土壤中产淀粉酶芽孢杆菌淀粉酶活力测定

产淀粉酶芽孢杆菌的分离、纯化并发酵测定淀粉酶活力杨敏仪，罗桂莲，关婷婷，黄真梅，肖维兴，梁妃法注明：蓝色字体是已修改的一、实验目的1、掌握分离鉴定产淀粉酶微生物的方法；2、掌握测定酶活力的方法；3、培养自行设计、实施实验的能力。

二、实验原理1、土壤中含有各种微生物，其中产淀粉酶的枯草芽孢杆菌含量在不同土壤中含量也不同，因此实验前进行预埋工作，能使土壤中产淀粉酶的细菌含量增加。

待实验前取样即可。

2、在只用淀粉充当碳源的选择培养基中，只有能产生淀粉酶利用淀粉的菌体能成为优势菌种。

在淀粉选择培养基中，产淀粉酶的菌种可以得到富集及分离。

3、菌体可经革兰氏染色后在显微镜下被判断出是否为枯草芽孢杆菌。

4、在含有淀粉的鉴别培养基上的平板上，具有产淀粉酶能力的枯草芽孢杆菌，水解淀粉生成小分子糊精和葡萄糖，在淀粉平板上菌落周围出现水解圈，但肉眼不易分辨，滴加碘液，未水解的淀粉呈蓝色，水解圈无色。

三、实验材料1、土壤样品湛师弘志苑后面的花圃，实验前一周在距土壤表层5—8厘米左右处填埋馒头，实验前一天用塑料袋在预埋处取样。

2、培养基淀粉培养基：可溶性淀粉1%，蛋白胨1%，葡萄糖0.5%，氯化钠0.5%，牛肉膏0.5%，琼脂粉2.0%，pH7，配制300ml种子培养基：牛肉膏0.5%，蛋白胨1%，氯化钠0.5%，可溶性淀粉0.5%，琼脂粉2.0%，pH7,配制300ml发酵培养基：玉米粉 2% ，黄豆饼粉1.5 %， CaCl20.02% ， MgSO40.02 %， NaCl 0.25 %， K2HPO4 0.2 %，柠檬酸钠0.5 % ，硫酸氨0.075（溶解后），Na2HPO4 0.2% ，校正pH7.0，发酵培养条件为：温度37℃，装液100ml/250ml，配制200 ml3、试剂草酸铵结晶紫染液，95%乙醇，番红水溶液、卢戈氏碘液4、玻璃器皿锥形瓶（250mL）3个，培养皿40个，涂布棒1根，移液管（1mL）10根，试管15根，烧杯（250mL）5个，盖玻片、载玻片若干，5、其他仪器及设备：天平，pH试纸，棉花，牛皮纸，玻璃珠，超净工作台，生化培养箱，电热干燥箱，高压蒸汽灭菌锅，水浴锅，显微镜，接种环等四、实验步骤1、样本采集①在预埋处采取土样用塑料袋装好，不要损坏土壤的内部结构。

微生物综合实验报告土壤中产淀粉酶芽孢杆菌的筛选及淀粉酶活力的测定学院：生命科学学院班级：生物技术121班姓名：学号：一，摘要本次实验选取广大的土壤，使用五点法采样，并制备出土壤悬液。

然后将土壤悬液的上清液分四个梯度稀释，使用平板划线法反复进行分离纯化，得到纯净的菌株。

我们得到菌株后，采用形态学的辨别方法，单染色，芽孢染色，革兰氏染色，淀粉水解实验，温度实验，糖类发酵试验（葡萄糖、木糖、阿拉伯糖、甘露醇），VP试验，MR试验，吲哚试验，柠檬酸盐利用实验，耐盐性试验，硝酸盐还原实验，明胶液化试验，运动性穿刺试验，酪素水解试验，卵黄实验等方法检验，查阅伯杰氏手册后，鉴别其为蜂房芽孢杆菌。

二，材料与方法1 材料1.1 试剂碘原液：碘1lg，碘化钾22g，加水定容至50OmL；单染色：草酸铵结晶紫或石炭酸复红；革兰氏染色：草酸铵结晶紫染色液，卢戈氏碘液，95%乙醇，0.5%沙黄染色液。

