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⾎凝、⾎凝抑制试验红细胞凝集试验（HA）与红细胞凝集抑制试验（HI）⼀、实验⽤设备：1、离⼼机 1台*（3000转离⼼红细胞）2、冰箱 1台*（存放抗原）3、振荡器 1台*（振荡96孔V型板）4、抗原新城疫（ND）、减蛋（EDS）、流感（AI）抗原，从正规⼚家进。
5、96孔V型板稀释⾎清清洗后可重复使⽤6、⼋道移液器 1把（5-50微升稀释⾎清）7、吸头和⼋道移液器配套使⽤，清洗后重复使⽤）8、积液槽配制4个单位抗原及盛放⽣理盐⽔加样⽤9、⼀次性采⾎管采⾎⽤10、2毫升注射器采⾎⽤11、红细胞⾮免疫鸡⼼脏采⾎或免疫鸡也可，但需离⼼5次后使⽤。
12、柠檬酸三钠配制3.8％抗凝剂⽤13、重铬酸钾配制清洁液⽤14、硫酸配制清洁液⽤15、吸管 1毫升、10毫升16、吸⽿球和吸管配套使⽤17、针头 9*13（采雏鸡）、9*25（采⼤鸡）18、蒸馏⽔当地买。
清洗96孔V型板、吸头⽤19、10毫升离⼼管离⼼红细胞⽤（塑料制）20、⽣理盐⽔做⾎清稀释液⽤、配制4单位抗原⼆、实验前的准备：1.抗原：从指定⼚家购买稳定浓缩抗原。
2.抗凝剂的配制：⽤天平称量3.8克柠檬酸三钠，溶⼊100ml⽣理盐⽔中，待溶解完全后即可使⽤。
3.1％红细胞悬液：由鸡⼼脏或翅静脉采⾎，放⼊加有抗凝剂的离⼼管内（按抗凝剂：全⾎＝1：2的⽐例），迅速混匀。
在离⼼机中以3000转/分离⼼5分钟，⽤吸管吸去上清液和红细胞上层的⽩细胞薄膜，将沉淀的红细胞加⽣理盐⽔，慢慢混合均匀，再在离⼼机中3000转/分离⼼5分钟，弃去上清液，再加⽣理盐⽔混匀，如此反复离⼼4～5次，最后⼀次离⼼后的红细胞，弃去上清液，即为红细胞泥。
放⼊4℃冰箱中可保存2—3天。
使⽤时⽤1ml 吸管吸取0.1ml红细胞泥，然后加⼊9.9ml的⽣理盐⽔，此即1%红细胞悬液。
现⽤现配。
4.被检⾎清：每只鸡⼼脏或翼下采⾎0.5-1ml,静置或离⼼，待⾎清析出后备⽤。
5.吸管清洁液的配制：使⽤1%的稀硫酸溶液。
禽流感血凝和血凝抑制试验禽流感血凝-血凝抑制试验操作方法及注意事项禽流感血凝和血凝抑制试验可用于血清中抗体水平的监测，也可用于判断未使用疫苗群体的感染状态等。
该试验是目前世界卫生组织和国际动物健康组织进行全球流感监测所普遍采用的方法，而且因其具有经济、快速、可靠、操作简便、能够处理大量的样品，并能在短时间内报告禽流感抗体水平等优点，已经成为当前基层兽医实验室禽流感疫病监测和免疫抗体检测中最为常用的方法。
但因该试验受人为操作影响较大，经常因操作不规范、不严谨等造成结果偏差大、重复性差等问题，现根据几年来的工作经验对该试验过程中应注意的事项做一探讨。
一、血凝试验操作程序1、取96孔90°V形酶标板，用微量移液器在第一至第五排的1~12孔每孔加25 μL PBS液。
2、吸取25 μL标准禽流感抗原加入到第一排第1孔中充分混匀。
3、从第1孔吸取25 μL混匀后的抗原液加到第2孔中，混匀后吸取25μL加入到第3孔中，依次进行倍比稀释至第二排最后一孔即第24孔，最后弃去25 μL。
第三排孔至第四排孔同上操作。
4、依次向第一至第五排孔的每孔中加入25 μL 1%的鸡红细胞悬液。
5、将酶标板置于微量振荡器上振荡10秒，室温（20-25℃）静置30 min观察结果（如果环境温度太高，可置4℃环境下）。
6、结果判定：将板作45°倾斜，观察红细胞是否呈泪滴状流淌。
以完全凝集（不流淌）的抗原或病毒最高稀释倍数为1个血凝单位（HAU）二、血凝抑制试验操作程序1、根据血凝试验结果配制4HAU抗原。
（即1HAU抗原除以4）2、取96孔V形酶标板，用移液器在第1~12孔各加入25 μL PBS。
3、在第1孔加入25 μL被检血清，充分混匀后移出25 μL加至第2孔，依次类推，倍比稀释至第12孔，弃去25 μL。
