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![α–淀粉酶活力测定[辅导]](https://img.taocdn.com/s1/m/063e7ad19fc3d5bbfd0a79563c1ec5da50e2d602.png)
α–淀粉酶活力测定----目视碘比色法一实验目的1. 了解α–淀粉酶酶活力测定原理。
2．掌握α–淀粉酶酶活力测定的方法步骤。
二、实验原理比色法作为一种定量分析的方法，是以生成有色化合物的显色反应为基础，通过比较或测量有色物质溶液颜色深度来确定待测组分含量的方法。
常用的比色法有两种：目视比色法和光电比色法，两种方法都是以朗伯比尔定律 (A＝kLC)为基础。
酶活力的大小、即酶量的多少用酶活力单位（U）（active unit）表示。
1961年国际生物化学学会酶学委员会提出采用统一的“国际单位”（IU）来表示酶的活力，规定为：在最适条件（25℃）下，每分钟内催化1微摩尔（μmol）底物转化为产物所需的酶量定为一个活力单位，即1IU = 1μmol /min。
这样酶的含量就可用每克酶制剂或每毫升酶制剂含有多少酶活力单位来表示（U/g或U/ml）。
淀粉（紫蓝色，30分子以上）红色糊精（红棕色，7-30分子）无色糊精（7分子以下）、麦芽糖不显色。
通过测定酶促反应分解一定量淀粉的时间，以标准糊精（红色糊精）和碘反应的颜色作为终点指示（所给定的淀粉都已转化为糊精的时间）。
碘比色法酶活力规定：在60℃条件下，1小时转化1g 淀粉变为糊精的酶量定义为1个酶活力单位。
三、实验操作1．取试管1支，加入1ml标准糊精和3ml 标准稀碘液。
2．取锥形瓶一个，加入2%淀粉20ml和Ph6.0的缓冲液5ml。
3．将锥形瓶置于60℃水浴中，保温5分钟。
4．在比色盘中加入比色碘液，每穴2滴。
5．在锥形瓶中加入淀粉酶溶液2 ml，摇匀，开始计时。
6．在反应的前4分钟，每隔1分钟从锥形瓶中取1滴液体，与比色稀碘液混合，而后，每隔30秒从锥形瓶中取1滴液体与稀碘液混合，直至呈色与终点色一致。
四、酶活性计算实验注意事项：（1）测定酶促反应在锥形瓶中进行，标准反应在试管中进行。
（2）比色盘第1号位加入标准糊精和2滴标准碘液。
（3）应时间大约在10-15分钟。
α-淀粉酶amy检测原理麦芽庚糖苷法α-淀粉酶是一种能够分解淀粉为较小的糖分子的酶类。
它是一种广泛存在于生物体中的酶，包括人类、动物和植物。
淀粉是由α-葡聚糖链构成的多糖，而α-淀粉酶能够通过水解反应将淀粉分子切割成糊精（dextrin）和葡萄糖单糖。
麦芽庚糖苷法是一种常用的测定α-淀粉酶活性的方法。
该方法的原理是利用α-淀粉酶将庚糖苷（G7）中的庚糖分子逐个水解成葡萄糖分子，并且测定庚糖苷水解的速率来间接测定α-淀粉酶的活性。
具体的操作步骤如下：首先，准备一定浓度的庚糖苷溶液作为底物。
然后，在一定温度和pH条件下，将α-淀粉酶加入到庚糖苷溶液中，使其开始催化反应。
随着时间的推移，庚糖苷逐渐被水解成葡萄糖，反应体系中葡萄糖的浓度逐渐增加。
最后，通过测定葡萄糖浓度的变化，可以计算出α-淀粉酶的活性。
麦芽庚糖苷法具有以下优点：首先，该方法操作简单，不需要复杂的仪器设备，只需要常见的化学试剂即可。
其次，该方法对α-淀粉酶具有较高的灵敏度和特异性，可以准确地测定α-淀粉酶的活性。
此外，该方法还可以用于测定不同来源的α-淀粉酶的活性差异。
麦芽庚糖苷法在许多领域都有广泛的应用。
首先，在食品工业中，该方法可以用于测定食品中的淀粉含量和淀粉降解的速率，从而评估食品的品质和保存性。