芽孢染色：5%孔雀绿染色液，0.5%沙黄染色液。

V.P试验：40%NaOH 溶液，ɑ-奈酚。

吲哚试验：乙醚，吲哚试剂。

硝酸盐试验：甲液（对氨基苯磺酸0.8g+5mol/L醋酸100mL；乙液（α-奈胺0.5g + 5mol/醋酸100mL）；酪素水解：牛奶；酪氨酸水解：L-酪氨酸；淀粉酶活力测定：1% 3,5-二硝基水杨酸试剂。

1.2仪器：无菌培养皿，接种环，土样，三角瓶，烧杯，试管，酒精灯，无菌吸管，载玻片，吸水纸等。

恒温摇床，恒温培养箱，高压蒸汽灭菌箱，超净工作台，水浴箱，磁力搅拌器，涂布器，显微镜，移液管，移液枪。

1.3 培养基筛选及活化培养基淀粉20 g，蛋白胨10 g，NaCl 2.5 g，琼脂10 g，自来水1000 ml, pH 自然。

斜面种子培养基牛肉膏3 g，蛋白胨10 g，NaCl 5 g，琼脂15～20 g，自来水1000 ml，pH 7.2～7.4；摇瓶发酵培养基称取可溶性淀粉2 g，蛋白胨1 g，牛肉膏0．3 g，氯化钠0．5 g溶于100 mL蒸馏水中。

从土壤中分离产淀粉酶的芽孢杆菌实验方案实验方案：从土壤中分离产淀粉酶的芽孢杆菌实验目的：分离产淀粉酶的芽孢杆菌，用于后续淀粉酶相关研究。

实验步骤：1.样品采集：选择含有潜在产淀粉酶的土壤样品，如农田土壤或果园土壤。

2.稀释培养：将采集的土壤样品用无菌PBS缓冲溶液稀释，并进行均匀悬浮。

3.接种装置：将土壤悬浮液均匀涂布在含有淀粉的固体培养基上，使用毛细管或平面接种棒操作，确保样品均匀地接种在培养基上。

4.培养条件：将接种好的培养基培养皿在适宜的培养条件下培养。

适宜的培养条件包括温度、湿度和氧气供应等。

一般来说，菌株生长的适宜温度为30-37摄氏度，湿度为60-70%。

5.纯化分离：通过制备出来的细菌菌落将产酶菌株分离出来。

可以使用毛细管、骨牌、环针等工具，分别挑取单个菌落并将其转移到含有淀粉的培养基上。

6.传代培养：将分离出来的产酶菌株进行传代培养，以确保其菌落的特性稳定。

7.筛选鉴定：通过淀粉酶活性分析等方法，对分离出来的菌株进行筛选鉴定。

一般来说，可采用滴定法或I2-KI法测定淀粉酶活性。

根据颜色变化或者酶活性指标的变化，筛选出淀粉酶产量较高的菌株。

8.鉴定菌株：对产淀粉酶的菌株进行鉴定，确定其属于芽孢杆菌的种属。

可以采用传统的形态学和生理生化特性鉴定方法，如菌落形态观察、革兰染色、氧需气性、形状和运动情况等。

9.鉴定纯化：最后，对鉴定出来的菌株进行纯化培养，以获得纯种淀粉酶产生菌。

实验注意事项：1.采集样品时要避免采集过于含油的土壤，以免对实验造成干扰。

2.在操作过程中要做好防护，戴手套，避免污染样品。

3.在培养过程中注意严格无菌操作，以避免外源菌的污染。

4.在菌株的鉴定过程中，要仔细观察菌株的形态特征，并结合多种鉴定方法综合分析。

5.实验过程中要注意做好记录，包括实验步骤、结果、观察和记录等。

总结：通过上述实验方案，我们可以从土壤中分离出产淀粉酶的芽孢杆菌。

这有助于开展后续淀粉酶相关的研究，包括酶的生物化学性质、作用机制等。

实验名称：土壤中产淀粉酶芽孢杆菌的筛选及其淀粉酶活力的测定摘要：从广大不同区域采集土样通过涂布、画线接种方法进行分离纯化筛选出3株菌种，分别是2号、3号、5号菌株，通过菌落形态观察、染色鉴定以及一序列的生化试验鉴定出2、3号菌种是产淀粉酶的芽孢杆菌，最后通过查阅《伯杰氏细菌学手册》对照种属特征确定2、3号菌可能是环状芽孢杆菌。