4、按以上步骤加入阳性血清和阴性血清（各做两份），作对照孔。
5、在第1~12孔各加入25 μL 4单位抗原，置于微量振荡器上轻轻混匀，室温20-25℃下静置30 min。
实验三血凝和血凝抑制实验一、实验目的与要求掌握血凝和血凝抑制实验操作及应用二、实验内容H5亚型猪流感抗体检测与分析三、实验步骤（一）血凝（HA）试验1、用微量移液枪在微量反应板的第一排1-12孔均加入50μLPBS，换枪头；2、吸取50μL抗原，加入第一孔，反复吹打5次混匀；3、从第一孔吸取50μL加入第二孔，吹打混匀吸取50μL加入第三孔，如此稀释至第11孔，从第11孔吸取50μL丢弃，第12孔作为红细胞对照；4、各孔均加入50μL0.5%鸡红细胞悬液（已充分摇匀）；5、轻轻混匀，室温25℃静置20min观察结果；（二）血凝抑制（HI）试验1、血清样品处理：先加150μL胰酶溶液于300μL血清中，56℃水浴灭活30min 后冷却至室温；加900μL高碘酸钾，混合，室温孵育15min；加900μL丙三醇盐溶液，混合，室温孵育15min；加750μL生理盐水混合，4℃保存；2、根据HA试验中测定的HI抗原效价配制4单位抗原；3、在微量反应板第5-8排的2-11孔加入25μLPBS，第12孔加入50μLPBS；4、吸取50μL血清（编号为2-4血清、阳性血清、编号为1-4血清、阴性血清）加入第1孔，混匀后吸取25μL于第二孔，混匀后吸25μL于第三孔，依次稀释至第11孔，第11孔混匀后弃去25μL；5、各排前11孔均加入4单位抗原25μL，第12孔作为红细胞对照，室温下25℃静置30min；6、各孔均加入50μL0.5%的鸡红细胞悬液混匀，轻轻摇匀，室温下25℃静置30min。
四、实验结果及分析血凝（HA）试验，从第三个孔开始显示“滴泪”第一排为阳性对照第二排为阴性对照第三排，血清5-6第四排，血清6-6参考文献[1]GB/T 27535-2011，猪流感HI抗体检测方法[S].。
泰安市山农大药业有限公司血凝和血凝抑制试验随着养殖业的飞速发展和广大养殖户科学意识的不断提高，人们普遍认识到实验室检测技术在临床应用的重要性。
下面简单介绍一下鸡新城疫微量血凝试验和血凝抑制试验的注意事项及操作方法。
应用：用于新城疫、产蛋下降综合征和传梁性支气管炎等的母源抗体的检测、雏鸡首免日龄的确定、疫苗免疫后的免疫应答的监测、临床鸡病的鉴别诊断等。
下面以新城疫病毒为例，介绍血凝和血凝抑制试验的方法：注意事项：一、样本要具有代表性：所采样本要能代表整体，通常采用四角加中间的随机取样法，并且确定适当的样品数量，一般1000只以下的鸡群采样率在2～5%；5000只以下1～2%；5000只以上0.5～1%。
对产蛋期间的鸡群可采鸡蛋；对雏鸡或青年鸡，可采血。
方法是：取青霉素小瓶，洗净后用蒸馏水冲洗、控干水分，并注意不要用消毒剂，以免影响结果。
每只鸡采血量在1ml左右，最好不低于1ml，在室温下静置至血清自然析出。
二、四单位抗原的准确性：要获得准确的监测效果，先做红血球的凝集试验，即测得抗原的血凝价，尔后前移2孔作为四单位抗原的稀释度。
三、红血球洗脱的充分性：原则上，新城疫检测所用的红血球应来源于非疫苗免疫过的健康公鸡，但实际上却多采用免疫过疫苗的健康公鸡，有时甚至是病鸡。
因此，对红血球的洗脱的次数要多、要充分，并注意转速和时间，通常采用五次变速离心法：前四次为每分钟1500转，每次5分钟，最后一次为每分钟3000转，持续7～8分钟。
另外，洗红血球过程中，应注意动作要轻，玻璃仪器之间尽量减少碰撞，以免造成红血球破裂而影响结果。
四、结果判定的及时性：检测中，每次试验均应设抗原与生理盐水对照，加入红血球后，每隔5分钟观察一次，一旦两列对照孔图像清晰地显示出来时，应立即对样本进行结果判定，过早过晚都会影响判定结果的准确性。