其次，在生物制药工业中，该方法可以用于监测发酵过程中淀粉酶的活性，以确保产品的质量和产量。
此外，该方法还可以用于医学研究中，例如测定血液或尿液中α-淀粉酶的活性，以辅助诊断某些疾病。
α-淀粉酶检测原理麦芽庚糖苷法是一种简单可靠的方法，广泛应用于食品工业、生物制药工业和医学研究等领域。
通过测定庚糖苷的水解速率来间接测定α-淀粉酶的活性，该方法具有操作简单、灵敏度高和特异性强的特点，为相关领域的研究和应用提供了有力的工具。
1.α-淀粉酶抑制剂对PPA 活性的抑制作用
分别取浓度为0.2、0.4、0.6、0.8、1.0 mg/mL 的柚皮素溶液0.05mL
（溶于水）与0.2 mL PPA 溶液（0.33 U/mL，溶于pH 6.8 磷酸盐缓
冲液）混匀在37 ℃水浴反应20 min。
对照组溶液则以0.05 mL水与0.2
mL PPA 溶液进行反应。
在反应液中加入1mL 1 %可溶性淀粉溶液，继
续37 ℃水浴10 min 后，加入1.5 mL DNS 显色剂，混匀，置于沸水
浴中5 min。
然后，冷却至室温，定容至25 mL，540 nm 下测定吸光。
空白是1.25ml水加上1.5mlDNS，定容至25ml，在A540nm下测吸光值根
据下式计算柚皮素对PPA 活性的抑制率：抑制率（%）=[（ΔA 对照-
ΔA 样品）/ΔA 对照]×100%注：ΔA 对照=A 对照-A 对照空白，
ΔA 样品=A 样品-A 样品空白
反应液中加入 1.5mL
1 %可溶性淀粉溶液
继续37 ℃水浴10
min 后，加入 1.5
mlDNS 显色剂，混匀，置于沸水浴中5 min。
然后，冷却至室温，定
容至25 mL，540 nm 下测定吸光。
空白是1.25ml水加上1.5mlDNS，
定容至25ml，在A540nm下测吸光值
一、实验步骤：取试管5个，并分别编号，按下表加入药品
再从标准曲线中查出还原糖的含量，以1/V为纵轴，1/S为横轴做直
角坐标。
α-淀粉酶活力的测定α-淀粉酶活力的测定姓名___学号___ 一、实验目的:1. 掌握α-淀粉酶活力测定的基本原理及其实验方法。
二、实验原理: α-淀粉酶- 是一种内切酶- 只能水解α-1, 4糖苷键- 不能水解α-1,6糖苷键- 不能水解α-1,6糖苷键附近的α-1,4糖苷键- 产物为糊精、低聚糖、麦芽糖和少量葡萄糖α-淀粉酶活力测定的方法1(反应底物: 可溶性淀粉2(反应环境: 60?，pH为6.0，常压。
3(产物: 还原性葡萄糖4(活力测定方法:1)测定还原糖产生速度2)测定淀粉遇碘显色力下降的速度3)测底物粘度下降的进度• 还原糖与黄色的 3,5- 二硝基水杨酸显色反应来测定.• 生成物颜色的深浅与还原糖的量成正比.• 以每克酶在一定时间内生成的还原糖(麦芽糖)量表示酶活大小.三、试剂与仪器:1、仪器(1)电子天平(2)容量瓶 100mL(3)试管(4)恒温水浴锅(5)紫外可见分光光度计(6)烧杯 250 mL2(试剂(1)1% 可溶性淀粉溶液:称取可溶性淀粉(以绝干计)1. 000g(精确至0.001g，用水调成浆状物(在搅动下缓缓倾入70mL沸水中。
然后，以30mL水分几次冲洗装淀粉的烧杯，洗液并入其中，加热至完全透明，冷却，定容至100mL。
此溶液需要当天配制。
(2)0.4mol/L 氢氧化钠: 称取 1.6g 氢氧化钠，溶于少量蒸馏水，定容至100 mL.1(3)磷酸缓冲液(pH6.0): 称取磷酸氢二钠(Na2HPO4?12H2O)45.23g、柠檬酸(C6H8O7?H2O)8.07g，用水溶解并定容至1000mL。
配好后用pH计校正。