关键词：革兰氏阳性、芽孢、产淀粉酶、芽孢杆菌一、材料和方法1材料：1.1土样采集：在广州大学不同的2个区域（广大站、B23楼下花圃）采集2种土样采样时，取距表层5cm深处的土壤，取样用的铲子须经酒精消毒。

将2种土样分别放进无菌防水的塑料袋中，编号，回到实验室分离纯化1.2培养基：1.2.1营养琼脂(%)：蛋白胨1 牛肉膏0.3 氯化钠0.5 琼脂1.5 ～2.0 蒸馏水将除琼脂以外的各成分溶解于蒸馏水内，加入15%氢氧化钠溶液约2mL，校正pH至7.2～7.4。

加入琼脂,加热煮沸，使琼脂溶化。

1.2.2淀粉牛肉膏蛋白胨培养基(%)：可溶性淀0.2 牛肉0.3 蛋白1.0 氯化钠0.5 琼脂1.5～2.0 校正pH至7.2～7.41.2.3发酵培养基(%)：玉米粉 2 黄豆饼粉 1.5 CaCl 0.02 MgSO4 0.02 NaCl 0.25 K2HPO40.2 柠檬酸钠 0.2 硫酸氨0.075(溶解后加) Na2HPO40.2 校正pH值7.01.2.3葡萄糖蛋白胨培养基（V.P试验用）（%）：葡萄糖0.5 蛋白胨0.5 K2HPO4 0.2 校正pH 7.2～7.41.2.4蛋白胨水培养基（吲哚试验用）（%）：蛋白胨1% 氯化钠0.5% 校正pH 7.2～7.41.2.5西蒙氏柠檬酸盐培养基（%）：氯化钠0.5 硫酸镁(MgSO4²7H2O)0.02 磷酸二氢铵0.1 磷酸氢二钾0.1 柠檬酸0.5 琼脂2 溴麝香草酚蓝溶液4 酚红试剂校正pH6.81.2.6配制营养明胶培养基（%）：蛋白胨 0.5、牛肉膏0.3、明胶1.2，调pH 6.8~7.01..2.7耐盐培养基（%）：蛋白胨1 牛肉膏0.3 氯化钠5 琼脂1.5 ～2.0 蒸馏水蛋白胨1 牛肉膏0.3 氯化钠7 琼脂1.5 ～2.0 蒸馏水加入15%氢氧化钠溶液约2mL，校正pH至7.2～7.4。

土壤中产淀粉酶的芽孢杆菌的筛选及淀粉酶活力的测定13级生技426摘要本实验从土壤中分离出能产淀粉酶的芽孢杆菌并对其进行鉴定、保存，实验中涉及菌株的分离纯化、菌株的形态学鉴定和生理生化鉴定，根据伯杰氏细菌学手册鉴定其种属。

实验中通过80℃水浴20min预处理，杀死无芽孢菌体，筛选出芽孢杆菌；再用稀释涂布平板法对芽孢杆菌进行初步筛选；又通过分区划线法对初筛菌株进一步分离纯化；最后用选择性淀粉培养基进行筛选，得到纯培养的产淀粉的芽孢杆菌。

