一株产灵菌红素粘质沙雷氏菌株培养条件探索
- 格式：doc
- 大小：25.50 KB
- 文档页数：3
一株产灵菌红素粘质沙雷氏菌株培养条件探索
灵菌红素（prodigiosins，PG）是一类天然红色素的总称，通常都有3个吡咯环组成的甲氧基吡咯骨架结构，是由多种放线菌、沙雷氏菌、链霉菌属、假单胞菌属等产生的次级代谢产物[1]。
根据其侧链基团结构的不同，可分为灵菌红素、间环丙菌素、十一烷基灵菌红素、壬烷基灵菌红素和环丙烷灵菌红素等系列结构类似物（图1）。
灵菌红素呈暗红色，绿色反光，熔点151～152℃，属于脂溶性色素，易溶于甲醇、丙酮、氯仿、苯、DMF和DMSO，几乎不溶于水[2]。
灵菌红素对光不稳定，需要避光保存[2]。
灵菌红素受pH 值的影响较大，在酸性环境中能保存较长的时间，在碱性条件下则不稳定。
近年来研究显示PG具有抗细菌、抗真菌、抗疟疾、免疫抑制和抗肿瘤等多种活性。
一、材料与仪器
1.菌种
本实验室自有产灵菌红素的S. Marcescens y2菌株（y2+），经筛选纯化获得不产色素突变菌株（y2-），以y2-菌株作为对照，减少色素对菌体本身的作用，来检测外界环境因子对粘质沙雷氏菌生长繁殖的影响。
2.培养基
前期研究发现，分别采用LB培养基、马铃薯葡萄糖琼脂培养基PDA及SN 培养基（蔗糖20g/L、牛肉膏18g/L、CaCl21.1g/L）培养S. Marcescens y2菌株，28℃、200rpm条件下SN培养基可以获得较高产量的灵菌红素，且菌量较多。
3.试剂与仪器
722可见光分光光度计（上海精密科学仪器有限公司），Varian cary 100型紫外可见分光光度计（Agilent Technologies），TGL 16G台式低温高速离心机（上海医用分析仪器厂），Thermo MK3酶标仪。
二、实验方法
1.细菌培养
从平板上挑取单菌落至30mlSN液体培养基中，28℃、200rpm振荡培养至OD600=0.1，再分别以100μl新鲜菌液接种到30mlSN液体培养基中28℃、200rpm 振荡培养48h，用以观察鉴定。
2.细菌生长量及灵菌红素产量测定
将菌液稀释十倍后取200μl至96孔板中，用酶标仪在630nm波长下检测吸
光值OD630nm来表示菌的生长量。
分别取1ml菌液至1.5mlEP管中，8000rpm、10min离心取上清，用pH=2.5的酸性甲醇溶液稀释2倍后，用紫外可见光光度计扫描检测，在535nm波长下有最大吸收峰，以OD535nm表征胞外色素产量；将沉淀用1ml、pH=2.5的酸性甲醇溶液振荡混匀，放置30min，提取胞内色素，适当稀释后，检测方法同胞外色素，以535nm处吸收峰峰值表征胞内色素产量。
三、结果与分析
1.生长曲线测定
28℃、200rpm振荡培养y2+、y2-，分别在0、2、4、8、12、24、30、36、48、60、72、96取新鲜菌液200μl至96孔板，设置3个重复，酶标仪检测OD630nm，获得生长曲线如下图Fig.1所示。
结果显示y2+菌株比y2-提前进入指数生长期，但都在36h时进入稳定期，可见产色素菌株为次级代谢产物灵菌红素的生产而适当延长指数生长期，灵菌红素代谢过程可能与细菌生长周期相关蛋白的调控相关。
2.灵菌红素光谱扫描鉴定
光谱扫描图清晰显示，在pH2.5的甲醇溶液中，灵菌红素在535nm处有最大吸收峰。
四、讨论
色素的产生是微生物在长期进化过程中为了适应环境的改变而形成的代谢产物，与其产生菌的生存能力及对环境的适应能力有着很重要的作用和意义。
近些年的研究发现，灵菌红素是部分放线菌、粘质沙雷氏菌、弧菌及假单胞菌等细菌的次级代谢产物，具有抗细菌、抗真菌、抗疟疾、抗肿瘤及免疫抑制能多种生物活性，对多种抗肿瘤药、抗菌药、免疫抑制剂的开发都用着较高的应用前景。
但是灵菌红素对其产生菌本身的作用研究甚少，研究二者的相互关系对灵菌红素的生产及应用都有着重要的意义。
本研究以筛选得到不产色素的突变菌株y2-作为细菌生长情况的对照，排除色素的干扰作用，通过改变外界环境因素来检测粘质沙雷氏菌y2+菌株的生长量及色素产量，从而揭示粘质沙雷氏菌的生长繁殖和灵菌红素的生产与环境因素之间的相互作用、相互影响。
从天然药物中提取纯化化合物，并筛选出具有抗肿瘤活性的天然产物，或者以天然产物作为先导化合物进行结构修饰，合成其衍生物看是否具有抗肿瘤活性，进而开发出临床有效的抗肿瘤药物，一直是抗肿瘤药物研究领域追求的目标之一。
由于灵菌红素的“细胞毒性”目前作为免疫抑制药物仍然受到限制。
但以灵菌红素化合物作为基本骨架结构，寻找免疫抑制活性强、毒副作用低的衍生物有较好的前景因而备受关注。
目前灵菌红素通常是以沙雷菌为生产菌株，通过发酵制备并提纯其代谢产物而获得。
由于制备过程的原因，难以大量生产，影响对其的进一步研究。
参考文献
[1]王飞，罗海澜，刘畅，王建国，李林珂，等. 一株粘质沙雷氏菌的分离和产红色素初步研究. 食品工业，2011，174：53-55.
[2]王飞，罗海澜，周银芳，李囡囡，刘素，等. 不同光照、氮源对Serratia marcescens y2生長及色素产量的影响. 食品科学，2012，33：234-240.。