血凝与血凝抑制试验的操作方法一、材料与仪器：新城疫抗原、1%鸡红血球、抗凝剂、生理盐水、被检血清、离心机、吸管、滴管、洗耳球、烧杯、量筒、注射器、长针头、96孔V型医用血凝板、微量移液器、微量振荡器、恒温培养箱、冰箱等。
微量血凝及血凝抑制试验在实际操作中关键点解析作者：张瑜张庆霞吴娟来源：《兽医导刊》 2016年第4期张瑜张庆霞/ 北京信得威特科技有限公司吴娟/ 北京市通州区农业局在兽医免疫学实验中，血凝试验（HA）主要用来测定抗原的血凝价以及是否存在血凝性抗原，血凝抑制试验（HI）则作为一种抗体监测技术，广泛应用于兽医实验室监测、兽医门诊、大中型养禽场。
在实际应用中，HA 和HI 试验可用于病毒分离、鉴定、分型，检测抗原抗体、免疫鉴定等等，例如：养禽场常常将禽流感、新城疫、减蛋综合症等疫苗免疫后的抗体水平，作为衡量免疫程序是否合理的依据。
尽管此法操作简便、快速、准确、实用，但在实践中也常常由于某些因素的影响，从而使试验结果不精确，有时甚至无法判定结果。
本文主要对HA 和HI 在实际操作中的关键点进行阐述。
一、材料的准备及仪器校准HA 和HI 试验中用到的枪头、EP 管、采血管、PBS 必须全部高压灭菌。
注射器必须是新开封，PBS 必须在高压之前标定PH=7.2，单枪、排枪必须校准，确定刻度准确。
可重复使用的聚苯乙烯有机玻璃板购买时要注意底角是否为90 度，底面是否光滑，清洁，如果不清洁，清洗后可用棉签蘸酒精把孔底擦干净。
有机玻璃血凝板的好处是可以叠放，在做大批量检测实验时节省空间。
如使用一次性凝集板，要求试验前检查凝集板，剔除有漏洞、形状不规则、板面有褶皱、有接口、板面和板孔不干净、不光滑的凝集板。
微量移液器型号的选择、吸嘴的安装不当以及取样时吸嘴外壁是否粘有液体，都会造成移液不准，最终影响试验结果。
微量震荡器使用时应注意震动不宜过大，时间不能太长，一般震动10 秒钟即可。
多块板同时振动时要注意压住上板，以防液体溅出而影响结果。
二、缓冲体系的配置所用pH7.2、0.01 mol/L PBS缓冲液尽量现用现配，以免因PBS 缓冲液配制时间过长、pH 值发生变化，使检测结果不准确。
一般情况下PBS 配好后不需调节PH值，配好后高压灭菌，冷藏保存备用。
禽流感血凝、血凝抑制试验（微量法）操作表
(GB/T 18936-2003)
一、血凝(HA)试验表（一）
1、红细胞100%凝集的抗原最高稀释度为血凝价。
4抗原验证实验表（二）
2、#为100%凝集，++为不完全凝集，—为不凝集。
3、上表例抗原血凝为512×。
二、血凝抑制（HI）试验
1、4×单位抗原配制及验证。
血凝价数除以4，如表一
256÷4=64，即1毫升（抗原）+63毫升（PBS）即
成。
配制好后和每天应用前都必须对4×单位抗原进行
测试验证，操作按表二进行。
其1×单位抗原孔的红血
球必须达到100%凝集，同时0.5×孔红血球达到50%
凝集，50%下沉孔底才符合要求，否则重新调配。
2、血凝抑制（HI）试验
1、100%抑制红血球凝集的血清最大稀释度为血凝抑制价
2、表（三）的血凝抑制价为128×。
3、判定标准：AI血凝抑制价小于或等于8×（3㏒2）判为阴性；等于16×（4㏒2）为可疑，需复检；大于或
等于32×（5㏒2）为阳性。
NDV的血凝及血凝抑制试验（微量法）
目的要求熟练掌握病毒的血凝及血凝抑制试验（微量法）的操作方法及结果判定，明确其应用价值。
仪器及材料pH7.2生理盐水、1％鸡红细胞悬液、NDV、新城疫病毒待检血清、微量血凝板（96孔V型板）、微量移液器（带吸头）、微型振荡器、温箱、离心机、天平、注射器。
方法与步骤
（一）病毒的血凝（HA）试验
1．1％鸡红细胞悬液的制备
（1）采血先在注射器中吸入抗凝剂（3.8％枸橼酸钠液）1ml，采成年健康鸡血，心脏或静脉采血3-4ml。
（2）离心洗涤共3次，每次2000r/min，5min，每次离心后弃去上清液和白细胞，仅留纯的红细胞，最后读出红细胞的体积。
（3）配制用生理盐水将纯的红细胞稀释成体积比为1%的红细胞悬液。