最后并通过耐盐试验、明胶试验、糖发酵试验、VP试验、吲哚试验等多项生理生化实验对筛选出来的菌种进行鉴定。

关键词：淀粉酶芽孢杆菌生化鉴定一、引言芽孢杆菌属(Bacillus)是一类好氧或兼性厌氧，产生抗逆性内生孢子的杆状细菌。

多为腐生菌，主要分布于土壤、动植物体表及水体中。

由于芽孢杆菌属的细菌可以产生多种有用代谢产物，芽孢又是菌体度过不良环境的休眠体。

因此，在工、农业生产上有较高的应用价值。

菌体杆状，直或接近直，0.3 – 2.2X1.2 – 7.0微米。

多数运动，鞭毛典型侧生，形成抗热内生孢子。

在一个孢子囊细胞中，孢子不多于1个。

暴露与空气中时，不妨碍孢子的形成。

革兰氏反应为阳性，仅在生长早期为阳性、阴性。

有机体化能营养，利用多种底物进行严格呼吸代谢，严格发酵代谢或呼吸和发酵二者兼有的代谢。

在呼吸代谢中，最终的电子受体是分子氧，在一些种中可以用硝酸盐代替氧，大多数种产接触酶，严格好养或兼性厌氧。

淀粉酶是一种用途极为广泛的生物催化剂，可应用于面包制造业淀、粉的糖化和液化、纺织品脱浆、造纸、清洁剂工业、化学、临床医学的分析和制药业等。

淀粉酶家族包括α-淀粉酶，β-淀粉酶和葡萄糖淀粉酶。

二、实验目的1．了解微生物分离纯化的原理及微生物分离纯化常用方法和技术；2．掌握从土壤中筛选产淀粉酶菌株的原理及方法；3．掌握微生物的摇瓶培养方法及淀粉酶活力测定的原理及方法；4．培养学生自行设计实验流程、综合分析解决问题及判断实验结果的能力；5．对所学习过的微生物实验方法进行综合技能训练；6．从不同环境土壤样品中筛选出能产淀粉酶的芽孢杆菌，并分析比较各产淀粉酶菌株的产淀粉酶活力及总结各芽孢杆菌在土壤中的分布情况。

土壤中产淀粉酶芽孢杆菌的筛选及其淀粉酶活力的测定FINAL土壤中产淀粉酶芽胞杆菌的筛选及其淀粉酶活力的测定设计性实验方案微生物学实验生命科学学院06生工本文通过稀释平板和分区划线的方法在演艺中心旁的土壤、新运动场附近的足球场和实验室老师用于培养大麦所用的有机肥土壤培养基的土壤样品中分离到能产淀粉酶的芽孢杆菌3株，编号为3、5、7。

通过观察其透明圈并测量计算透明圈直径（H）和菌落直径（D）的比值和采用3，5-二硝基水杨酸显色法（DNS）对发酵培养基发酵培养提取的粗酶液进行酶活力测定的方法对该3株菌株进行鉴定，结果表明酶是生物体内进行生物化学反应的催化剂，在生物体中已发现的酶有2500多种。

由于酶促反应的特异性强，反应条件温和、安全、无毒、环境污染少。

而不同类型的微生物由于自身生长的需要，产生并向胞外分泌能水解大分子蛋白和淀粉的酶类，使不能透过微生物细胞的大分子物质经酶解后形成小分子糖、小队和氨基酸，可为微生物提供碳素和氮素营养。

由于微生物体积小，生长速度快，易于大规模生产，从微生物中制取酶已成为发酵工业中的一个新兴领域。

目前能由工业生产的50多种酶制剂，大部分是由霉菌、细菌、链霉菌和酵母菌产生的。

酶制剂中的蛋白酶、淀粉酶、脂肪酶、果胶酶、纤维素酶、葡萄糖氧化酶，葡萄糖异构酶在食品、洗涤剂、皮革、纺织、造纸、诊断、药用等领域具有广泛的应用价值。

潮lJ值得一提的是，用于H报反应的高温叫A聚合酶Taq酶是从古生菌中的水生栖热菌(7AowM6g坝zifm)中获取的，此酶可耐80—90?高温，而最新的Pfu酶则是从另一类古生菌——激烈火球菌(P)州。

en6／M71删)中获取的。

该酶可耐90?以上的高温，这两种微生物酶的发现，为分子生物学的研究提供了有力的工具。

1、了解微生物分离纯化的原理及微生物分离纯化常用方法和技术；2、掌握从土壤中筛选产淀粉酶菌株的原理及方法；3、掌握微生物的摇瓶培养方法及淀粉酶活力测定的原理及方法；4、培养学生自行设计实验流程、综合分析解决问题及判断实验结果的能力； 5、对所学习过的微生物实验方法进行综合技能训练；6、从不同环境土壤样品中筛选出能产淀粉酶的芽孢杆菌，并分析比较各产淀粉酶菌株的产淀粉酶活力及总结各芽孢杆菌在土壤中的分布情况。

从土壤中分离产淀粉酶的芽孢杆菌实验方案报告实验方案报告：从土壤中分离产淀粉酶的芽孢杆菌一、实验目的：本实验旨在从土壤中分离出产淀粉酶的芽孢杆菌，为进一步研究淀粉酶的性质和应用提供材料基础。

二、实验原理：产淀粉酶的芽孢杆菌主要存在于土壤中，它们具有高效分解淀粉的能力。

本实验通过稀释土壤样品，制备土壤悬浮液，然后采用平板和液体培养基法进行分离纯化。

三、实验步骤：1.土壤样品的采集2.土壤样品制备将土壤样品采样袋中的土壤倒入无菌的研钵中，使用无菌铁锹将土壤表面的杂质去除，然后将土壤样品与等量无菌蒸馏水混合浸泡2小时。