(4)3,5- 二硝基水杨酸:精确称取 1g 3,5- 二硝基水杨酸溶于 20mL 1mol/L 氢氧化钠中,加入 50mL 蒸馏水,再加入 30g 酒石酸钾钠,待溶解后用蒸馏水稀释至100mL ,盖紧瓶塞,防止CO2进入.(5)麦芽糖标准液(1mg/ml):称取0.100g麦芽糖,溶于少量蒸馏水,定容至100mL .(6)α-淀粉酶:枯草芽孢杆菌生成，最适pH 5.5-7.5,最适温度 50~70? 四、测定步骤:1. 麦芽糖标准曲线的制作:取25ml刻度试管7支,编号.分别加入麦芽糖标准液(lmg/ml) 0, 0.2, 0.6, 1.0,1.4, 1.8,2.0 ml ,然后用吸管向各管加蒸馏水使溶液达 2.0ml ,再各加 3 , 5 -二硝基水杨酸试剂2.0m1 ,置沸水浴中加热5min .取出冷却,用蒸馏水稀释至25 m1 .混匀后用分光光度计在520 nm 波长下进行比色,记录吸光度.以吸光度为纵坐标,以麦芽糖含量(mg)为横坐标,绘制标准曲线.2. 待测酶液的制备:称取酶粉0.1g，精确至0.0002g，先用少量的磷酸缓冲液溶解，并用玻璃搅拌棒捣研，将上清液小心倾入容量瓶中，沉渣部分再加入少量缓冲液，如此捣研3-4次，最后全部移入容量瓶中，用缓冲液定容至100mL，摇匀。
实验五激活剂、抑制剂、温度及PH 对酶活性的影响
一、目的要求通过实验加深对酶性质的认识，了解测定a-淀粉酶活力的方法。
二、实验原理
酶是生物体内具有催化作用的蛋白质，通常称为生物催化剂。
酶催化的反应称为酶促反应。
生物催化剂催化生化反应时具有：催化效率好、有高度的专一性、反应条件温和、催化活力与辅基，辅酶，金属离子有关等特点。
能提高酶活力的物质，称为激活剂。
激活剂对酶的作用有一定的选择性，其种类多为无机离子和简单的有机化合物。
使酶的活力中心的化学性质发生变化，导致酶的催化作用受抑制或丧失的物质称为酶抑制剂。
氯离子为唾液淀粉酶的激活剂，铜离子为其抑制剂。
应注意的是激活剂和抑制剂不是绝对的，有些物质在低浓度时为某种酶的激活剂，而在高浓度时则为该酶的抑制剂。
如氯化钠达到约30%浓度时可抑制唾液淀粉酶的活性。
酶促反应中，反应速度达到最大值时的温度和PH值称为某种酶作用时的最适温度和PH值。
温度对酶反应的影响是双重的：一方面随着温度的增加，反应速度也增加，直至最大反应速度为止；另一方面随着温度的不断升高，而使酶逐步变性从而使反应速度降低。
同样，反应中某一PH 范围内酶活力可达最高，在最适PH 的两侧活性骤然下降，其变化趋势呈钟形曲线变化。
食品级a - 淀粉酶是一种由微生物发酵生产而制备的微生物酶制剂，主要由枯草芽孢杆菌、
黑曲霉、米曲霉等微生物产生。
但不同菌株产生的酶在耐热性、酶促反应的最适温度、PH、对
淀粉的水解程度，以及产物的性质等均有差异。
a -淀粉酶属水解酶，作为生物催化剂可随机作用于直链淀粉分子内部的a -1,4 糖苷键，迅速地将直链淀粉分子切割为短链的糊精或寡糖，使淀粉的粘度迅速下降，淀粉与碘的反应逐渐消失，这种作用称为液化作用，生产上又称 a -淀
粉酶为液化淀粉酶。
a -淀粉酶不能水解淀粉支链的 a -1,6糖苷键，因此最终水解产物是麦芽
糖、葡萄糖和a -1,6 键的寡糖。
本实验通过淀粉遇碘显蓝色，糊精按其分子量的大小遇碘显紫蓝、紫红、红棕色，较小的糊精（少于6 个葡萄糖单位）遇碘不显色的呈色反应，来追踪a -淀粉酶作用于淀粉基质的水解过程，从而了解酶的性质以及动力学参数。
三、激活剂和抑制剂对唾液淀粉酶活力的影响
（一）试剂及材料
1、1: 30唾液淀粉酶配置用蒸馏水漱口，1min后收集唾液，以1: 30倍蒸馏水稀释。
2、 0.2%可溶性淀粉称取可溶性淀粉0.2g，预加20mL蒸馏水调匀，然后倒入80mL沸水