2．操作术式
振荡1min，室温(18℃～20℃)下作用30～40min,或置37℃恒温培养箱中作用15～30min观察结果
（1）加生理盐水 1-12孔，每孔中分别加入50μl。
（2）NDV病毒液倍比稀释换吸头，吸取50μl病毒液，加于第1孔的生理盐水中，并用移液器吹打3～5次使液体混和均匀，然后取50μl移入第2孔，混匀后取50μl移入第3孔，依次倍比稀释到第11孔，第11孔中液体混匀后从中吸出50μl弃去。
第12孔不加病毒抗原，作盐水对照。
（3）加1%红细胞悬液换吸头，1-12孔，每孔中分别加入50μl。
加样完毕，振荡1min，室温（18～20℃）下作用30～40min，或37℃恒温箱中作用15～30min，观察并判定结果。
3．结果判定及记录
完全凝集（＋）：红细胞呈伞状分布于反应孔底层。
伞
完全不凝集（－）：红细胞呈点状沉淀于反应孔底层。
点
不完全凝集（±）：介于＋与－之间。
病毒的血凝价（或称血凝滴度）：能使一定量红细胞发生完全凝集的病毒最大稀释倍数为该病毒的血凝滴度，或称血凝价。
（二）病毒的血凝抑制（HI）试验
采用同样的血凝板，每排孔可测1份血清样品。
1．配制4单位病毒根据病毒的血凝价，用生理盐水配制4单位病毒。
4单位病毒的稀释倍数＝病毒的血凝滴度/4。
如病毒的血凝价为128（27），则4单位病毒的稀释倍数为32倍（25）。
2．制备被检血清静脉或心脏采血，不加抗凝剂，待血液完全凝固后自然析出血清或离心获得血清。
3．操作术式
表2 病毒血凝抑制试验操作术式单位:μl
孔号 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12
生理盐水
待检血清
待检血清稀释倍数
4单位病毒50 50 50 50 50 50 50 50 50 50 50 100
50 50 50 50 50 50 50 50 50 50 －－
弃50
21 2 2 23 24 25 26 27 28 29 210病毒盐水
对照对照50 50 50 50 50 50 50 50 50 50 50 －
1%鸡R B C悬液50 50 50 50 50 50 50 50 50 50 50 50
结果举例－－－－－－±±＋＋＋－（1）加生理盐水 1-12孔，每孔中分别加入50μl。
（2）被检血清倍比稀释换吸头，取待检血清50μl置于第１孔的生理盐水中，吹打3～5次混匀，吸出50μl放入第2孔中，然后依次倍比稀释至第10孔，并将第10孔的液体混匀后取50μl弃去。
第11孔为病毒对照，第12孔为盐水对照。
（3）加4单位病毒换吸头，用微量移液器吸取稀释好的4单位病毒，向1～11
孔中分别加50μl。
振荡1min，将反应板置室温下作用20min，或在37℃恒温培养箱中作用5～10min。
（4）加1%红细胞悬液换吸头，1-12孔，每孔中分别加入50μl。
振荡1min，将反应板置37℃温箱中作用15～30min取出，观察并记录结果。
4．结果判断和记录
完全凝集（＋）：红细胞呈伞状分布于反应孔底层。
伞
完全不凝集（－）：红细胞呈点状沉淀于反应孔底层。
点
不完全凝集（±）：介于＋与－之间。
血清的血凝抑制效价（血凝抑制滴度）：能使4单位病毒凝集红细胞的能力受到完全抑制的血清最大稀释倍数叫该血清的血凝抑制滴度或血清的血凝抑制效价。
血清的血凝抑制滴度即血清中的抗体水平。
思考题 1．病毒凝集红细胞是不是一种特异的抗原抗体反应？为什么？
2．HI是不是一种特异的抗原抗体反应？为什么？
附：离心机的使用
1．平稳放置。
2．配平：用天平配平。
离心管、套管和液体内容物为一整体进行配平；离心管中液体总量不能超过总体积的3/4。
3．平衡放入离心机的离心孔中：正确放置时离心机转动平稳、噪音低。
4．离心：先加盖后启动；变速，按档位升高或降低。
5．取出条件：停转。
6．异常情况处理：如遇异常声音，立即停机检查。
