀，静置，转移上部悬浮液，对静置后下部的组织块再加入消化液，在37℃下消化20～30min，直至无肉眼可见组织块；d、将步骤c消化后得到的悬浮液混合，离心，弃上清，采用铺板培养基重悬细胞，孵育30～60min，成纤维细胞铺于相应孔板中，上清中的细胞即为心肌细胞。

小鼠心脏成纤维细胞说明书
1、组织来源：小鼠乳鼠
2、产品规格：25cm2培养瓶
3、细胞简介：
小鼠心脏成纤维细胞分离自正常大鼠心脏组织，细胞呈梭型、多边形等不规则形状。

体外培养的小鼠心脏成纤维细胞对于研究其生理功能、药物作用以及各种致病因素作用下的病理生理改变具重要意义。

本公司生产的小鼠心脏成纤维细胞采用酶解法制备而来，细胞总量约为1×106个/瓶，细胞纯度可达85%以上，且不含有HIV-1、 HBV、HCV、支原体、细菌、酵母和真菌等。

二、使用方法
客户收到细胞后，请按照以下方法进行操作。

1、取出25cm2培养瓶，75%酒精消毒，拆下封口膜，放入37℃，5%CO2细胞培养箱中静置6-8小时或者过夜，以稳定细胞状态；
2、待细胞达到80%汇合时准备进行传代培养；
3、细胞传代
（1）吸出25cm2培养瓶中的培养基,用PBS清洗细胞一次；
（2）添加0.25%胰蛋白酶消化液约1ml至培养瓶中，37℃温浴1-2min左右；倒置显微镜下观察，待细胞回缩变圆后吸弃消化液，再加入完全培养液终止消化；
（3）用吸管轻轻吹打混匀，按1:2或1:3等适当的比例进行接种传代，然后补充新鲜的完全培养基至5ml，放入37℃，5%CO2细胞培养箱中培养；
（4）待细胞完全贴壁后，培养观察。

之后每隔2-3天更换新鲜的完全培养基。

（备注：由于实验所用试剂与操作环境的不同，以上方法供各实验室参考。

）
三、注意事项
1、培养基于4℃条件下可保存3-6个月；
2、在细胞培养过程中，请注意保持无菌操作；
3、传代培养过程中，胰酶消化时间不宜过长，否则会影响细胞贴壁及其生长状态；
4、该细胞只可用于科研。

提取小鼠心纤维细胞的原理提取小鼠心纤维细胞的原理其实就像做一道复杂的菜，得先把材料准备好，然后再慢慢炖煮。

首先呢，我们得知道，心纤维细胞可不是普通的细胞，它们在心脏的结构和功能中扮演着超级重要的角色，简直就是心脏的“建筑工”。

想象一下，要是没有它们，心脏就像一栋没了支柱的房子，随时可能垮掉。

所以，要提取这些细胞，得有点“武功”。

我们需要从小鼠的心脏取出组织。

哎呀，这可不是简单的任务，像是给心脏做个“大手术”，要小心翼翼，生怕伤到别的地方。

就得用一些特制的酶来处理这些组织了。

好比是用刀切菜，酶就像一把利器，可以把细胞从组织中“解救”出来。

然后，再用离心的方法把细胞和其他杂质分开，嘿，听起来简单，但其实得把握好时间和速度，不然细胞就可能受损。

提取完了，我们得把这些细胞放进培养基里，就像给它们准备一个舒适的“家”。

在这个“家”里，细胞们可以悠闲地生活、分裂，简直就像是在度假。

心纤维细胞在实验室里的表现可是很有趣的哦。

它们就像小朋友一样，对环境变化特别敏感。

温度、营养成分，甚至是光线的变化，都能让它们表现出不同的“情绪”。

实验人员还得细心观察它们的状态，确保它们能够健康成长，真是个细致活儿啊。

万一出现什么问题，就得赶紧调整条件，就像照顾小孩一样，得随时准备好应对各种情况。

不过，提取这些细胞的过程并不是一帆风顺的，有时候也会遇到一些麻烦。

比如说，有些细胞特别顽固，提取的时候总是不肯乖乖出来，像是调皮的小猫。

不过，经过一些尝试和调整，通常都能找到解决办法。

这就像生活一样，总会遇到挫折，但只要坚持，总能找到出路。

提取小鼠心纤维细胞还有一个重要的步骤，那就是鉴定。

嘿，细胞们可不能随便进门，得经过严格的筛选，确认它们的身份。

这个过程有点像面试，只有合格的“候选人”才能留下来。

在这个过程中，研究人员需要用一些技术手段，比如流式细胞术，来帮助他们判断细胞的特性。

成功留下来的细胞，就能进入后续的实验阶段。

大家可能会想，这些细胞提取出来有什么用呢？心纤维细胞在心脏疾病的研究中起着关键作用。

小鼠胚胎成纤维细胞的分离和培养一、实验材料1.主要仪器设备(1)倒置显微镜（Olympus，Japan）(2)CO2培养箱（BB16HF，上海力申科学仪器有限公司）(3)100ml的玻璃培养瓶（江苏海门市大路塑料实验仪器厂）(4)6孔培养板（COSTAR，每孔直径为3.5cm）(5)Eppendroff管(6)1ml,2ml,5ml的玻璃滴管各30支；10ml尖底离心管和直径为8cm的平皿(7)离心机(8)5ml冻存管(9)两套小鼠用解剖器械（包括眼科剪和眼科镊）2.主要试剂配制(1)MEF(mouse embryo fibroblast，小鼠胚胎成纤维细胞)培养液——低糖DMEM母液1)用一个1000ml的大烧杯加入1000ml无菌无内毒素的超纯水（购自福州新北生化工业有限公司）；2)将一小袋低糖DMEM(GIBCO/BRL,Cat.No.31600-034)全部加入上述水中，同时轻轻搅拌，并冲洗包装袋的内面以洗下所有的粉未。

3)每升培养基中添加3.7gNaHCO3。

4)搅拌直至完全溶解。

5)用1NHCl或1NNaOH调培养基的pH至比最终的工作液的PH低0.2-0.3，调好PH后，将容器密封（在该实验中用1NHCl调PH至7.3）。

6)立即用0.22um的滤器过滤除菌，装入高压过的盐水瓶中, 4℃保存(1个月内用完)。

——MEF培养液取100ml上述配好的低糖DMEM液体，加入10000IU青霉素钠（6.25mg）和10mg链霉素，溶解后再次调节PH至7.3，经0.22um的滤器过滤至高压过的血清瓶中，再添加10ml分装好的新生牛血清（Newborn Calf Serum, GIBCO/BRL,需56℃，30min灭活过），4℃保存至使用。

(2)PBS在500ml超纯水中依次溶入NaCl 4.0gKCl 0.1gNa2HPO4.12HO2 1.445gKH2PO40.1g于121℃高压灭菌30min或经0.22um的滤器过滤除菌再分装入100ml洁净灭菌的盐水瓶中，再放入4℃冰箱中保存备用。