使用无菌玻璃棒搅拌1分钟，然后过滤土壤悬浮液，得到土壤样品的0.1倍稀释液。

3.平板培养基分离将制备好的土壤样品0.1倍稀释液分别取0.1mL均匀涂布在含有淀粉的固体培养基平板上，用无菌的铁锹均匀摊开。

将培养皿倒立放置在培养箱中，以30℃恒温培养。

4.鉴定单菌菌落在培养平板上观察菌落生长情况，挑选形态不同的菌落，并进行分离培养。

将单个菌落挑选到含有淀粉的液体培养基中，用无菌胶头移液管进行吸取和移植。

5.验证淀粉酶活性将挑选分离得到的菌株分别接种在含淀粉的液体培养基中，并进行培养。

通过观察培养基颜色的变化、液体浑浊度的变化以及淀粉浓度的定量检测，判断菌株产淀粉酶的能力。

四、实验结果：根据实验步骤所述，从土壤中成功分离得到了产淀粉酶的芽孢杆菌。

通过观察培养基的颜色变化和液体浑浊度的变化，可以初步判断杆菌产淀粉酶的能力。

五、实验讨论与结论：通过本实验的步骤操作，成功分离出产淀粉酶的芽孢杆菌。

该实验为进一步研究淀粉酶的性质和应用提供了材料基础。

此外，实验中还可以对分离得到的菌株进行基于16SrRNA基因的鉴定，对其进行淀粉酶的基本特性、产酶条件和产酶规律等方面的研究。

这对于我们深入了解淀粉酶功能机制，以及在饲料、食品、生物工程等领域的应用具有重要意义。

六、实验心得：通过本次从土壤中分离产淀粉酶的芽孢杆菌的实验，我学会了土壤样品的制备和分离培养的方法，掌握了菌株的挑选和鉴定技巧，对淀粉酶产生的条件和酶活性的检测有了初步了解。

土壤中产淀粉酶芽孢杆菌的筛选及淀粉酶活力的测定1、试剂材料和器材1、实验材料：河北大学生命科学学院院前的土壤2、仪器设备：高压蒸汽灭菌锅、培养皿、培养基分装器、PH试纸、移液管、吸耳球、玻璃棒、量筒、三角刮、试管、试管架、酒精灯、电子天平、显微镜、三角烧瓶、洗瓶、接种针、接种环、双层瓶、擦镜纸、直尺、记号笔等。

离心机、721分光光度计3、淀粉培养基，牛肉膏蛋白胨培养基二、实验步骤（一）采集土样分别从生科楼楼下获取土样。

用无菌铲子挑起离地表10cm~15cm的土壤约5g，装入无菌培养基。

（二）制备土壤稀释液从培养基取1g土壤放入大锥形瓶中，加无菌水99ml，几颗玻璃珠，充分震荡约10分钟，使土样和水充分混合，使细胞分散。

取1ml上清液至干净无菌试管中，并加入9ml无菌水制成10-3土壤稀释悬液。

同理制成10-4土壤稀释悬液、10-5土壤稀释悬液，10-6并分别标号①、②、③（三）制作平板每种稀释度悬液取3副无菌培养皿, 在各培养皿底部贴上标签①、②、③。

取已熔化的淀粉培养基，倒入无菌培养皿中，冷却，制成平板（无菌操作）。

（四）涂布平板用移液管从土壤稀释液①、②、③中各吸取0.2ml，对号放入已标记的淀粉培养基培养皿上，用灼烧冷却后的无菌的三角玻璃刮涂匀。

每个浓度做个平板，并置于37℃培养箱中培养24h。

24h后，取出不同稀释度的平板，将平板上的菌落接种到液体培养基中。

取0.02mol/l碘液滴加在淀粉平板中菌落周围，观察形成透明圈的结果，并将形成透明圈的菌挑选出来。

（五）划线接种[1]在无菌工作台中将接种环在火焰上烧片刻，挑取分离步骤中长出的菌落，划足够长的折线，然后，将接种再在火焰上烧片刻，再次划线，开头一横与之前的线轨迹接触，而后面的折线轨迹则不再与之前所划接触。

最后，再在火焰上将接种针烧片刻，再次划线，这时的第一横与第二次划的线末接触，而后面的折线则需在空白的地方划。

划线完毕之后就把培养皿放在37 ℃下培养24h，让其长出菌落。