实验五激活剂、抑制剂、温度及PH 对酶活性的影响
一、目的要求通过实验加深对酶性质的认识，了解测定a-淀粉酶活力的方法。
二、实验原理
酶是生物体内具有催化作用的蛋白质，通常称为生物催化剂。
酶催化的反应称为酶促反应。
生物催化剂催化生化反应时具有：催化效率好、有高度的专一性、反应条件温和、催化活力与辅基，辅酶，金属离子有关等特点。
能提高酶活力的物质，称为激活剂。
激活剂对酶的作用有一定的选择性，其种类多为无机离子和简单的有机化合物。
使酶的活力中心的化学性质发生变化，导致酶的催化作用受抑制或丧失的物质称为酶抑制剂。
氯离子为唾液淀粉酶的激活剂，铜离子为其抑制剂。
应注意的是激活剂和抑制剂不是绝对的，有些物质在低浓度时为某种酶的激活剂，而在高浓度时则为该酶的抑制剂。
如氯化钠达到约30%浓度时可抑制唾液淀粉酶的活性。
酶促反应中，反应速度达到最大值时的温度和PH值称为某种酶作用时的最适温度和PH值。
温度对酶反应的影响是双重的：一方面随着温度的增加，反应速度也增加，直至最大反应速度为止；另一方面随着温度的不断升高，而使酶逐步变性从而使反应速度降低。
同样，反应中某一PH 范围内酶活力可达最高，在最适PH 的两侧活性骤然下降，其变化趋势呈钟形曲线变化。
食品级a - 淀粉酶是一种由微生物发酵生产而制备的微生物酶制剂，主要由枯草芽孢杆菌、
黑曲霉、米曲霉等微生物产生。
但不同菌株产生的酶在耐热性、酶促反应的最适温度、PH、对
淀粉的水解程度，以及产物的性质等均有差异。
a -淀粉酶属水解酶，作为生物催化剂可随机作用于直链淀粉分子内部的a -1,4 糖苷键，迅速地将直链淀粉分子切割为短链的糊精或寡糖，使淀粉的粘度迅速下降，淀粉与碘的反应逐渐消失，这种作用称为液化作用，生产上又称 a -淀
粉酶为液化淀粉酶。
a -淀粉酶不能水解淀粉支链的 a -1,6糖苷键，因此最终水解产物是麦芽
糖、葡萄糖和a -1,6 键的寡糖。
本实验通过淀粉遇碘显蓝色，糊精按其分子量的大小遇碘显紫蓝、紫红、红棕色，较小的糊精（少于6 个葡萄糖单位）遇碘不显色的呈色反应，来追踪a -淀粉酶作用于淀粉基质的水解过程，从而了解酶的性质以及动力学参数。
三、激活剂和抑制剂对唾液淀粉酶活力的影响
（一）试剂及材料
1、1: 30唾液淀粉酶配置用蒸馏水漱口，1min后收集唾液，以1: 30倍蒸馏水稀释。
2、 0.2%可溶性淀粉称取可溶性淀粉0.2g，预加20mL蒸馏水调匀，然后倒入80mL沸水
中，继续煮沸至溶液透明，冷却后补水至100mL。
3、1%NaCI溶液称取1.0 g氯化钠，加水溶解稀释至100mL。
4、1%CuSO4溶液称取1.0 g硫酸铜，加水溶解稀释至100mL。
5、标准稀碘液称取11g碘，22g碘化钾，置研钵中，加入适量的水研磨至碘完全溶解，并加水稀释定容至500mL。
吸取2mL上述碘液，加入10 g碘化钾，用水稀释至500 mL。
（二）仪器设备电热恒温水浴锅。
（三）操作方法
取试管3根，编号后按下表配置实验样液。
用点滴管并不断从试管中吸取样液于比色白瓷板，用稀碘液检验试管内淀粉被淀粉酶水解
的程度，记录各试管内样液遇碘不显蓝色的先后顺序，解释实验现象的原因。
四、温度与PH值对a -液化淀粉酶活力的影响
（一）试剂与材料
1、2%可溶性淀粉溶液称取可溶性淀粉2.0g （预先在105 C烘干），预加20mL蒸馏水调匀,
然后倾入80mL沸水中煮沸至溶液透明，冷却后定容至100mL。
2、PH4.0、5.0、6.0、7.0、8.0磷酸氢二钠-柠檬酸缓冲溶液
（1）0.2 mol /mL Na 2HPO4 称取35.60g Na2HPO4.2H2O，用水溶解定容至100mL。
（2）使用酸度计，用柠檬酸调整至所需的PH值。
3、供试酶液的制备称取固体a -液化淀粉酶1.00g，加入PH6.0磷酸氢二钠-柠檬酸缓
冲溶液100mL （缓冲液的加入量视酶活力大小而定，控制酶解反应在5-10min内完成），于40C
恒温水浴中活化0.5小时，然后用3000rpm / min离心机离心分离5min，酶提取液于冰箱保存，供试验用。
4、标准比色液
甲液：称取氯化钴（C0CL6H20）40.2439g、干燥重铬酸钾0.4748 g,溶解并定容至500mL。
乙液：称取铬黑T 40.00mg，溶解并定容至100mL。
使用时取甲液40.0mL、乙液5.0 mL，混合。
混合比色液宜放置冰箱保存，使用7天后重新
配置。
5、标准稀碘液。
（二）仪器设备电热恒温水浴锅。
（三）操作方法
1、用滴管吸取一定量标准比色液于白色瓷比色板空穴中，作为判断酶解反应终点的标准色。
2、不同温度对a -液化淀粉酶活力的影响
取4根①25 x 200mm试管，按下表配制反应溶液。
加入供试酶液后，立即用秒表或手表记时，充分要匀，定时用点滴管从各反应试管中分别吸取
1-2滴反应液，滴入预先盛有2/3稀碘液的比色白瓷板孔穴内，从淀粉遇碘显色的变化情况,
跟踪淀粉在淀粉酶作用下被水解的过程，当穴内颜色反应由紫色逐渐变为红棕色，与标准比色液的颜色相同时，即达反应终点，记录酶解反应完成所需时间。
3 、不同PH值对a-液化淀粉酶活力的影响
五、结果计算和讨论
淀粉酶活力单位定义为在一定条件下，1 g酶制剂1小时内液化可溶性淀粉的克数
酶活力单位（U/g）= 60 20 0.02— n t 0.5
式中：20――可溶性淀粉的用量（ml）;
t ----------- 酶解反应完成所需的时间（min）；
0.5 ---------- 测定时稀释酶液用量（ml）;
0.02 ――可溶性淀粉溶液的浓度（g/mL）；
n ――酶制剂稀释倍数
分别以值、温度为横坐标，以酶活力单位为纵坐标，绘制值一酶活力单位、温度一酶活力单位图。
讨论分析实验结果。
六、思考题
1、从实验操作技能方面考虑，做好本实验的操作要点是什么？
2、实验过程中若激活剂或抑制剂的作用不明显，如何调整实验方案？
3、进行酶的生化实验必须考虑控制哪些条件？为什么？
4、生化反应用酶前对酶进行活力进行测定，对实验有何实际指导意义？
5、酶在干燥状态下与在水溶液中保存，它的活性受温度的影响是否相同？。
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