中，继续煮沸至溶液透明，冷却后补水至100mL。
3、1%NaCI溶液称取1.0 g氯化钠，加水溶解稀释至100mL。
4、1%CuSO4溶液称取1.0 g硫酸铜，加水溶解稀释至100mL。
5、标准稀碘液称取11g碘，22g碘化钾，置研钵中，加入适量的水研磨至碘完全溶解，并加水稀释定容至500mL。
吸取2mL上述碘液，加入10 g碘化钾，用水稀释至500 mL。
（二）仪器设备电热恒温水浴锅。
（三）操作方法
取试管3根，编号后按下表配置实验样液。
用点滴管并不断从试管中吸取样液于比色白瓷板，用稀碘液检验试管内淀粉被淀粉酶水解
的程度，记录各试管内样液遇碘不显蓝色的先后顺序，解释实验现象的原因。
四、温度与PH值对a -液化淀粉酶活力的影响
（一）试剂与材料
1、2%可溶性淀粉溶液称取可溶性淀粉2.0g （预先在105 C烘干），预加20mL蒸馏水调匀,
然后倾入80mL沸水中煮沸至溶液透明，冷却后定容至100mL。
2、PH4.0、5.0、6.0、7.0、8.0磷酸氢二钠-柠檬酸缓冲溶液
（1）0.2 mol /mL Na 2HPO4 称取35.60g Na2HPO4.2H2O，用水溶解定容至100mL。
（2）使用酸度计，用柠檬酸调整至所需的PH值。
3、供试酶液的制备称取固体a -液化淀粉酶1.00g，加入PH6.0磷酸氢二钠-柠檬酸缓
冲溶液100mL （缓冲液的加入量视酶活力大小而定，控制酶解反应在5-10min内完成），于40C
恒温水浴中活化0.5小时，然后用3000rpm / min离心机离心分离5min，酶提取液于冰箱保存，供试验用。
4、标准比色液
甲液：称取氯化钴（C0CL6H20）40.2439g、干燥重铬酸钾0.4748 g,溶解并定容至500mL。
乙液：称取铬黑T 40.00mg，溶解并定容至100mL。
使用时取甲液40.0mL、乙液5.0 mL，混合。
混合比色液宜放置冰箱保存，使用7天后重新
配置。
5、标准稀碘液。
（二）仪器设备电热恒温水浴锅。
（三）操作方法
1、用滴管吸取一定量标准比色液于白色瓷比色板空穴中，作为判断酶解反应终点的标准色。
2、不同温度对a -液化淀粉酶活力的影响
取4根①25 x 200mm试管，按下表配制反应溶液。
加入供试酶液后，立即用秒表或手表记时，充分要匀，定时用点滴管从各反应试管中分别吸取
1-2滴反应液，滴入预先盛有2/3稀碘液的比色白瓷板孔穴内，从淀粉遇碘显色的变化情况,
跟踪淀粉在淀粉酶作用下被水解的过程，当穴内颜色反应由紫色逐渐变为红棕色，与标准比色液的颜色相同时，即达反应终点，记录酶解反应完成所需时间。
3 、不同PH值对a-液化淀粉酶活力的影响
五、结果计算和讨论
淀粉酶活力单位定义为在一定条件下，1 g酶制剂1小时内液化可溶性淀粉的克数
酶活力单位（U/g）= 60 20 0.02— n t 0.5
式中：20――可溶性淀粉的用量（ml）;
t ----------- 酶解反应完成所需的时间（min）；
0.5 ---------- 测定时稀释酶液用量（ml）;
0.02 ――可溶性淀粉溶液的浓度（g/mL）；
n ――酶制剂稀释倍数
分别以值、温度为横坐标，以酶活力单位为纵坐标，绘制值一酶活力单位、温度一酶活力单位图。
讨论分析实验结果。
六、思考题
1、从实验操作技能方面考虑，做好本实验的操作要点是什么？
2、实验过程中若激活剂或抑制剂的作用不明显，如何调整实验方案？
3、进行酶的生化实验必须考虑控制哪些条件？为什么？
4、生化反应用酶前对酶进行活力进行测定，对实验有何实际指导意义？
5、酶在干燥状态下与在水溶液中保存，它的活性受温度的影响是否相同？。
