给学生粘质沙雷氏菌脂多糖的提取

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粘质沙雷氏菌脂多糖的提取

一、实验目的

1、了解脂多糖(LPS)的生理生化作用及其制品的应用;

2、掌握从粘质沙雷氏菌中提取LPS的主要方法。

3、掌握真空冷冻干燥机的使用方法。

二、实验原理

(一)菌种

粘质沙雷氏菌(Serratia marcescens)曾称灵杆菌,它属于真细菌纲,真细菌目,肠杆菌科,沙雷氏菌属。

它是细菌中最小者,细胞杆状或球状,单个存在或排列成短链,能运动,有4条或更多鞭毛,周身鞭毛,无荚膜,无芽孢。革兰氏染色呈阴性。

粘质沙雷氏菌为腐生菌,在自然界中分布很广,分布于土壤、水和食品中,也存在于人的呼吸道、肠道和粪便中。所以该菌可自土壤、水、人和动物的粪便中分离得到。

该菌属长期以来认为对人体无害,但近来发现粘质沙雷氏菌是条件致病菌,可引起肺炎、泌尿道感染、呼吸道感染、败血症以及外科术后创伤感染,是医源性感染的重要条件致病菌。

约半数菌株能产生红色的灵菌素,多次传代后产生色素的能力减弱,甚至消失。

(二)灵菌素

灵菌素是由粘质沙雷氏菌菌体中提取的脂多糖。

LPS一方面可视为革兰氏阴性菌的致病因子,因而在革兰氏阴性菌感染的发病机理中起着十分重要的作用,另一方面LPS对机体亦可表现出显著的有益作用:能激活脑下垂体——肾上腺皮质系统,调整机体内部环境与功能,增强机体对外界环境变化的适应能力,刺激机体产生抗体,使白细胞总数增加,吞噬功能加强,激活机体防御系统,抗御病原微生物及病毒的侵袭。同时它还具有抗菌抑癌,提高免疫力等生理活性功能。

(三)LPS的提取方法

目前从粘质沙雷氏菌中提取脂多糖的方法有很多,主要有三氯乙酸-乙醇冷提法、盐析法、热水提取法和热酚水法。

先用三氯乙酸、稀醋酸或酚将其提出,再纯化。

三、仪器和药品

1、仪器与器皿

离心机、天平、恒温培养箱、摇床、水浴锅、冻干机、湿热灭菌锅。三角瓶(50 ml、250 ml)、离心管、玻璃棒、烧杯、可调式移液器(1000-1000 μl、1-5 ml)、可调式移液器枪头。

广泛pH试纸、塑料布、透析袋。

2、药品

牛肉提取物、蛋白胨、NaCl、琼脂、蒸馏水、生理盐水、苯酚、无水乙醇、NaHCO3、EDTA。

四、实验步骤

1、菌种培养

(1)斜面培养基培养

将营养肉汁琼脂培养基[(g/L):(蛋白胨10.0,牛肉提取物3.0,NaCl 5.0,琼脂15.0,pH 值7.0左右)]制作成斜面培养基,将菌种接种在斜面培养基上,28 ℃恒温培养24~48

h。 (2)发酵培养基培养

制作营养肉汁培养基分装于三角瓶中,28 ℃恒温160~170 r/min摇床培养24~48 h。

2、热酚水法提取灵菌素

(1)将深层发酵后获得的菌体以10,000 r/min离心8 min,收集菌体。(先称量一下离心管的质量)

(2)将菌体悬浮于蒸馏水中(每1g细菌加3ml蒸馏水进行悬浮),-40 ℃冰箱反复冻融2~3次效果比较好。

(3)再加热至60 ℃,在热细胞悬浮液中加入等体积预热至50 ℃的90 %(w/w)苯酚溶液,于68~72 ℃水浴中搅拌保温30 min后,冷至室温。

(4)4 ℃冰箱中过夜。(准备实验:处理透析袋100 ℃ 煮30 min)///

(5)然后7,000 r/min离心10 min,取水相。

(6)将水相溶液装于透析袋中,流水透析24 h去酚。///

(7)再用蒸馏水透析48 h,每天换水数次。

(8)将透析袋中的液体装入能预先称重的冻干瓶中,-40 ℃冰箱冻成冰后,置于冻干机中冷冻干燥,得脂多糖粗制品。(脂多糖在制成干品前还是后进行除菌由同学选择,并进行相应的操作)。

并做脂多糖抑菌实验的准备工作:找出使用的仪器、试剂及器皿、配制培养基等等,并设计实验操作步骤。)///

3、由学生利用学过的知识设计并进行脂多糖抑菌实验/// 观察结果,写一份实验报告。

五、实验结果

1、根据实验结果计算出LPS的产率。

2、写出LPS的抑菌效果。

六、思考题

1、在细菌悬浮于蒸馏水之后,为什么最好反复冻融2-3次?

2、制备好的LPS如果暂时不用,应该怎样保存?